Effiziente Vaskularisierung von Nierenorganoiden durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen vor. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen und kann verwendet werden, um diese Prozesse auf effiziente Weise zu untersuchen.

Zusammenfassung

Nierenorganoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, enthalten nephronähnliche Strukturen, die denen in der erwachsenen Niere bis zu einem gewissen Grad ähneln. Leider wird ihre klinische Anwendbarkeit durch das Fehlen eines funktionellen Gefäßsystems und die daraus resultierende eingeschränkte Reifung in vitro erschwert. Die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen induziert die Vaskularisierung durch perfundierte Blutgefäße, einschließlich der Bildung glomerulärer Kapillaren, und fördert deren Reifung. Diese Technik ist sehr effizient und ermöglicht die Transplantation und Analyse einer großen Anzahl von Organoiden. Diese Arbeit beschreibt ein detailliertes Protokoll für die intracelome Transplantation von Nierenorganoiden in Hühnerembryonen, gefolgt von der Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lektin zur Färbung des perfundierten Gefäßsystems und der Entnahme von transplantierten Organoiden für die bildgebende Analyse. Diese Methode kann verwendet werden, um die Organoid-Vaskularisierung und -Reifung zu induzieren und zu untersuchen, um Hinweise zur Verbesserung dieser Prozesse in vitro zu finden und die Krankheitsmodellierung zu verbessern.

Einleitung

Es hat sich gezeigt, dass aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) gewonnenen Nierenorganoiden Potenzial für Entwicklungsstudien 1,2,3,4, Toxizitätsscreening ^5,6 und Krankheitsmodellierung^{5,7,8,9,10,11,12,13} haben. Ihre Anwendbarkeit für diese und spätere klinische Transplantationszwecke ist jedoch durch das Fehlen eines vaskulären Netzwerks eingeschränkt. Während der embryonalen Nierenentwicklung interagieren Podozyten, Mesangialzellen und vaskuläre Endothelzellen (ECs), um die komplizierte Struktur des Glomerulus zu bilden. Ohne diese Wechselwirkung kann sich die glomeruläre Filtrationsbarriere, bestehend aus Podozyten, der glomerulären Basalmembran (GBM) und ECs, nicht richtig entwickeln^14,15,16. Obwohl Nierenorganoide in vitro einige ECs enthalten, bilden diese kein richtiges Gefäßnetzwerk und nehmen mit der Zeit ab¹⁷. Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Organoide unreif bleiben. Die Transplantation in Mäusen induziert eine Vaskularisierung und Reifung der Nierenorganoide 18,19,20,21. Leider ist dies ein arbeitsintensiver Prozess, der für die Analyse einer großen Anzahl von Organoiden ungeeignet ist.

Hühnerembryonen werden seit über einem Jahrhundert verwendet, um die Vaskularisierung und Entwicklung zu untersuchen²². Sie sind leicht zugänglich, wartungsarm, verfügen nicht über ein voll funktionsfähiges Immunsystem und können sich nach dem Öffnen der Eierschale normal entwickeln^23,24,25,26. Es konnte gezeigt werden, dass die Transplantation von Organoiden auf deren chorioallantoische Membran (CAM) zu einer Vaskularisation führt²⁷. Die Dauer der Transplantation auf dem CAM sowie der Reifegrad des Transplantats sind jedoch durch die CAM-Bildung begrenzt, die bis zum 7. Embryonaltag dauert. Daher wurde kürzlich eine Methode entwickelt, um Nierenorganoide durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen effizient zu vaskularisieren und reifen^{zu lassen 28}. Seit den 1930er Jahren ist bekannt, dass die Zölomhöhle von Hühnerembryonen eine günstige Umgebung für die Differenzierung von embryonalem Gewebe^{darstellt 29,30}. Es ist früh in der Embryonalentwicklung zugänglich und ermöglicht eine relativ unbegrenzte Ausdehnung des Transplantats in alle Richtungen.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Tag-4-Hühnerembryonen beschrieben. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen. Die Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lens culinaris Agglutinin (LCA) vor der Opferung der Embryonen ermöglicht die Visualisierung von perfundierten Blutgefäßen in den Organoiden durch konfokale Mikroskopie.

Protokoll

Nach niederländischem Recht war für diese Forschung keine Genehmigung durch den Tierschutzausschuss erforderlich.

1. Vorbereitung von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden für die Transplantation

1. Unterscheidung von hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden unter Verwendung des von Takasato et al.4,18,31 entwickelten Protokolls. Kultivieren Sie die Organoide nach diesem Protokoll auf Polyester-Zellkultureinsätzen mit 0,4 μm Poren (Zellkultureinsätze) bis zum Tag 7 + 12 der Differenzierung. Jeder Zellkultureinsatz enthält drei Organoide.
2. Entfernen Sie die Organoide aus dem Zellkultureinsatz.
   1. Machen Sie mit einer Präparierzange ein Loch in die Mitte der Membran des Zellkultureinsatzes. Machen Sie mit einer Präparierschere drei Schnitte in die Membran vom Loch in der Mitte bis zum Rand des Zellkultureinsatzes und schneiden Sie zwischen den Organoiden. So entstehen drei Membranstücke mit je einem Organoid, die an ihrem äußeren Rand noch mit dem Zellkultureinsatz verbunden sind.
   2. Fassen Sie eines der Membranstücke in der Nähe des äußeren Randes mit einer Pinzette und reißen Sie es vom Zellkultureinsatz ab. Legen Sie das Stück Membran mit dem angehängten Organoid in eine Petrischale. Geben Sie ein paar Tropfen der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco ohne Kalzium und Magnesium (DPBS^-/-) in das Organoid, um eine Austrocknung zu vermeiden. Wiederholen Sie dies für die anderen beiden Organoide.
3. Halbieren Sie die Organoide, indem Sie ihre Membran mit einer Pinzette festhalten und sie mit einer zweischneidigen Rasierklinge aus rostfreiem Stahl in zwei Hälften schneiden (ein ganzes Organoid ist zu groß, als dass das Celom es in diesem Entwicklungsstadium aufnehmen könnte). Drücken Sie die beiden Organoidhälften vorsichtig mit einem Dura-Dissektor von der Membran ab. Die Membran wird verworfen und die Organoide bis zur Transplantation in DPBS-^/- belassen.
   HINWEIS: Bereiten Sie maximal drei Organoide gleichzeitig für die Transplantation vor, um Stress für die Organoide vor der Transplantation zu vermeiden. Im Idealfall bereitet eine Person die Organoide vor, während eine andere die Transplantation durchführt.

2. Vorbereitung von Hühnerembryonen für die Transplantation

1. Befruchtete weiße Leghorn-Eier ausbrüten. Beginnen Sie mit der Inkubation der Eizellen am Tag 7 + 8 der Nierenorganoid-Differenzierung, um den richtigen Zeitpunkt der Transplantation zu gewährleisten.
   1. Legen Sie die befruchteten weißen Leghorn-Eier (Gallus domesticus) waagerecht auf einen Halter (Abbildung 1A; Tag 0), markieren Sie mit einem Bleistift die Mitte der nach oben gerichteten Seite.
      Anmerkungen: Als Halter für die Bebrütung der Eier können entweder maßgefertigte Kunststoffhalter oder Eierkartons verwendet werden.
   2. Stellen Sie den Halter mit den Eiern in einen befeuchteten Inkubator bei 38 ± 1 ºC (Abbildung 1A; Tag 0).
   3. Bebrüten Sie die Eier 3 Tage lang und halten Sie das Wasserbecken im Inkubator gefüllt.
2. Erstellen Sie an Tag 3 der Inkubation ein Fenster in der Eierschale.
   1. Legen Sie am 3. Tag der Inkubation ein kleines Stück (~1 cm x 0,5 cm) transparentes Klebeband auf die spitze Spitze des Eies (kleines Ende). Machen Sie ein kleines Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen.
   2. Führen Sie eine 19-G-Nadel mit einer 5-ml-Spritze in einem Winkel von 45° in das Loch ein, um eine Beschädigung des Dottersacks zu vermeiden, und saugen Sie 2-3 ml Eiweiß aus der Eizelle ab, um den Embryo in die Eizelle zu senken. Verschließen Sie das Loch mit einem zweiten Stück (~1 cm x 0,5 cm) transparentem Klebeband.
   3. Lege ein großes Stück (~5 cm x 5 cm) transparentes Klebeband auf die mit Bleistift markierte, nach oben zeigende Seite des Eies. Machen Sie ein Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen (Abbildung 1A; Tag 3).
   4. Schneiden Sie von diesem Loch aus mit einer gebogenen Präparierschere ein kleines kreisförmiges Fenster in die Eierschale. Schauen Sie durch dieses Fenster, um den Embryo zu lokalisieren, und vergrößern Sie dann das Fenster, um den Zugang zum Embryo zu optimieren (Abbildung 1A; Tag 3).
   5. Entfernen Sie alle großen Stücke der Eierschale, die möglicherweise auf den Embryo gefallen sind, mit einer Pinzette. Entfernen Sie kleinere Stücke, indem Sie einige Tropfen DPBS mit Kalzium und Magnesium (DPBS+/+) mit einer Kunststofftransferpipette auf den Embryo geben und dann das DPBS^+/+ mit der Eierschale in die Pipette aspirieren.
   6. Geben Sie drei Tropfen DPBS^+/+ , ergänzt mit 0,5 % Penicillin/Streptomycin, mit einer Plastikpipette in die Eizelle.
   7. Verschließen Sie das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück (~5 cm x 5 cm) transparentem Klebeband, bevor Sie das Ei bis zum 4. Tag der Inkubation wieder in den Inkubator legen, wenn sich der Embryo im Hamburger-Hamilton-Stadium 23-24 (HH 23-24)³² befindet.
      HINWEIS: Das Versiegeln des Fensters ist sehr wichtig, um eine Austrocknung und den Tod des Embryos zu vermeiden.
   8. Überprüfen Sie die Embryonen täglich auf Lebensfähigkeit, indem Sie sie durch das Klebeband betrachten (entfernen Sie das Klebeband nicht, um eine Austrocknung zu vermeiden). Während dieser ersten Tage der Inkubation ändert sich die Farbe des Eigelbs nach dem Tod des Embryos von hellgelb zu mattgelb. Entsorgen Sie verstorbene Embryonen.
   9. Halten Sie das Wasserbecken im Inkubator gefüllt.

3. Intracelomische Transplantation am 4. Tag der Inkubation

1. Zugang zum Zölom-Hohlraum
   1. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab.
   2. Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop auf einen Gummihalter oder Eierkarton.
   3. Der Hühnerembryo befindet sich nun in HH 23-24 und liegt auf der linken Seite, wobei die rechte Seite dem Betrachter zugewandt ist (Abbildung 1A; Tag 4). Suchen Sie den rechten Flügel und die Beinknospe des Embryos, da das Celom zwischen diesen beiden Gliedmaßenknospen zugänglich ist. Schaffen Sie im Bereich zwischen rechtem Flügel und Beinknospe nacheinander eine Öffnung in der Vitellinmembran, dem Chorion und dem Amnion, indem Sie sie mit zwei Paaren Präparierzangen halten und vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen ziehen.
      Anmerkungen: Die Vitellin-Membran ist die erste Membran, die nach dem Öffnen des Eies auftritt, und in einigen Fällen ist sie bereits nach dem Herstellen des Fensters am 3. Tag beschädigt. Wenn der Embryo gedreht wird, liegt er auf der rechten Seite und zeigt mit der linken Seite dem Betrachter zu (Abbildung 1A; Tag 4), ist es notwendig, es umzudrehen, um eine Transplantation zu ermöglichen. Machen Sie dazu eine große Öffnung in die Vitellin- und Chorionmembran und drehen Sie den Embryo vorsichtig mit einer Pinzette um.
   4. Prüfen Sie, ob ein ungehinderter Zugang zur Zölomhöhle besteht: Fassen Sie den Rand der Körperwand zwischen Flügel und Gliedmaßenknospe vorsichtig mit einer Präparierzange und ziehen Sie sie leicht in Richtung des Betrachters. Der Zölomhohlraum muss deutlich sichtbar sein. Führen Sie vorsichtig ein stumpfes, aber schlankes Instrument (z. B. einen stumpfen Wolframdraht in einem Mikroskalpellhalter) in die Zölomhöhle ein.
      HINWEIS: Wenn das stumpfe Instrument nicht in die Zölomhöhle eingeführt werden kann, bedeutet dies, dass eine oder mehrere der Membranen nicht richtig geöffnet wurden.
2. Transplantation
   1. Legen Sie ein halbes Organoid in das Ei auf die Allantois mit einem Dura-Dissektor.
   2. Fassen Sie mit einer Präparierzange vorsichtig den Rand der Körperwand und ziehen Sie ihn leicht in Richtung des Betrachters, um die Öffnung zum Celom sichtbar zu machen.
      Anmerkungen: Vermeiden Sie es, die Blutgefäße in der Körperwand zu beschädigen.
   3. Bewegen Sie das Organoid vorsichtig in Richtung und durch die Öffnung in der Körperwand in das Celom mit einem stumpfen Wolframdraht in einem Mikroskalpellhalter. Drücken Sie das Organoid leicht nach kranial, um es im Celom zu verankern. Er ist nun direkt hinter der Flügelknospe sichtbar (Abbildung 1A; Tag 4).
   4. Geben Sie drei Tropfen DPBS^+/+ mit einer Transferpipette aus Kunststoff in das Ei.
   5. Verschließen Sie das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück (~5 cm x 5 cm) transparentem Klebeband, bevor Sie die Eizelle bis zum 12. Tag der Inkubation (8 Tage nach der Transplantation) wieder in den Inkubator legen.
   6. Kontrollieren Sie die Embryonen täglich auf Lebensfähigkeit, indem Sie sie durch das Klebeband betrachten (entfernen Sie das Klebeband nicht, um eine Austrocknung zu vermeiden). Entsorgen Sie verstorbene Embryonen.
      HINWEIS: Wenn die Embryonen und ihre Chorioallantoismembranen wachsen, werden sie durch das Klebeband deutlicher sichtbar. Mangelnde Bewegung des Embryos und kollabierte oder spärliche Blutgefäße sind ein Zeichen für den Tod des Embryos.
   7. Überprüfen Sie das Wasserbecken im Inkubator täglich und halten Sie es gefüllt.

4. Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lektin

1. Vorbereitung der Injektion
   1. Stellen Sie Mikroinjektionsnadeln aus Glas her, indem Sie Glasmikrokapillaren in einem Mikropipettenzieher mit den folgenden Einstellungen ziehen: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Während Sie durch das Präpariermikroskop schauen, brechen Sie die Spitzen vorsichtig mit einer Präparierzange von den Mikroinjektionsnadeln ab, um eine Öffnung zu schaffen.
      Anmerkungen: Die erforderlichen Einstellungen für den Mikropipettenabzieher können je nach Gerät unterschiedlich sein.
   2. Montieren Sie das Einspritzsystem. Nehmen Sie zwei Stücke 38 cm Silikonschlauch und verbinden Sie sie miteinander, indem Sie einen 0,2 μm Filter dazwischen legen. Führen Sie ein Mundstück in das Ende des Schlauchs ein, der mit dem Filterauslass (Silikonschlauch 1) verbunden ist, und einen Anschluss in das Ende des Schlauchs, der mit dem Filtereinlass (Silikonschlauch 2) verbunden ist. Führen Sie abschließend die Mikroinjektionsnadel in den Konnektor ein (Abbildung 1B).
   3. Fluoreszenzmarkiertes Linsen-culinaris-Agglutinin (LCA) mit DPBS-/- auf eine Konzentration von 2,5 mg ^ml-1 in einem 0,5-ml-Röhrchen verdünnen und für ~30 s in einer Mikrozentrifuge herunterschleudern, um die Aggregate zum Boden des Röhrchens zu bewegen.
   4. Pipettieren Sie 20 μl LCA auf ein Stück Parafilm.
   5. Saugen Sie die 20 μl LCA aus dem Parafilm in die Mikrokapillarnadel des zusammengebauten Injektionssystems ab.
2. Injektion
   1. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab. Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop in einen Gummihalter.
   2. Beurteilen Sie das Gefäßsystem und lokalisieren Sie die Venen, die sich durch ihre etwas hellere rote Farbe von den Arterien unterscheiden lassen (Abbildung 1A; Tag 12). Um den Zugang zum Gefäßsystem zu verbessern, vergrößern Sie das Fenster vorsichtig, indem Sie es mit einer gebogenen Präparierschere schneiden. Wählen Sie eine Vene für die Injektion basierend auf Zugänglichkeit und Größe aus.
   3. Führen Sie die Spitze der Mikrokapillarnadel in einem Winkel von 0°-20º in die ausgewählte Vene ein. Stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in der Vene befindet, indem Sie die Spitze vorsichtig von einer Seite zur anderen bewegen. Blasen Sie vorsichtig und gleichmäßig in das Einspritzsystem, um die Ökobilanz einzuspritzen (Abbildung 1A; Tag 12).
      HINWEIS: Wenn sich die Nadel in der Vene in der richtigen Position befindet, sollte sie innerhalb der Grenzen der Vene bleiben.
   4. Legen Sie das Ei für 10 Minuten zurück in den Inkubator, damit die LCA zirkulieren kann.
      Anmerkungen: Es ist nicht notwendig, das Ei während dieser Zeit mit Klebeband zu verschließen.

5. Sammeln von transplantierten Organoiden am 12. Tag der Inkubation

1. Den Hühnerembryo opfern
   1. Legen Sie das Ei in einen Gummihalter auf die Bank. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab. Schneiden Sie dann die Membranen, die den Embryo umgeben, mit einer gebogenen Präparierschere durch.
      HINWEIS: Ein Präpariermikroskop ist für diesen Schritt nicht erforderlich.
   2. Schöpfen Sie den Embryo mit einem perforierten Löffel aus dem Ei und enthaupten Sie den Embryo sofort mit einer Schere. Legen Sie den Körper des Embryos in eine Petrischale unter das Seziermikroskop.
2. Auffinden und Sammeln von Organoiden
   1. Legen Sie den Embryo auf den Rücken in die Petrischale und spreizen Sie seine Gliedmaßen.
   2. Öffnen Sie die Bauchdecke des Embryos vorsichtig mit einer Pinzette entlang der Längsachse.
   3. Lokalisieren Sie das Organoid im Inneren des Embryos. Das Organoid wird am häufigsten am rechten Leberlappen befestigt, entweder an der Schwanzspitze oder kranial direkt unter dem Brustkorb (Abbildung 1A; Tag 12). Es wird daher empfohlen, zunächst an diesen Orten zu suchen.
   4. Sobald das Organoid lokalisiert ist, entfernen Sie es aus dem Embryo, indem Sie es mit einer Mikroschere umschneiden. Legen Sie das Organoid und das unweigerlich daran haftende Hühnergewebe in eine Petrischale unter das Präpariermikroskop. Entfernen Sie so viel Hühnerfleisch wie möglich mit einer zweischneidigen Rasierklinge aus Edelstahl.
   5. Verarbeiten Sie das Organoid je nach gewünschter Analyse.

6. Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung

1. Ein transplantiertes Organoid wird in eine 24-Well-Platte gegeben und in 500 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C für 24 h fixiert. 3x mit DPBS-^/- waschen.
2. Permeabilisieren und blockieren Sie das Organoid in 300 μL Blockierlösung (0,3 % Triton-X in DPBS^-/- mit 10 % Eselsserum) für 2 h bei Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung vor: Für ein Organoid verdünnen Sie die primären Antikörper NPHS1 (Schaf-α-Mensch, Verdünnung 1:100), CD31 (Maus-α-Mensch, Verdünnung 1:100) und LTL (Biotin-konjugiert, Verdünnung 1:300) in 300 μl Blockierungslösung. Die Antikörpermischung wird in das Organoid gegeben und 72 h bei 4 °C inkubiert.
4. 3x mit 0,3% TritonX in DPBS-^/- waschen.
5. Bereiten Sie die Sekundärantikörpermischung vor: Für ein Organoid verdünnen Sie die Sekundär α antikörper Alexa Fluor 647 (Verdünnung 1:500), Esel-α-Maus Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:500) und Streptavidin Alexa Fluor 405 (Verdünnung 1:200) in 300 μl Blockierlösung. Die sekundäre Antikörpermischung zum Organoid geben und 2-4 h bei Raumtemperatur inkubieren. Mit Alufolie abdecken, um eine Lichtexposition der Sekundärantikörper zu vermeiden.
6. 3x mit DPBS-^/- waschen.
7. Das Organoid in ~30 μL Eindeckmedium in eine 35 mm Glasbodenschale einbetten und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen, abgedeckt mit Alufolie. Bei 4 °C lagern.
8. Aufnahme mit einem konfokalen Mikroskop.

Ergebnisse

Die Methode und der Zeitplan für die Differenzierung von hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden, die Inkubation von befruchteten Hühnereiern, die Transplantation von Nierenorganoiden, die Injektion von LCA und die Entnahme der Organoide sind in Abbildung 1A zusammengefasst. Es ist wichtig, den Zeitpunkt der Organoid-Differenzierung und der Hühnerei-Inkubation zu koordinieren und mit der Differenzierung 15 Tage vor der Inkubation zu beginnen. Die Aktionen an Tag 0, 3, 4 und 12 der Inkubation wer...

Diskussion

In diesem Manuskript wird ein Protokoll für die intracelome Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in Hühnerembryonen demonstriert. Nach der Transplantation werden Organoide durch perfundierte Blutgefäße vaskularisiert, die aus einer Kombination von aus menschlichen Organoiden und Hühnern bestehen. Diese verteilen sich über das Organoid und dringen in die glomerulären Strukturen ein, was eine Wechselwirkung zwischen den ECs und Podozyten ermöglicht. Es konnte bereits gezeigt werden, dass dies zu ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm	Whatman	10462200
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope	Leica	TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC090-11
Dissecting microscope	Wild Heerbrugg	355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp	Hammacher Karl	HAMMHSB391-10
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-212-02	dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-21448	dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades	Electron Microsopy Sciences	72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)	ThermoFisher Scientific	14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)	ThermoFisher Scientific	14190094
Egg cartons or custom made egg holders	NA	NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)	Drost Loosdrecht B.V.	NA
Incubator	Elbanton BV	ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated	Vector Laboratories	B-1325	dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm	Hammacher Karl	HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament	World Precision Instruments	TW150F-3
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Model P-97	We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.	Euronexia	L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm	Reda	41146-18
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL	ThermoFisher Scientific	15070063
Perforated spoon	Euronexia	S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm	CELLSTAR	628160
Plastic transfer pipettes	ThermoFisher Scientific	PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody	BD Biosciences	555444	dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)	Vector Laboratories	RL-1042	This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody	R&D systems	AF4269	dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G	BD microlance	301500
Streptavidin Alexa Fluor 405	ThermoFisher Scientific	S32351	dilution 1:200
Syringe 5 mL	BD Emerald	307731
Transparent tape	Tesa	4124	Available at most hardware stores
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia	ThermoFisher Scientific	010404.H2