تصف هذه المخطوطة بروتوكولا من خطوتين لتوليد خلايا جلدية خاصة بالمريض من الخلايا الليفية الجلدية عن طريق إعادة البرمجة العرضية إلى الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) والتمايز اللاحق إلى خلايا بودوسيتي.
الخلايا القرنية هي خلايا طلائية تقع على الموقع البولي لحاجز الترشيح الكبيبي وتساهم في وظيفة المرشح الانتقائي للكبيبة. يمكن أن تسبب الطفرات في الجينات الخاصة بالخلايا البؤرية تصلب الكبيبات القطاعي البؤري (FSGS) ، وتتأثر الخلايا البدوية أيضا في العديد من اعتلالات الكلية الأولية والثانوية الأخرى. نظرا لطبيعتها المتمايزة ، فإن نماذج زراعة الخلايا الأولية محدودة للخلايا البيضاء. لذلك ، يتم استخدام الخلايا الخالدة المشروطة بشكل شائع. ومع ذلك ، فإن هذه الخلايا المخلدة المشروطة (ciPodocytes) لها العديد من القيود: يمكن للخلايا أن تتمايز في الثقافة ، خاصة عندما تصل إلى نقطة التقاء ، والعديد من العلامات الخاصة بالخلايا الذكورية إما يتم التعبير عنها بشكل طفيف أو لا يتم التعبير عنها على الإطلاق. هذا يضع استخدام ciPodocytes وقابليتها للتطبيق للوصول الفسيولوجي والفيزيولوجي المرضي والسريري موضع تساؤل. هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد الخلايا البدوية البشرية - بما في ذلك الخلايا البدوية الخاصة بالمريض - من خزعة لكمة الجلد عن طريق إعادة البرمجة العرضية للخلايا الليفية الجلدية إلى hiPSCs والتمايز اللاحق إلى podocytes. تشبه هذه الخلايا في الجسم الحي الخلايا البدوية بشكل أفضل بكثير من حيث الخصائص المورفولوجية ، مثل تطور عمليات القدم والتعبير عن العلامة الخاصة بالخلايا البدوية. أخيرا ، ولكن الأهم من ذلك ، تحافظ هذه الخلايا على طفرات المرضى ، مما يؤدي إلى تحسين نموذج خارج الجسم الحي لدراسة أمراض podocyte والمواد العلاجية المحتملة في نهج فردي.
Podocytes هي خلايا ظهارية كلوية متخصصة بعد الانقسام تشكل حاجز الترشيح الكبيبي للكلية جنبا إلى جنب مع الغشاء القاعدي الكبيبي (GBM) والخلايا البطانية الكبيبية والجليكوكاليكس. ظاهريا ، تتكون الخلايا البدوية من جسم الخلية وامتدادات الغشاء الأولية التي تحركها الأنابيب الدقيقة ، بالإضافة إلى امتدادات ثانوية تسمى عمليات القدم 1,2. تم بناء حاجز الترشيح الكبيبي الذي يقوم بتصفية البول من الدم من البطانة المحصنة ، GBM ، ونوع متخصص من الوصلات بين الخلايا التي تربط عمليات قدم podocyte المجاورة ، تسمى الحجاب الحاجز الشقي ل podoctyes3. في ظل الظروف الصحية ، يتم الاحتفاظ بالبروتينات الأكبر من الألبومين من حاجز الترشيح بسبب حجمها وشحنتها4.
من المعروف أن الطفرات في الجينات الخاصة بالهيكل الخلوي أو الخلايا البدوية ، بالإضافة إلى العوامل المنتشرة التي تؤثر على مسارات إشارات الخلايا البدوية ، تحفز امحاء الخلايا أو الانفصال أو موت الخلايا المبرمج ، مما يؤدي إلى بيلة بروتينية وتصلب كبيبي. على وجه الخصوص ، إعادة ترتيب الهيكل الخلوي ، والتغيرات في قطبية podocyte أو تلف عمليات القدم مع فقدان ما يرتبط بها من تقاطعات الشق هيمحورية 5. نظرا لوضعها المتمايز بشكل نهائي ، لا يمكن استبدال الخلايا البدائية بعد انفصال GBM. ومع ذلك ، إذا تم ربط podocytes إلى GBM ، فإنها لا تزال قادرة على التعافي من محو وإصلاح عمليات القدم interdigitating6،7،8. قد يوفر الفهم الإضافي للأحداث التي تؤدي إلى تلف الخلايا البدوية في اضطرابات الكبيبات المختلفة أهدافا علاجية جديدة ستساعد في تطوير علاجات لهذه الأمراض. تلف Podocyte هو السمة المميزة لأمراض الكبيبات المختلفة ، بما في ذلك تصلب الكبيبات القطاعي البؤري (FSGS) ، اعتلال الكلية السكري ، مرض الحد الأدنى من التغيير ، واعتلال كبيبات الكلى الغشائي ، مما يتطلب نماذج موثوقة من podocyte ex vivo لدراسة الآليات المرضية وطرق العلاج المحتملة لهذه الأمراض 9,10. يمكن دراسة الخلايا القرنية خارج الجسم الحي عن طريق زراعة الخلايا الأولية الكلاسيكية بناء على عزل الكبيبات عن طريق الغربلة التفاضلية11. ومع ذلك ، نظرا للحالة المتمايزة نهائيا مع قدرة الانتشار المحدودة ، يستخدم معظم الباحثين خطوط خلايا ciPodocyte للفأر أو الخلايا البشرية التي تعبر عن المتغيرات الحساسة لدرجة الحرارة لمستضد SV40 T الكبير. بدلا من ذلك ، يتم عزل ciPodocytes من الفئران المعدلة وراثيا التي تؤوي الجين التخليدي SV40 Tag 1,12.
تتكاثر الخلايا السيبودية عند 33 °C ، ولكنها تدخل توقف النمو وتبدأ في التمايز عند 37 °C13,14. يجب أن يوضع في الاعتبار أن البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها مع هذه الخلايا يجب تفسيرها بحذر معين ، حيث يتم إنشاء الخلايا باستخدام إدخال جيني غير طبيعي15. نظرا لأن هذه الخلايا تحتوي على جين خالد ، فإن علم وظائف الأعضاء الخلوية يتغير بسبب الانتشار المستمر12. تم التشكيك مؤخرا في خطوط خلايا Podocyte الناتجة عن هذا النهج ، حيث تعبر خلايا الفئران والإنسان والفئران عن أقل من 5٪ من synaptopodin و nephrin على مستوى البروتين ، وكذلك NPHS1 و NPHS2 على مستوى mRNA مقارنة بالتعبير الكبيبي16. علاوة على ذلك ، فإن معظم خطوط خلايا podocyte لا تعبر عن nephrin17,18. كما وصف تشيتيبرول وآخرون اختلافا كبيرا في حركة الخلية والاستجابات للبوروميسين ودوكسوروبيسين في ciPodocytes16. يمكن العثور على Podocytes في البول بعد الانفصال عن GBM في أمراض الكبيبات المختلفة19،20،21،22. يمكن زراعة الخلايا البولية القابلة للحياة خارج الجسم الحي لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع ، لكن معظم الخلايا تخضع لموت الخلايا المبرمج23,24. ومن المثير للاهتمام ، أن الخلايا البدوية لا توجد فقط في بول المرضى الذين يعانون من مرض الكبيبات ولكن أيضا في بول الأشخاص الأصحاء ، على الأرجح عندما يكونون شيخوخة مرة أخرى مع إمكانية محدودة للتكرار في الثقافة24. علاوة على ذلك ، فإن عدد الخلايا البولية المشتقة من المسالك البولية محدود ، والخلايا غير متمايزة في الثقافة ، وتظهر عمليات قدم أقل ، وتغير التشكل ، والأهم من ذلك أن قدرتها على الانتشار محدودة. التعبير عن الجينات الخاصة بالخلايا العضلية غائب ، أو يختفي في غضون أسابيع قليلة ، أو يختلف بين هذه الحيوانات المستنسخة من الخلايا. بعض الخلايا الإيجابية للعلامة الخاصة ب podocyte عبرت بشكل مشترك عن علامة الخلايا الظهارية الأنبوبية أو الخلايا الليفية العضلية والخلايا الوسيطة ، مما يشير إلى عدم التمايز و / أو التمايز للخلايا البولية المستزرعة24,25.
في الآونة الأخيرة ، تم وصف توليد خطوط خلايا ciPodocyte المشتقة من بول المرضى والمتطوعين الأصحاء عن طريق النقل باستخدام مستضد T كبير SV40 حساس للحرارة و hTERT26. تم الكشف عن تعبير mRNA للبروتين المرتبط ب synaptopodin و nestin و CD2 ، لكن podocin mRNA كان غائبا في جميع الحيوانات المستنسخة. بالإضافة إلى مشاكل الخلايا البولية ، تحتوي هذه الخلايا أيضا على الجين الخالد المدرج ، مما يؤدي إلى العيوب التي نوقشت أعلاه.
في المقابل ، تتمتع الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) بقدرة هائلة على التجديد الذاتي والتمايز إلى أنواع متعددة من الخلايا في ظل الظروف المناسبة. لقد ثبت من قبل أن hiPSCs يمكن أن تكون بمثابة مصدر غير محدود تقريبا للخلايا27,28.
هنا ، يتم وصف بروتوكول من خطوتين لتوليد خلايا بودوسيتات خاصة بالمريض من الخلايا الليفية الجلدية لخزعات الجلد المثقوبة مع إعادة البرمجة العرضية اللاحقة إلى hiPSCs والتمايز النهائي إلى الخلايا المشتقة من hiPSC (الشكل 1).
الشكل 1: بروتوكول لتوليد خلايا podocytes المشتقة من hiPSC الخاصة بالمريض. نظرة عامة رسومية على بروتوكول توليد الخلايا الليفية الخاصة بالمريض من الخلايا الليفية الجلدية لخزعة الجلد عن طريق إعادة البرمجة إلى hiPSCs والتمايز إلى خلايا بودوسيتي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كخطوة أولى ، تم التخلص من الخلايا الليفية الجلدية الجسدية من خزعة لكمة الجلد وإعادة برمجتها إلى hiPSCs باستخدام طريقة خالية من التكامل عن طريق التثقيب الكهربائي مع البلازميدات التي تعبر عن عوامل النسخ OCT3 / 4 و KLF4 و SOX2 و c-MYC29،30،31. تم اختيار مستعمرات hiPSC الناشئة وتوسيعها لاحقا. بدأ التمايز بتحريض سلالة الأديم المتوسط عن طريق تنشيط مسار إشارات WNT ، يليه توليد الخلايا السلفية النيفرون التي كانت لا تزال قادرة على التكاثر. وأخيرا، تم تمايز الخلايا إلى خلايا بودوسيتية. في هذا الإجراء ، قمنا بتعديل ودمج البروتوكولات المنشورة مسبقا لإعادة البرمجة العرضية لتوليد hiPSCs بواسطة Bang et al.32 و Okita et al.33 ، بالإضافة إلى بروتوكول لتمايز hiPSCs إلى خلايا podocytes بواسطة Musah et al.28،34،35.
في الواقع ، كان للخلايا البدوية الناتجة عن بروتوكولنا نمط ظاهري أقرب إلى podocytes في الجسم الحي ، فيما يتعلق بتطوير شبكة متميزة من عمليات القدم الأولية والثانوية والتعبير عن علامات خاصة بالخلايا ، مثل synaptopodin و podocin و nephrin. مع استخدام الخلايا المشتقة من hiPSC ، يتم الحفاظ على الخلفية الوراثية للمريض أثناء إعادة البرمجة والتمايز. وهذا يتيح نمذجة مرض podocyte الخاص بالمريض واكتشاف المواد العلاجية المحتملة خارج الجسم الحي في عدد خلايا غير محدود تقريبا. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول طفيف التوغل، وفعال من حيث التكلفة، ومقبول أخلاقيا، وقد يسهل سبلا جديدة لتطوير العقاقير.
تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة فريدريش ألكسندر إرلانغن نورمبرغ (251_18B) ، وأعطى جميع المرضى و probands موافقة كتابية. تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. للاطلاع على تكوين جميع الوسائط والحلول المستخدمة هنا، انظر الجدول 1.
1. نمو الخلايا الليفية الجلدية من خزعة لكمة الجلد
2. تجميد الخلايا الليفية الجلدية
3. إعادة البرمجة العرضية للخلايا الليفية لتوليد hiPSCs
4. اختيار وتوسيع ومراقبة الجودة من hiPSCs التي تم إنشاؤها
5. توسيع استنساخ hiPSC المحدد
6. تجميد استنساخ hiPSC المحدد
7. مراقبة الجودة HiPSC
8. تمايز hiPSCs إلى podocytes
9. توصيف الخلايا المشتقة من hiPSC عن طريق تلطيخ التألق المناعي
مع هذا البروتوكول خطوة بخطوة الذي يجمع بين إعادة البرمجة العرضية والتمايز ، من الممكن توليد خلايا podocytes تحمل طفرة المريض في جين ذي صلة بالخلايا الذكورية. وهذا يتيح تحليل التغيرات podocyt الخاصة بالمرض خارج الجسم الحي. يتم الحفاظ على الخلفية الوراثية للمريض أثناء البروتوكول خلال جميع مراحل الخلايا المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التغلب على الحد من عدم كفاية عدد الخلايا من الخلايا البادوسية غير المتكاثرة المتمايزة نهائيا باستخدام الخلايا المشتقة من hiPSC. على الرغم من أن الأمر يستغرق عدة أشهر حتى يتم إنشاء الخلايا الليفية hiPSC من الخلايا الليفية الجلدية المتضخمة عن طريق إعادة البرمجة إلى hiPSCs والتمايز اللاحق إلى الخلايا البدوية ، فمن الممكن تجميد الخلايا في ثلاث خطوات مختلفة من البروتوكول (الشكل 2). التجميد ممكن للخلايا الليفية ، hiPSCs ، والخلايا السلفية النيفرون بعد التمايز في وسط تمايز السلف النيفرون لمدة 7 أيام. لذلك ، من الممكن إنشاء بنوك خلايا عاملة وتجارب واسعة النطاق.
الشكل 2: الخطوات الفردية للبروتوكول من خلال مجهر تباين الطور. أ: الخلايا الليفية الجلدية المتضخمة. (ب) تشكيل مستعمرة hiPSC بعد إعادة البرمجة. (ج) ثقافة hiPSC مختارة. د: خلايا الأديم المتوسط بعد 2 أيام من التمايز. ه: الخلايا السلفية النفرية بعد 14 يوما من التمايز في وسط تمايز السلف النفرون. (F) الخلايا الطرفية المتمايزة المشتقة من hiPSC. تمثل قضبان المقياس 300 ميكرومتر (A ، B ، D-F) و 150 ميكرومتر (C). تسلط ندفة الثلج الضوء على خطوات التجميد المحتملة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نظرا لأن الخلايا المشتقة من hiPSC المتولدة تجتاز بروتوكولا طويلا مع تغييرات جذرية فيما يتعلق بنوع الخلية والتشكل ، فإن توصيف الخلية إلزامي. يمكن مراقبة مورفولوجيا الخلية ، مثل الحجم وشكل الخلية ، وكذلك سلوك النمو ، باستخدام مجهر تباين الطور. تقدم الخلايا الليفية نمطا ظاهريا طويلا يشبه المغزل بحجم 150 ميكرومتر إلى 300 ميكرومتر (الشكل 2 أ). بعد إعادة البرمجة ، تحدث مستعمرات تحتوي على 50 ميكرومتر من hiPSCs الصغيرة. تظهر هذه المستعمرات حدودا مميزة و hiPSCs تتميز بنسبة عالية من النوى إلى الجسم وزيادة معدل الانتشار (الشكل 2C). نظرا لأن الخلايا البدائية عبارة عن خلايا متمايزة بشكل نهائي ، فإن معدل الانتشار يتناقص مع التمايز التدريجي ، ويتغير مورفولوجيا الخلية إلى 300 ميكرومتر من الخلايا البدوية الكبيرة على شكل نجمة مع عمليات القدم البارزة (الشكل 2F).
يعد التقاء نقطة حرجة في ثقافة hiPSC ، ويمكن أن يظهر التمايز التلقائي عندما تنمو المستعمرات كثيفة للغاية (الشكل 3). يجب إزالة هذه المستعمرات قبل المرور عن طريق كشط الأجزاء المصابة من طبق الاستزراع.
الشكل 3: أمثلة على hiPSCs ذات الجودة المختلفة. صور تباين الطور ل (A) مستعمرات hiPSC المعاد برمجتها بنجاح و (B) hiPSCs المحددة ، بالإضافة إلى (C) التمايز التلقائي ، (D ، E) مستعمرات غير hiPSC ، و (F) ثقافة hiPSC كثيفة للغاية. تمثل قضبان المقياس 300 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
يجب التحقق من صحة أنواع الخلايا المختلفة لهذا البروتوكول فيما يتعلق بالتعبير عن علامة معينة. بعد إعادة البرمجة ، تستعيد hiPSCs قدرة تعدد القدرات وتعبر عن علامات الانتشار وتعدد القدرات مثل SSEA4 و OCT3 / 4 و Ki67 (الشكل 4) 38،39،40. من المعروف أن إعادة البرمجة ، بالإضافة إلى الثقافة الطويلة ل hiPSCs والتمايز ، يمكن أن تؤدي إلى نمط نووي غير طبيعي ، أو بالأحرى إحداث طفرات41. لذلك ، يجب مراقبة الخلفية الوراثية للخلايا المستزرعة بمرور الوقت وفي ممرات مختلفة عن طريق نطاقات g وتسلسل الإكسوم الكامل.
الشكل 4: توصيف hiPSCs المتولدة عن طريق تلطيخ التألق المناعي. توصيف hiPSCs المتولدة عن طريق تلطيخ (A) العلامة التكاثرية Ki67 ، وكذلك علامات تعدد القدرات (B) OCT3 / 4 و (C) SSEA4. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
من الناحية الشكلية ، تظهر الخلايا المشتقة من hiPSC على شكل نجمة وتعبر عن شبكة متميزة من عمليات القدم الأولية والثانوية الطويلة مقارنة بالخلايا الجذعية (الشكل 5). تعبر الخلايا المشتقة من HiPSC عن بروتينات واسمة خاصة بالخلايا الذكورية مثل synaptopodin و nephrin و podocin (الشكل 6A-C) 42.
الشكل 5: مورفولوجيا الخلايا المشتقة من hiPSC مقارنة بالخلايا السيبودية. مقارنة بين الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من (A,B) من متبرع سليم إلى الخلايا الجذعية الخيطية (C,D) فيما يتعلق بمورفولوجيا الخلية و filopodia باستخدام مجهر تباين الطور (A,C) والمجهر الإلكتروني الماسح (B,D). تمثل قضبان المقياس 150 ميكرومتر (A ، C) و 20 ميكرومتر (B ، D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لذلك ، فإن مقارنة الخلايا المشتقة من hiPSC ليس فقط من المتبرعين الأصحاء ، ولكن أيضا من المرضى الذين يعانون من طفرات في الجينات الخاصة بالخلايا البدوية ، تسمح بالتوصيف الفردي لطفرة المريض خارج الجسم الحي.
الشكل 6: توصيف علامة خاصة بالخلايا البدوية في الخلايا المشتقة من hiPSC والخلايا السيبودية. مقارنة بين الخلايا المشتقة من (A-C) المشتقة من hiPSC من متبرع سليم إلى (D-F) ciPodocytes فيما يتعلق ببروتينات العلامات الخاصة بالخلايا البادومية synaptopodin (A ، D) ، النيفرين (B ، E) ، والبودوسين (C ، F). تمثل قضبان المقياس 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. تكوين جميع وسائط زراعة الخلايا والحلول المستخدمة في الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
يجمع هذا البروتوكول القائم على زراعة الخلايا بين إعادة البرمجة العرضية للخلايا الليفية الجلدية البشرية في hiPSCs الخاصة بالمريض والتمايز اللاحق إلى الخلايا المشتقة من hiPSC. هذا يسمح لنا بدراسة التغيرات المرتبطة بالطفرات في الخلايا البدوية من المرضى الذين يعانون من مرض الكبيبات الوراثية فيما يتعلق بإصابة الخلايا البودية. تم تكييف بروتوكول إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية بطريقة خالية من التكامل عن طريق التثقيب الكهربائي من العمل المنشور ل Bang et al.32 و Okita et al.33. تم تكييف بروتوكول التمييز بين الخلايا العضلية من hiPSCs من البروتوكول المنشور من Musah et al.28،34،35. هناك بالفعل منشورات متاحة تصف توليد الخلايا البدوية من hiPSCs27،34،35. ومع ذلك ، فإن البروتوكول المقدم هنا محسن وأقل تكلفة فيما يتعلق بتمايز hiPSCs إلى خلايا بودوسيتيات. مقارنة بالبروتوكول المنشور من Musah et al. ، اختبرنا هذا البروتوكول على كواشف طلاء مختلفة ، مثل vitronectin و laminin silk-511 ومصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان. يمكن تقليل تركيزات الفيترونيكتين والحرير اللامينين -511 إلى 2.5 ميكروغرام / مل بدلا من 5 ميكروغرام / مل28،34،35. علاوة على ذلك ، كان من الممكن تقليل تركيزات BMP7 و activin A - عاملي نمو مكلفين للغاية - بنسبة 50٪ ، من 100 نانوغرام / مل إلى 50 نانوغرام / مل.
وهذا يتيح تمايز أقل تكلفة. كانت الخلايا السلفية للنيفرون من اليوم 7 لا تزال تتكاثر ، وظهرت إمكانية التجمد من قبل. قمنا بتوسيع هذه الخلايا بعد الذوبان وقبل التمايز النهائي في الوسط الأساسي الذي يحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) و B27 لعدة أيام ، مما قلل التكاليف بشكل أكبر. بالإضافة إلى خطوات التمايز ، يصف هذا البروتوكول نمو الخلايا الليفية من خزعات الجلد مع الجيل اللاحق من hiPSCs الخاصة بالمريض عبر إعادة البرمجة العرضية. يتيح الجمع بين هاتين الطريقتين توليد خلايا بودوسيتات خاصة بالمريض. لذلك ، يتم توفير بروتوكول كامل خطوة بخطوة لتوليد خلايا podocytes مشتقة من hiPSC خاصة بالمريض لم يتم وصفها من قبل بمثل هذه التفاصيل.
نظرا لأن البروتوكول العام يتضمن عدة أنواع مختلفة من الخلايا ، فمن الأهمية بمكان توصيف أنواع الخلايا التي تم إنشاؤها في خطوات مختلفة. الخلايا في الثقافة لفترة طويلة من الزمن ، لذلك يجب إجراء مراقبة الجودة في ممرات مختلفة. عند العمل مع hiPSCs ، من الضروري التغذية اليومية وكذلك مراقبة سلوك الخلية والمورفولوجيا. يجب ضمان عقم وسائط التمايز عن طريق تعقيم المرشح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. يستغرق البروتوكول بأكمله ، من خزعة الجلد إلى الخلايا المشتقة من hiPSC ، عدة أشهر ، ولكن من الممكن تجميد الخلايا في مراحل متميزة من العملية. يمكن تجميد الخلايا الليفية ، واستنساخ hiPSC المختار ، والخلايا السلفية النيفرون التكاثرية بعد 7 أيام في وسط تمايز السلف النيفرون ، ويمكن إنشاء بنك خلايا عامل.
على الرغم من أن الخلايا الحميدة السليمة المشتقة من hiPSC تطور شبكة متميزة من عمليات القدم الأولية والثانوية (الشكل 5A ، B) وتعبر عن علامة نموذجية خاصة بالخلايا (الشكل 6A-C) ، فإن أغشية الشق المميزة ، كما تظهر في الجسم الحي ، يصعب تقليدها في نماذج زراعة الخلايا الكلاسيكية ثنائية الأبعاد. علاوة على ذلك ، لا يمكن التواصل بين الخلايا مع أنواع الخلايا الكبيبية الأخرى في هذا الإعداد أحادي الثقافة.
نظرا لحالتها المتمايزة النهائية ونقص القدرة على الانتشار ، من الصعب دراسة podocytes خارج الجسم الحي. بمساعدة تخليد الخلايا الأولية المشروطة ، من الممكن التغلب على هذا القيد عن طريق إدخال مفتاح حساس للحرارة ، مما يؤدي إلى نموذج زراعة الخلايا حيث تتكاثر الخلايا عند 33 درجة مئوية وتتمايز عند 37 درجة مئوية13,14. على الرغم من أن هذه الخلايا الجذعية لديها إمكانات عالية لأبحاث podocyte ، إلا أن هناك قيودا ، مثل عدم وجود تعبير علامة ، ومورفولوجيا غير متمايزة ، والفشل في تشكيل عمليات القدم15,16.
يتيح تمايز الخلايا البدوية عن الخلايا الجسدية المشتقة من المريض توليد ومقارنة الخلايا البدوية المريضة مع خلايا التحكم السليمة خارج الجسم الحي. وهذا يمكننا من دراسة تلف الخلايا البدوية بسبب الطفرات في الجينات الخاصة بالخلايا الذكورية. علاوة على ذلك ، فإن العمل مع hiPSCs لديه القدرة على إنشاء نماذج مرض زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، أو بالأحرى الكائنات العضوية43,44. قد تؤدي الزراعة المشتركة للخلايا المشتقة من hiPSC مع الخلايا الكبيبية الأخرى ، مثل الخلايا البطانية الكبيبية أو الخلايا المتوسطة ، إلى رؤى جديدة فيما يتعلق بالتواصل بين الخلايا في الصحة وأمراض الكبيبات.
علاوة على ذلك ، يمكن إجراء توصيف وعلاج الخلايا البدوية الخاصة بالمريض خارج الجسم الحي في تحليل عالي الإنتاجية. يفتح النهج الفردي الفرصة للتحقيق في أهداف علاجية جديدة لطفرات محددة وأداء الطب الفردي في المستقبل.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم تمويل هذا العمل من قبل المركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) التابع لجامعة فريدريش ألكسندر إرلانغن نورنبرغ مع رقم المنحة M4-IZKF-F009 الممنوحة لجانينا مولر-ديل، ومن قبل Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) تحت اسم المشروع STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS، رقم المنحة 01GM2202D الممنوحة لجانينا مولر-ديل. نشكر أنالينا كراوس على الدعم في التقاط صور SEM.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 µm sterile filter | Rotilab | P668.1 | for sterilization of differentiation medium |
all-trans retinoic acid | Stem Cell Technologies | 72262 | supplement for differentiation |
B27 supplement (50 x), serum free | Gibco | 17504044 | supplement for serum-free differentiation medium |
BG iMatrix-511 Silk | biogems | RL511S | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.4 | |
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL | Greiner bio-one | 82050-856 | cell culture plastics suitable for fibroblast culture |
CHIR99021 (5 mg) | Sigma-Aldrich | 252917-06-9 | supplement for differentiation |
Corning Matrigel hESC qualified matrix | Corning | 354277 | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix) |
countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | to count cells |
countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | to count cells | |
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white | Sarstedt | 72380 | cryovials for freezing of cells |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | for fibroblast freezing medium |
DMEM/F12 (1:1) (1 x) | Gibco | 11320074 | basic medium for differentiation |
DMEM/F12 + Glutamax | Gibco | 10565018 | basic medium for fibroblast medium |
EVOS M5000 Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | phase contrast microscope |
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) | PAN Biotech | P301902 | serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium |
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile | Fisherbrand | FB104 | cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap) |
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | mounting medium containing dapi |
gauge needle (0.6 x 30 mm) | BD Microlance3 | 300700 | for separation of hiPSC colonies into small pieces |
human Recombinant Activin A Protein | 78001.1 | Stem cell technologies | supplement for differentiation |
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) | Peprotech | 120-03P | supplement for differentiation |
human VEGF-165 Recombinant Protein | Thermo Scientific | PHC9394 | supplement for differentiation |
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) | Gibco | 41400045 | supplement for podocyte maintenance medium |
LB medium | Roth | X964.1 | for sterility test of hiPSC culture |
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma Aldrich | MP0035-1KT | commercial mycoplasma detection kit |
microscope slides | Diagonal GmbH & Co.KG | 21,102 | |
microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
mTeSR1 Complete Kit | Stem Cell Technologies | 85850 | basic medium for serum-free hiPSC culture medium |
nalgene freezing container Mr.Frosty | Roth | AC96.1 | to ensure optimal freezing conditions |
normal goat serum | abcam | ab 7481 | for preincubation solution and antibody diluent |
nunc 24 well plates | Thermo Scientific | 142485 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 48 well plates | Thermo Scientific | 152640 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 6 well plates | Thermo Scientific | 140685 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc EasYDish Dishes 100 mm | Thermo Scientific | 150466 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 167008 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium | Sartorius | 05-713-1E | serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells |
Opti-MEM | Gibco | 11058021 | electroporation medium |
pCXLE-hMLN | Addgene | #27079 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hOCT3/4 plasmid | Addgene | #27077 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hSK plasmid | Addgene | #27078 | plasmid for episomal reprogramming |
penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | to avoid bacterial contamination |
plastic coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes |
ROTI Histofix | Roth | P087.3 | commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells |
RPMI 1640 + L-Glutamine | Gibco | 21875034 | basic medium for podocyte maintenance medium |
staining chamber StainTray Black lid | Roth | HA51.1 | |
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs |
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) | Gibco | 14190094 | used for washing and coating |
sterile water | Roth | T1432 | |
syringe without needle 20 mL | BD Plastipak | 300629 | to filter sterilize differentiation medium |
TC dish 100 mm | Sarstedt | 8,33,902 | sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture |
TC dish 35 mm | Sarstedt | 8,33,900 | sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy |
triton X 100 | Roth | 3051.3 | for preincubation solution |
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | to count cells |
trypsin-EDTA (10 x) | Biowest | X0930-100 | dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells |
tube 15 mL | Greiner bio-one | 188271-N | |
tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
vitronectin ACF | Sartorius | 05-754-0002 | extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) | Tocris | 1254 | to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting |
Primary antibodies | |||
OCT4 | Stem Cell Technologies | 60093.1 | pluripotency marker, dilution 1:200 |
SSEA-4 | Stem Cell Technologies | 60062FI.1 | pluripotency marker, dilution 1:100 |
Ki67 | Abcam | ab15580 | proliferation marker, dilution 1:300 |
synaptopodin | Proteintech | 21064-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:200 |
nephrin | Progen | GP-N2 | podocyte-specific marker, dilution 1:25 |
podocin | proteintech | 20384-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:100 |
Secondary antibodies | |||
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21435 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A31634 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved