تحفيز الحمل الكاذب في إناث الفئران دون الحاجة إلى قطع الأسهر قبل نقل الأجنة غير الجراحي أو التلقيح الاصطناعي

Summary

يمكن لطريقة التلاعب بعنق الرحم المقدمة أن تحفز الحمل الكاذب في الفئران دون الحاجة إلى تربية الإناث مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر. مطلوب تحريض الحمل الكاذب لنجاح نقل الأجنة غير الجراحي والتلقيح الاصطناعي غير الجراحي ، وكلاهما مقدم أيضا.

Abstract

للحفاظ على الحمل بنجاح مع نقل الأجنة أو التلقيح الاصطناعي ، يجب حث الفئران المتلقية الإناث في حالة الحمل الكاذب. يتم إقران إناث الفئران تقليديا بين عشية وضحاها مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر ، وفي صباح اليوم التالي ، يتم تقييم وجود سدادة الجماع. لزيادة كفاءة إنتاج الإناث الحوامل الزائفة ، تم توحيد تقنية التلاعب بعنق الرحم لاستخدامها مع نقل الأجنة غير الجراحي أو تقنيات التلقيح الاصطناعي في الفئران. يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة التشذيب. الإجراء سريع ولا يتطلب تخديرا أو تسكين. تزيد هذه التقنية من الموثوقية والقدرة على التنبؤ بإنتاج الإناث الحوامل الكاذبة وتلغي تماما متطلبات الذكور الذين تم استئصال الأسهر. بالنسبة للفئران CD1 ، كانت كفاءة تحريض الحمل الكاذب باستخدام معالجة عنق الرحم 83٪ للإناث في شبق (N = 76) ولكن تم توصيل 38٪ فقط من الإناث في شبق من قبل الذكور الذين تم استئصال الأسهر (N = 24). تم إجراء التلقيح الاصطناعي في الفئران CD1 عن طريق تزامن شبق مع الهرمونات ، والتلاعب عنق الرحم ، ونقل الرحم للحيوانات المنوية. كان لدى متلقي التلقيح الاصطناعي الذين يتلقون معالجة عنق الرحم (N = 76) معدل حمل 72٪ ومتوسط حجم فضلات يبلغ 8.3 جرو. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإنتاج إناث حوامل كاذبة لنقل الأجنة غير الجراحي. لذلك ، فإن تحفيز الحمل الكاذب عن طريق التلاعب بعنق الرحم هو بديل مناسب وفعال للتزاوج مع ذكر مقطوع الأسهر عند إجراء تقنيات الإنجاب المساعدة غير الجراحية. يوفر استخدام التلاعب بعنق الرحم فوائد 3Rs (الاستبدال والتقليل والصقل) لتقنيات الإنجاب المساعدة عن طريق تقليل عدد الحيوانات المطلوبة والقضاء على ضرورة الذكور المعدلة جراحيا.

Introduction

تستخدم تقنيات المساعدة على الإنجاب لإنتاج نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، وكذلك استعادة السلالات من الحفظ بالتبريد ، وإعادة اشتقاق السلالات من حالة صحية معرضة للخطر ، والإدارة الاستراتيجية لحظيرة الحيوان ، بما في ذلك إنتاج مجموعات متطابقة مع العمر. تتطلب جميع تقنيات الإنجاب المساعدة في الفئران استخدام متلقات من الإناث الحوامل الزائفات لنمو الجنين. تاريخيا ، تم إنشاء المتلقين الحوامل الزائفة عن طريق التزاوج مع الذكور العقيمة ، والتي إما استئصال الأسهر جراحيا أو العقم وراثيا ، ويتم تقييم وجود سدادة الجماع في صباح اليوم التالي¹. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير بروتوكول للتحفيز الصوتي في الفئران للنقل الجراحي لأجنة الفأر النووية أو ثنائية الخلية². لقد طورنا أيضا بروتوكول معالجة عنق الرحم (CM) للاستخدام مع التلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة غير الجراحي للأكياس الأريمية. الأساس المنطقي لاستخدام الإجراء هو توفير تخفيض 3Rs في عدد الحيوانات المطلوبة (لم تعد تتطلب ذكور الفئران) وصقل التقنيات المستخدمة (لم تعد تستلزم إجراء قطع القناة المنوية الجراحي لذكور الفئران). يتضمن وصف هذا البروتوكول تقنية المساعدة على الإنجاب المرتبطة للمساعدة في دمج CM في سير العمل العادي. الهدف العام من طريقة CM هو استبدال استخدام الفئران الذكور في توليد الإناث الحوامل الزائفة لتقنيات الإنجاب المساعدة ، بما في ذلك التلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة.

تم تطوير بروتوكول CM الموصوف هنا لأول مرة للمساعدة في التلقيح الاصطناعي في الفئران. حقق بروتوكول التلقيح الاصطناعي ، كما هو موضح في الأصل ، معدل حمل بنسبة 50 ٪ ، بمتوسط حجم القمامة من 7 الجراء³. كانت الفئران المتلقية CD1 متزامنة مع جرعة منخفضة من الهرمونات ، بما في ذلك موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG) وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) ، في فترة 47 ساعة قبل التلقيح. ومن مزايا التزامن الشبق أنه يسمح باستخدام البروتوكول خلال ساعات العمل العادية. تم إقران الإناث مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر مباشرة بعد التلقيح الاصطناعي ، وتم تأكيد التزاوج من خلال وجود سدادة الجماع. تم الإبلاغ عن عدم الاتساق في معدل التزاوج مع المتلقين كصعوبة في الإجراء. لذلك ، تم البحث عن بدائل للتزاوج لتحريض الحمل الكاذب.

تقدم هذه الدراسة تقنية CM موحدة لزيادة كفاءة إنتاج الإناث الحوامل الزائفة. بالنسبة للإناث في شبق أو شبق ، يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة تشذيب. يتم تنفيذ الإجراء على قفص يعلوه الأسلاك. لا حاجة للتخدير أو التسكين. تقنية CM ملائمة لإنتاج الإناث الحوامل الكاذبة ، والتي يمكن أن تنتج الفضلات بعد التلقيح الاصطناعي غير الجراحي دون الحاجة إلى التزاوج مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر. يمكن أيضا استخدام CM لإنتاج الإناث الحوامل الكاذبة كمتلقين لنقل الأجنة. على وجه التحديد ، يمكن إقران تقنية CM بنقل الأجنة غير الجراحي ، كما هو موضح هنا. لقد ثبت أن الطرق غير الجراحية فعالة في نقل الأجنة في مرحلة الكيسة الأريمية في الفئران^4,5 والجرذان ^6,7. نظرا لأن هذه الطريقة غير الجراحية هي بديل فعال للطرق الجراحية ، فإنها تعتبر صقلا 3Rs للتقنية. استنادا إلى الأبحاث السابقة ، تشير مستويات الكورتيكوستيرون البرازية ، كمقياس للإجهاد ، إلى أن الطبيعة غير الجراحية للإجراء لا تزيد من مستويات التوتر في القوارض ^7,8. الإجراءات أقل تحديا من الناحية الفنية من نقل الأجنة الجراحي وهي أسرع بكثير في الأداء. عندما يتم نقل الأجنة إلى الرحم ، يجب نقل أجنة المرحلة الصحيحة لتطور الرحم. بالنسبة للفئران ، يتم نقل الكيسات الأريمية إلى 2.5 يوم بعد الجماع (dpc) المتلقين الحوامل الزائفة.

بالنسبة للتقنيتين غير الجراحيتين الموصوفتين هنا ، يختلف توقيت إعطاء الهرمون وتقنية CM. توقيت إجراء CM بالنسبة إلى شبق مهم للنجاح ، لأنه يحل محل التزاوج الطبيعي لإنتاج المتلقين الكاذبة. من خلال القضاء على الحاجة إلى الذكور الذين تم استئصال الأسهر للحث على الحمل الكاذب ، يوفر هذا الإجراء فوائد 3Rs من خلال تقليل عدد الحيوانات المطلوبة والقضاء على ضرورة الذكور المعدلة جراحيا. الإجراء نفسه سريع (30 ثانية) ولا يتطلب تخديرا أو تسكين. تزيد هذه التقنية بشكل كبير من الموثوقية والقدرة على التنبؤ بإنتاج الإناث الحوامل الزائفات للمساعدة على الإنجاب.

Protocol

تم اتباع جميع المبادئ التوجيهية الدولية والوطنية والمؤسسية المعمول بها لرعاية الحيوانات واستخدامها. كانت جميع الإجراءات التي أجريت في الدراسات التي شملت الحيوانات متوافقة مع المعايير الأخلاقية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة لشركة ParaTechs Corporation وأجريت وفقا للمعايير التي يمليها مكتب رعاية المختبر ، والمعاهد الوطنية للصحة ، وخدمة الصحة العامة ، ووزارة الصحة والخدمات الإنسانية بالولايات المتحدة. تم استخدام ذكور وإناث CD1 (ICR) وإناث الفئران C57Bl / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين >8 أسابيع في هذه الدراسة. تم الحصول على الحيوانات من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).

1. إجراء التلاعب عنق الرحم للاستخدام مع التلقيح الاصطناعي في الفئران CD1

1. الإباضة المتزامنة للفئران الإناث في اليوم 1 واليوم 3
   1. حقن إناث الفئران ب 2.5 وحدة دولية PMSG (انظر جدول المواد) عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) في اليوم 1 ، 0.5 ساعة قبل بدء دورة بيت الحيوان المظلمة.
      ملاحظة: سيوفر كل متبرع ذكر ما يكفي من الحيوانات المنوية ل 10 متلقين من الإناث.
   2. حقن الإناث ب 2.5 وحدة دولية موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية (انظر جدول المواد) عن طريق حقن IP في اليوم 3 ، 1 ساعة قبل بدء دورة الظلام في بيت الحيوان.
      ملاحظة: توقيت الحقن ونقل الحيوانات المنوية ودورة الضوء بالنسبة لبعضها البعض مهمة جدا. تستند الأوقات المحددة لجميع الإجراءات في هذا البروتوكول إلى دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة.
2. جمع وسعة الحيوانات المنوية الطازجة في اليوم 4
   1. تحضير قطرة 500 ميكرولتر من وسط ما قبل حضانة الحيوانات المنوية (PM ، انظر جدول المواد) في طبق زراعة الأنسجة 60 مم تحت زيت البارافين. تحضير طبق واحد لكل متبرع ذكر. توازن لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ قبل جمع الحيوانات المنوية.
   2. في 1 ساعة بعد بدء دورة ضوء الحوض ، القتل الرحيم للذكور وفقا للإرشادات المؤسسية. سيوفر كل ذكر ما يكفي من الحيوانات المنوية ل 10 عمليات تلقيح صناعي.
   3. تشريح بسرعة البربخ الذيل من الماوس. قم بإجراء شق البطن المستعرض فوق المثانة باستخدام مقص التشريح والملقط المسنن.
      1. توجد ضمادات الدهون في الخصية على جانبي المثانة. أمسك إحدى وسادات دهون الخصية بالملقط المنحني ، وقم بإزالة الخصية والبربخ من تجويف الجسم. حدد البربخ الذيلي على أنه تركيب أنبوبي بيضاوي مسطح أسفل الخصية مباشرة.
      2. امسك البربخ الذيلي بالملقط المنحني ، واستأصله باستخدام مقص صغير بزاوية. قم بإزالة كل من البربخ الذيلية ، ونقلها إلى نسيج ماص لإزالة الدهون والدم تحت مجهر تشريح.
   4. ضع اثنين من الذيول البربخ في كل قطرة 500 ميكرولتر من الجسيمات المتوازنة تحت زيت البارافين عند 37 درجة مئوية. قطع الأنسجة عن طريق عمل ستة شقوق باستخدام مقص صغير. إذا تم استخدام أكثر من متبرع ذكر، فاستخدم بربخا واحدا من كل متبرع لكل عينة من الحيوانات المنوية لتقليل التباين بين العينات.
   5. قم بتدوير الطبق برفق ، واسمح للحيوانات المنوية بالخروج من الأنسجة لمدة 3 دقائق ، مع الدوران مرة واحدة في الدقيقة. إزالة جميع الأنسجة.
   6. احتضان عينة الحيوانات المنوية لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ للسعة.
   7. اختياري: قياس عدد الحيوانات المنوية ، وتقييم الحركة تحت المجهر باستخدام مقياس الدم. للعد ، قم بتخفيف الحيوانات المنوية في PM حسب الحاجة.
3. تأكيد تزامن الدورة الشحمية عن طريق التقييم الخلوي
   1. باستخدام مسحة صغيرة مبللة مسبقا (انظر جدول المواد) ، اجمع الخلايا المهبلية برفق من جدار المهبل عن طريق لف المسحة على الأنسجة ، وقم بتشويهها في قطرة 20 ميكرولتر من الماء المعقم على شريحة مجهرية ، وجففها في الهواء.
   2. تحت المجهر باستخدام تكبير 100x مع إضاءة المجال الساطع ، قم بتقييم وجود الخلايا الظهارية المتقرنة. الإناث في شبق أو في وقت متأخر سوف يكون لها خلايا ظهارية متقرنة موجودة ويجب اختيارها لمعالجة عنق الرحم.
   3. اختياري: سجل وزن المتلقات الإناث قبل التلقيح.
4. إجراء التلاعب عنق الرحم (CM)
   1. قبل حوالي 0.5 ساعة من التلقيح ، ضع أنثى متلقية على قمة قفص برف سلكي ، مما يسمح للماوس "بالاستيلاء" على سطح شريط القفص. أمسك بالقرب من قاعدة الذيل باستخدام الإبهام والسبابة وقم بزاوية الذيل لأعلى مع تثبيت الحيوان (الشكل 1).
      ملاحظة: سيبقى الماوس ثابتا طوال مدة الإجراء عند تنفيذ تقنية المعالجة بشكل صحيح. إذا تحرك الماوس خارج موضعه ، فقم بتغيير موضعه برفق والمتابعة. إذا تم اختيار عدواني كمتلقي ، فإن السماح للحيوان بالدخول إلى نفق التخصيب أثناء الإجراء يمكن أن يكون مهدئا. يعد استخدام النفق أمرا اختياريا ، ولكنه يمكن أن يساعد الباحثين في التعامل مع الحيوانات من خلال توفير إلهاء أثناء هذا الإجراء.
   2. أدخل الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير (انظر جدول المواد) عن طريق المهبل للتلامس مع عنق الرحم ، واهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة تشذيب (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: ضع القضيب في موضعه قبل بدء أداة التشذيب. كلاهما يحملان بيد واحدة أثناء العملية. لا حاجة للتخدير أو التسكين.
5. نقل الحيوانات المنوية غير الجراحية للتلقيح الاصطناعي
   1. ضع جهاز التلقيح (انظر جدول المواد) على ماصة P200 مضبوطة على 40 ميكرولتر ، وقم بإزالة الغطاء الواقي.
   2. قم بإزالة حصة عينة الحيوانات المنوية السعوية من الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ ، وانقلها إلى طبق زراعة الأنسجة 35 مم بدون زيت عند 37 درجة مئوية. سيتم استخدام عينة الحيوانات المنوية على الفور لنقلها.
      ملاحظة: سوف تفقد الحيوانات المنوية حركتها بسرعة خارج حاضنة CO₂ . الحفاظ على عينة الحيوانات المنوية السعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ قدر الإمكان.
   3. اضغط على مكبس الماصة إلى المحطة الأولى ، واخفض طرف القسطرة في عينة الحيوانات المنوية عند 37 درجة مئوية ، وقم بتحميل الحيوانات المنوية ببطء في جهاز النقل. تجنب أي كتل. قم بإزالة الزيت المتبقي من الجزء الخارجي لجهاز التلقيح باستخدام نسيج ماص. توضع جانبا ماصة.
      ملاحظة: يجب تجنب نقل زيت البارافين إلى قرن الرحم. قم بإزالة الزيت المتبقي من الجزء الخارجي لجهاز التلقيح باستخدام نسيج ماص.
   4. ضع الأنثى المتلقية على أعلى قفص الرف السلكي. أمسك الماوس في موضعه باستخدام نفس تقنية المناولة المستخدمة في CM ؛ أمسك بالقرب من قاعدة الذيل باستخدام الإبهام والسبابة ، وقم بزاوية الذيل لأعلى مع تثبيت الحيوان.
   5. ضع المنظار الصغير (انظر جدول المواد) في المهبل.
   6. أدخل قسطرة جهاز التلقيح في المنظار ، من خلال عنق الرحم ، وفي الرحم. بمجرد اتصال محور الجهاز بالمنظار ، قم بتوزيع الحيوانات المنوية عن طريق الضغط على مكبس الماصة إلى المحطة الأولى. تجنب نقل الهواء الزائد إلى قرن الرحم.
      ملاحظة: إذا لم يتم وضع القسطرة بشكل صحيح ، فسوف تصطدم بالأنسجة المحيطة بعنق الرحم ، مما يؤدي إلى ثنيها وثنيها في النهاية. إذا لم تنزلق القسطرة عبر عنق الرحم في المحاولة الأولى ، فقم بإرجاع القسطرة برفق للخارج ، وأعد المحاولة حتى تنجح. قد يكون من الضروري إعادة وضع المنظار.
   7. قم بإزالة الجهاز والمنظار. لا يلزم مراقبة ما بعد الإجراء.
6. اختياري: فحص الحمل في الأيام 10-12
   1. استخدم زيادة الوزن لتحديد حالة الحمل. تعتمد زيادة الوزن على الإجهاد ، لكن الزيادة التي لا تقل عن 1-2 غرام ترتبط بالحمل.

الشكل 1: تقنية الإمساك بالماوس لمعالجة عنق الرحم. يقع الماوس على قمة قفص سلكي ويتم تثبيته عند الذيل وعلى كلا الجانبين في مقدمة الأرجل الخلفية. يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز عن طريق ملامسة أداة تشذيب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. إجراء نقل الأجنة غير الجراحي للاستخدام مع التلاعب بعنق الرحم في الفئران CD1

1. الإباضة المتزامنة للفئران الإناث في اليوم 1 واليوم 3
   1. حقن الفئران الإناث مع 2.5 وحدة دولية PMSG عن طريق حقن IP في اليوم 1 ، حوالي 6 ساعات بعد بدء دورة ضوء بيت الحيوان.
   2. حقن الإناث ب 2.5 وحدة دولية موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية عن طريق حقن IP في اليوم الثالث ، في فترة 47 ساعة بعد حقن PMSG أو حوالي 5 ساعات بعد بدء دورة ضوء بيت الحيوان.
2. تأكيد تزامن الدورة الشحمية عن طريق التقييم الخلوي
   1. في اليوم 3 ، حوالي 1 ساعة قبل CM ، قم بإجراء علم الخلايا على المتلقين المحتملين. باستخدام مسحة صغيرة مبللة مسبقا ، اجمع الخلايا المهبلية برفق من جدار المهبل عن طريق لف المسحة على الأنسجة ، وقم بتشويهها في قطرة 20 ميكرولتر من الماء المعقم على شريحة مجهرية ، وجففها في الهواء.
   2. تحت المجهر باستخدام تكبير 100x مع إضاءة المجال الساطع ، قم بتقييم وجود الخلايا الظهارية المتقرنة. الإناث في شبق أو في وقت متأخر سوف يكون لها خلايا ظهارية متقرنة موجودة ويجب اختيارها لمعالجة عنق الرحم.
   3. اختياري: سجل وزن متلقي الأجنة الإناث المحتملات.
3. أداء CM
   1. في اليوم 3 ، 1 ساعة قبل بدء دورة بيت الحيوان المظلمة ، ضع أنثى مستلمة على قمة قفص برف سلكي ، مما يسمح للحيوان "بالاستيلاء" على سطح شريط القفص. أمسك بالقرب من قاعدة الذيل باستخدام السبابة والإبهام ، ثم قم بزاوية الذيل لأعلى أثناء تثبيت الحيوان (الشكل 1).
      ملاحظة: سيبقى الماوس ثابتا طوال مدة الإجراء عند تنفيذ تقنية المعالجة بشكل صحيح. إذا تحرك الماوس خارج موضعه ، فقم بتغيير موضعه برفق ، وتابع. إذا تم اختيار عدواني كمتلقي ، فإن السماح للحيوان بالدخول إلى نفق التخصيب أثناء الإجراء يمكن أن يكون مهدئا.
   2. أدخل الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ، واهتزه لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة التشذيب.
      ملاحظة: ضع القضيب في موضعه قبل بدء أداة التشذيب. كلاهما يحملان بيد واحدة أثناء العملية. لا حاجة للتخدير أو التسكين.
4. نقل الأجنة غير الجراحي في اليوم 6
   1. ضع قطرة 20 ميكرولتر من وسط M2 (انظر جدول المواد) على غطاء طبق زراعة الأنسجة.
      ملاحظة: يتم اختيار الغطاء لأنه يحتوي على حافة أقصر ، وبالتالي فهو مناسب للوصول إلى الأجنة في القطرة. لا تقم في أي وقت بوضع زيت البارافين فوق قطرة M2 ، حيث يبدو أن إدخال الزيت في قرن الرحم يؤثر سلبا على نقل الأجنة.
   2. تحت المجهر وباستخدام الإضاءة العاكسة ، قم بتحميل 10-20 كيسة أريمية في قطرة متوسطة باستخدام ماصة قياسية للتعامل مع الجنين (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يعتمد العدد الأمثل للأجنة المراد نقلها على سلالة الفأر وأي تلاعب خضعت له الأجنة. بالنسبة للأجنة السليمة غير المعالجة ، يجب أن يكون نقل 10-15 جنينا كافيا. لإعادة الاشتقاق أو الأجنة المعدلة وراثيا ، يكون نقل المزيد من الأجنة مناسبا.
   3. قم بتثبيت جهاز نقل الأجنة غير الجراحي (انظر جدول المواد) على ماصة P2 مضبوطة على 1.8 ميكرولتر. قم بإزالة غطاء القسطرة الواقي.
   4. اضغط على مكبس الماصة إلى المحطة الأولى ، وخفض طرف القسطرة في الوسط ، واسحب الأجنة ببطء إلى طرف قسطرة الجهاز. قم بإزالة الطرف من الوسط.
      ملاحظة: سيسمح تصور الأجنة تحت التكبير المنخفض بتحميل الأجنة بسهولة في الجهاز. إذا كانت الأجنة مبعثرة في القطرة ، هز الطبق برفق من جانب إلى آخر لتركيز الأجنة في وسط القطرة ، أو أعد وضعها باستخدام ماصة مناولة الجنين.
   5. اضبط حجم الماصة على 2.0 ميكرولتر لتوليد فقاعة هواء صغيرة عند طرف القسطرة. ضع الماصة برفق مع تحميل الأجنة بالقرب من قفص الفأر.
   6. ضع الأنثى المتلقية على أعلى قفص الرف السلكي. أمسك الماوس في موضعه باستخدام نفس تقنية المناولة المستخدمة في CM ؛ أمسك بالقرب من قاعدة الذيل باستخدام السبابة والإبهام ، ثم قم بزاوية الذيل لأعلى مع تثبيت الحيوان.
   7. ضع منظارا صغيرا (انظر جدول المواد) في المهبل.
   8. أدخل قسطرة جهاز النقل في المنظار ، من خلال عنق الرحم ، وفي الرحم. بمجرد اتصال محور الجهاز بالمنظار ، قم بتوزيع الأجنة عن طريق الضغط على مكبس الماصة إلى المحطة الأولى. تجنب نقل الهواء الزائد إلى قرن الرحم.
   9. دون تحرير مكبس الماصة ، قم بإزالة الجهاز والمنظار. لا يلزم مراقبة ما بعد الإجراء.

النتائج

نظرا لاستخدام التحفيز الكهربائي⁹ والصوتي¹⁰ لعنق الرحم للحث على الحمل الكاذب في الفئران ، يقدم هذا العمل إجراء ميكانيكيا موحدا يمكن استخدامه في الفئران. يمكن أن يساعد علم الخلايا المهبلية في تحديد الإناث في مراحل مختلفة من الشهوة. لتأكيد الحمل الكاذب عند الإناث ، تم استخدام هذه الطريقة نفسها. أولا ، تمت مقارنة ملامح علم الخلايا للإناث للفئران CD1 و C57Bl / 6 طوال الدورات الشحمية ، أثناء الحمل ، وأثناء الحمل الكاذب الناجم عن التزاوج أو CM. تم أخذ مسحات مهبلية من الإناث وصبغها باستخدام نظام تلطيخ Papanicolaou (انظر جدول المواد). لوحظت الخلايا تحت تكبير 100x مع إضاءة المجال الساطع. تضمنت الخلايا التي لوحظت كريات الدم البيضاء والخلايا الظهارية النواة والخلايا الظهارية غير المنوية. استند تحديد مرحلة الدورة الشحمية إلى النسبة النسبية لكل نوع خلية^11,12. يتميز شبق بغلبة الخلايا الظهارية المتقرنة. مع انتهاء الشبق ، يبدأ metestrus ، وتبدأ الكريات البيض في الظهور ، بينما تصبح الخلايا الظهارية المتقرنة أقل وضوحا. يحتوي Diestrus على خلوية معتدلة إلى منخفضة ، مع هيمنة الكريات البيض وبدأت الخلايا الظهارية النواة في الظهور. يتميز Proestrus بفقدان الكريات البيض ، وزيادة في الخلايا الظهارية النواة ، وظهور الخلايا الظهارية المتقرنة. بعد الشبق ، يبدأ الشبق ، وتستمر الدورة.

لتطوير ملف تعريف خط الأساس ، تم تسجيل علم الخلايا المهبلي لدورتين كاملتين على الأقل لكل أنثى (N = 20 ل CD1 ، N = 20 ل C57Bl / 6) قبل التزاوج. اختلفت أطوال الدورات والملامح الفردية بين الفئران. ومع ذلك ، لوحظت الاتجاهات العامة المتوقعة. كان متوسط طول الدورة الشحمية للفئران CD1 و C57Bl / 6 3.8 يوما ، مع نطاق من 3-5 أيام. في اليوم السابق لحدوث التزاوج الطبيعي ، كانت جميع الفئران الإناث في حالة شبق. بعد التزاوج ، تم إجراء علم الخلايا مرة أخرى بعد 1.5 يوم من الجماع (dpc) حتى استؤنف ركوب الدراجات الشهوانية. يوضح الشكل 2 المظهر الخلوي للإناث CD1 و C57Bl / 6 الحوامل الكاذبة المتزاوجة مع الذكور التي تم استئصال الأسهر.

الشكل 2: الملف الخلوي لإناث الفئران الكاذبة الحامل. يتم عرض متوسط النسب المئوية لكل نوع من أنواع الخلايا للكريات البيض والخلايا الظهارية النواة والخلايا الظهارية المتقرنة كدالة لأيام ما بعد الجماع (DPC) ل (A) CD1 (N = 20) و (B) C57Bl / 6 (N = 20) الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذا العمل ، تم توحيد تقنية CM لزيادة كفاءة إنتاج الإناث الحوامل الزائفة. بالنسبة للإناث في شبق أو شبق ، يتم إدخال الطرف الحاد لقضيب بلاستيكي صغير عن طريق المهبل للاتصال بعنق الرحم ويهتز لمدة 30 ثانية عن طريق ملامسة أداة تشذيب. يتم تنفيذ الإجراء على قفص يعلوه الأسلاك. لا حاجة للتخدير أو التسكين. لتحديد فعالية إجراء CM ، تمت مقارنة علم الخلايا المهبلية لإناث CD1 (N = 20) و C57Bl / 6 (N = 20) الفئران بعد التزاوج مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر وبعد CM (المجموع N = 40). كان المظهر الخلوي للحمل الكاذب الناجم عن CM مشابها لملف الحمل الكاذب الناجم عن التزاوج ، كما هو موضح في الشكل 3.

الشكل 3: الملف الخلوي لإناث الفئران الحامل الكاذبة بعد التلاعب بعنق الرحم (CM). تظهر النسبة المئوية لكل نوع من أنواع الخلايا للكريات البيض والخلايا الظهارية النواة والخلايا الظهارية المتقرنة كدالة لأيام ما بعد الجماع (DPC) أو أيام ما بعد التلاعب بعنق الرحم (DPCM). يتم عرض متوسط النسب المئوية لنوع الخلية للفئران CD1 و C57Bl / 6 (N = 40) (A) المتزاوجة مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر أو (B) بعد CM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لتحديد ما إذا كانت تقنية CM كافية لإثبات الحمل للمساعدة على الإنجاب ، تم إجراء CM كجزء من بروتوكول التلقيح الاصطناعي غير الجراحي (NSAI) في إناث CD1. تضمن بروتوكول التلقيح الاصطناعي تزامن شبق الإناث مع جرعة منخفضة من هرمونات PMSG و hCG قبل نقل الحيوانات المنوية. تم إجراء CM قبل نقل الحيوانات المنوية مباشرة. بالنسبة للفئران CD1 ، كانت كفاءة تحريض الحمل الكاذب باستخدام CM للإناث في شبق (N = 76) مع هذه التقنية 83٪. في تجربة مراقبة ، تم توصيل 38٪ فقط من الإناث في شبق من قبل الذكور الذين تم استئصال الأسهر (N = 24). كان لدى متلقي التلقيح الاصطناعي الذين يتلقون معالجة عنق الرحم (N = 76) معدل حمل 72٪ ومتوسط حجم فضلات يبلغ 8.3 جرو. وبالتالي ، فإن تحريض الحمل الكاذب بواسطة CM هو بديل مناسب وفعال للتزاوج مع ذكر قطع القناة المنوية عند إجراء NSAI. أدى استخدام CM لإعداد متلقي CD1 (N = 4) في شبق لنقل الأجنة غير الجراحية للأكياس الأريمية CD1 الطازجة إلى معدل حمل بنسبة 100٪. أسفر نقل 9-15 جنينا عن ثلاثة فضلات صحية بمعدل مواليد 45٪ ومتوسط حجم فضلات يبلغ 6 جراء. وبالمقارنة ، فإن متلقي CD1 (N = 20) الذين تم تزويجهم مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر للحث على الحمل الكاذب كان لديهم معدل حمل 80٪ ومعدل مواليد 46٪ بعد نقل 20 كيسا أريما جديدا B6C3F2.

من المحتمل أن تكون نتائج تقنيات الإنجاب المساعدة خاصة بالإجهاد ، حيث تم العثور على متغيرات مثل جرعة وتوقيت إعطاء الهرمونات للإباضة الفائقة تعتمد على^{الإجهاد 13}. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر عوامل مثل عمر المتلقي والوزن على رد الفعل على الهرمونات¹⁴. في هذا العمل ، عند إجراء إجراء CM للتلقيح الاصطناعي ، تم العثور على الإناث فقط في الشبق المتأخر أو الشبق للاستجابة. بشكل عام ، لزيادة عدد المتلقين المتاحين في السكان ، يتم أولا مزامنة الإناث مع جرعة منخفضة من الهرمونات³. كان تزامن الشبق مع 2.5 وحدة دولية من PMSG و hCG فعالا بنسبة 78٪ لإناث CD1 بعمر 11-14 أسبوعا (N = 27) و 60٪ فعال لإناث C57Bl / 6 بعمر 18-32 أسبوعا (N = 22) في هذا العمل. كانت كفاءة تحريض الحمل الكاذب باستخدام معالجة عنق الرحم على إناث CD1 83٪ للإناث في شبق (N = 76) و 82٪ (N = 100) للإناث C57Bl / 6 في شبق مع هذه التقنية.

Discussion

3Rs هو إطار أخلاقي لاستخدام الحيوانات في البحث ، كما هو موضح في عام 1959 من قبل راسل وبورش في "مبادئ التقنية التجريبية الإنسانية"¹⁵. تمثل 3Rs الاستبدال والتقليل والصقل في استخدام الحيوانات. تتوافق البروتوكولات الموضحة هنا مع 3Rs. تقلل تقنية التلاعب بعنق الرحم من عدد الحيوانات التي تحتاجها من خلال عدم الحاجة إلى استخدام الذكور لإنتاج إناث كاذبة الحوامل. تلغي هذه التقنية أيضا الحاجة إلى إجراء قطع القناة المنوية على الذكور ، وبالتالي توفير الصقل عن طريق تقليل الألم والضيق. تقنيات الإنجاب المساعدة الموصوفة هنا (التلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة) غير جراحية ، وبالتالي ، يوفر كلاهما صقلا 3Rs عن طريق تقليل الألم والضيق⁸الناجم عن بدائلهما الجراحية.

يعد استخدام الإناث الحوامل الزائفات ضروريا لاستعادة الجراء عند إجراء المساعدة على الإنجاب في الفئران¹. يعد إجراء CM طريقة فعالة لإنتاج الإناث الحوامل الزائفات ، ولكن تزامن مرحلة الدورة الشحمية للإناث المتلقيات هو خطوة أولى حاسمة في العملية. يمكن أن يقلل التزامن الوحشي بشكل كبير من عدد الإناث اللازمة في المستعمرة لإعداد المتلقين المحتملين ويساعد في إنتاج إناث حاملات كاذبة موقوتة عند الطلب. لا يبدو أن استخدام جرعة منخفضة من الهرمونات يسبب أي آثار ضارة على استعادة الفضلات الحية في الفئران CD1. يجب توخي الحذر مع السلالات الأخرى للعثور على مزيج الهرمون والتركيز الذي ينتج أفضل الإناث المتلقية للأجنة أو الحيوانات المنوية المنقولة. يمكن تحقيق التزامن باستخدام PMSG و hCG¹⁶ ، لكن الجرعات التي تنتج إناثا مفرطة التبويض قد لا تكون مناسبة للحمل المستمر¹⁷.

لتحديد ما إذا كانت الأنثى في شبق ، تم إجراء تقييم خلوي في هذا العمل. يمكن أيضا تقييم المرحلة الشحمية من خلال ملاحظة الفتحة المهبلية^11,18. في حين أن هذه الطريقة مفيدة للغاية ويمكن استخدامها بمفردها أو كتأكيد ، إلا أنها أكثر ذاتية من استخدام علم الخلايا. علم الخلايا المهبلية دون تلطيخ سريع وفعال على حد سواء لاختيار الإناث في شبق لأنه يمكن التعرف على الخلايا الظهارية المتقرنة بسهولة. في هذا البروتوكول ، يتم إجراء التقييم الخلوي قبل CM لتحديد المتلقين المحتملين. من المهم إجراء علم الخلايا قبل CM ، حيث يميل الإجراء إلى تفتيت الخلايا المقطوعة من منطقة المهبل ، مما يجعل التعرف عليها صعبا. يمكن إجراء التقييم الخلوي للحمل الكاذب أو الحمل في 3.5-11.5 يوما بعد CM (dpcm) لمدة 3 أيام متتالية. يجب أن يكون الملف الشخصي للإناث ركوب الدراجات الشهوقة على الأقل 1 يوم مع تسلل كبير للخلايا الظهارية المتقرنة. يجب أن تظهر الإناث الحوامل / الحوامل الزائفات ملف تعريف diestrus (في الغالب كريات الدم البيضاء مع عدد خلايا منخفض محتمل) لمدة 3 أيام متتالية.

من خلال تطوير تقنية CM ، وجد أن بعض الفئران أكثر تقبلا للإجراء من غيرها. تعتبر إناث الفئران CD1 مرشحة ممتازة بسبب طبيعتها الهادئة وغرائزها المغذية الممتازة. من السهل التعامل مع هذه السلالة وتعمل بشكل جيد أثناء تقنيات CM وتقنيات الإنجاب المساعدة غير الجراحية. تميل الفئران C57Bl / 6 إلى أن تكون أكثر عدوانية وأقل رعاية. في حين أن هذا البروتوكول أنتج بشكل فعال إناث C57Bl / 6 الحامل الزائف باستخدام CM ، إلا أنهن كن أقل عرضة للتساهل باستمرار مع الإجراء. يبدو أن هذا يرتبط إلى حد ما بالمرحلة الشحمية خلال CM. كانت الإناث في شبق أو شبق أكثر تقبلا. سمح استخدام أنبوب التخصيب للحيوان بالدخول إلى الوصول إلى المهبل لإجراء العملية وساعد على تهدئة الأنثى. الإجراء نفسه لا يقيد الأنثى تماما ، لذلك يمكن للحيوان الانسحاب في أي وقت. إذا حدث هذا ، يمكن إعادة وضع الحيوان ، ويمكن بعد ذلك متابعة الإجراء. يتوقف توقيت الإجراء إذا ابتعدت الأنثى واستأنفت عند استئناف الإجراء. من الأمور الحاسمة لنجاح الإجراء مرحلة الدورة الشحمية (الشبق المتأخر والشبق) واتصال القضيب بعنق الرحم. يوفر اهتزاز ماكينة القطع CM قياسية. لضمان ملامسة عنق الرحم ، يتم تطبيق ضغط لطيف على القضيب ، ويتم ضمان وضع القضيب مقابل عنق الرحم بحركات صغيرة ذهابا وإيابا للقضيب.

أدى استخدام CM إلى تحسين بروتوكول NSAI ، حيث يمكن اختيار الإناث في المرحلة الصحيحة من الدورة الشحمية قبل نقل الحيوانات المنوية ، ولم يعد البروتوكول مشروطا بالتزاوج مع الذكور الذين تم استئصال الأسهر. يتم توقيت تزامن دورة التلقيح الاصطناعي بحيث يتوافق نضوج البويضة مع نقل الحيوانات المنوية في صباح اليوم 4. من الأمور الحاسمة لنجاح البروتوكول تكييف توقيت الإباضة بحيث يمكن أن يحدث الإخصاب. يجب توخي الحذر لإدارة هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية 15-17 ساعة قبل النقل المتوقع للحيوانات المنوية ، كما هو مقترح للتوقيت المستخدم للتخصيب في المختبر ¹. ستؤثر جودة عينة الحيوانات المنوية بشكل مباشر على نتيجة التلقيح الاصطناعي. الحيوانات المنوية الطازجة التي تم سعتها ستعمل بشكل أفضل. يمكن للحيوانات المنوية المحفوظة بالتبريد ذات النوعية الجيدة إنتاج أجنة مخصبة في الجسم الحي. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند النقل المباشر للحيوانات المنوية المذابة ، لأن المواد الواقية بالتبريد المتبقية المنقولة إلى قرن الرحم قد تمنع الزرع (ملاحظات غير منشورة).

يعد استخدام CM جنبا إلى جنب مع نقل الأجنة تكيفا سهلا من الناحية المفاهيمية. يقلل تزامن الدورة Estrous من عدد الإناث اللازمة لإنتاج مجموعة المستلمين. تحديد المرحلة الشهوانية قبل CM يزيد من احتمال الحصول على المتلقين الحوامل الزائفة. عيب واحد من هذه الطريقة هو أن علم الخلايا من المتلقين في وقت نقل الأجنة هو في مرحلة من التغير. جميع أنواع الخلايا موجودة إذا كانت الأنثى تنتقل من شبق إلى ملف الحمل الكاذب ، ويصبح الحمل الكاذب واضحا فقط إذا تم تتبع علم الخلايا لعدة أيام. استنادا إلى نجاح (>80٪) في الانتقال من شبق إلى الحمل الكاذب للفئران CD1 و C57Bl / 6 ، من المتوقع أن تكون هذه الطريقة مناسبة لمتلقي نقل الأجنة. تظهر النتائج الأولية نجاحا جيدا مع نقل الأجنة غير الجراحي المحدود. بشكل عام ، فإن كفاءة نقل الأجنة غير الجراحية قابلة للمقارنة مع التقنية الجراحية ^4,5 ، ويمكن أن يحل النقل غير الجراحي محل عمليات نقل الأجنة الجراحية في مرحلة الكيسة الأريمية. بالنسبة للأجنة في المراحل المبكرة ، يلزم زراعة الأجنة إلى مرحلة الكيسة الأريمية. ومع ذلك ، إذا كان النقل الجراحي مفضلا ، فمن الممكن تكييف تقنية CM مع التوقيت الصحيح اللازم للمتلقات الحوامل الزائفات^{المناسبات 2}. بشكل عام ، فإن متلقي الجنين هم 1 يوم أقل تقدما من الجنين. على سبيل المثال ، يتم حصاد الكيسات الأريمية عند 3.5 dpc من المتبرعين ونقلها إلى 2.5 متلقي dpc. لذلك ، يجب إجراء CM بحيث يكون المتلقي في حالة حمل زائف أقل تطورا من الأجنة.

في الختام ، تظهر تقنية CM الموضحة هنا وعدا ممتازا للتكامل مع تقنيات الإنجاب المساعدة الأخرى للفئران. لقد قدمنا بروتوكولات ناجحة للتلقيح الاصطناعي ونقل الأجنة باستخدام تقنيات غير جراحية. مجتمعة ، توفر تقنية CM مزايا 3Rs ، بما في ذلك (1) تقليل عدد الحيوانات من خلال القضاء على الحاجة إلى الذكور الذين تم استئصال الأسهر و (2) تحسين التقنيات عن طريق استبدال التقنيات الجراحية ببدائل غير جراحية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blastocyst stage embryos
CARD Fertiup Preincubation Medium (PM)	CosmoBio	KYD-002-EX	For sperm capacitation
Embryo handling pipette	Cook Medical	K-FPIP-1120-10BS	Flexipet is available in various diameters
Embryo handling pipette assembly	Paratechs	90010
Female mice, Crl:CD1(ICR)	Charles River Laboratories	22	>8 weeks old
Forceps	Fine Science Tools	11053-10	Toothed, for dissection
Forceps	Fine Science Tools	11052-10	Curved, for dissection
Forceps	Fine Science Tools	Dumont #5	Fine, for dissection
Hemocytometer	Fisher Scientific	267110	Optional
human Chorionic Gonadotropin (hCG)	Prospec	hor-250	For estrus synchronization
Incubator, 37 °C 5% CO2	Thermo Scientific
Incubator, 37 °C, benchtop	Cook	K-MINC-1000
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155	Absorbant tissues
M2 medium	Millipore	MR-015-D	Embryo handling medium
Male mice, Crl:CD1(ICR)	Charles River Laboratories	22	>8 weeks old
mC&I device	ParaTechs	60020	For sperm transfer, specula included
mCM rod	ParaTechs	90050	Smooth, blunt, with a diameter @3 mm
Microscope	Olympus	SZX7	20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections
Microscope	ACCU-SCOPE	3032	100x magnification with bright field illumination
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-7
mNSET device	ParaTechs	60010	For embryo transfer, specula included
Needles, 26 G	Exel	26402
Papanicolaou Staining System	VWR	76265-730	Optional
Paraffin oil	Sigma-Aldrich	18512
Pipette, P200	Corning	4074	Fits the C&I device for sperm transfer
Pipette, PR-2	Rainin	17008648	Fits the NSET device for embryo transfer
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)	Prospec	hor-272	For estrus synchronization
Scale	American Weigh Scales	LB-1000
Scissors	Fine Science Tools	14068-12	Dissection
Scissors	Fine Science Tools	14081-09	Angled, dissection
Swabs, Constix	Contec	SC-4	For vaginal cytology
Syringes, 1 cc	Becton Dickenson and Company	309659
Tissue culture dishes, 35 mm	Falcon	353001
Tissue culture dishes, 60 mm	Falcon	353004
Trimmer	Wahl	ChroMini T-Cut
Wire bar topped mouse cage