JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لوصف amplicon metagenomic لتحديد المجتمع البكتيري لعنب Traminette والعنب المخمر والنبيذ النهائي.

Abstract

أدى التقدم في تكنولوجيا التسلسل وسهولة الوصول نسبيا إلى استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية لتحديد هياكل المجتمع الميكروبي إلى تسهيل فهم أفضل لكل من الميكروبات القابلة للزراعة وغير القابلة للزراعة في العنب والنبيذ. أثناء التخمير الصناعي ، غالبا ما تكون الميكروبات ، المعروفة وغير المعروفة ، مسؤولة عن تطوير المنتج وخارج النكهة. لذلك ، فإن تنميط البكتيريا من العنب إلى النبيذ يمكن أن يتيح فهما سهلا للديناميكيات الميكروبية في الموقع . في هذه الدراسة ، يجب أن تخضع بكتيريا عنب Traminette للتخمير ، وتعرض النبيذ النهائي لاستخراج الحمض النووي الذي أسفر عن 15 نانوغرام / ميكرولتر إلى 87 نانوغرام / ميكرولتر. تم تسلسل amplicon 16S للمنطقة شديدة التغير في منطقة V4 ، وهي بكتيريا وفيرة نسبيا تتكون من شعب Proteobacteria و Actinobacteriota و Firmicutes و Bacteroidota و Fusobacteriota وتليها Verrucomicrobiota و Halobacterota و Desulfobacterota و Myxococcota و Acidobacteriota. كشف تحليل مخطط فين للوحدات التصنيفية التشغيلية الفريدة المشتركة (OTU) أن 15 شعبة بكتيريا كانت مشتركة بين كل من العنب ومرحلة التخمير والنبيذ النهائي. تم الكشف عن الشعب التي لم يتم الإبلاغ عنها سابقا باستخدام تسلسل amplicon 16S ، وكذلك أجناس مثل Enterobacteriaceae و Lactobacillaceae. تم اختبار التباين في استخدام المغذيات العضوية في النبيذ وتأثيره على البكتيريا. خزان Traminette R يحتوي على Fermaid O و Traminette L محفز مع Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. حدد تنوع ألفا باستخدام اختبار Kruskal-Wallis درجة التكافؤ. أشار تنوع بيتا إلى حدوث تحول في البكتيريا في مرحلة التخمير للعلاجين ، وبدت بكتيريا النبيذ النهائية متشابهة. أكدت الدراسة أنه يمكن استخدام تسلسل 16S amplicon لمراقبة تغيرات البكتيريا أثناء إنتاج النبيذ لدعم الجودة والاستخدام الأفضل لبكتيريا العنب أثناء إنتاج النبيذ.

Introduction

يتميز عنب Traminette بإنتاج جودة نبيذ فائقة ، بالإضافة إلى محصول ملموس ومقاومة جزئية للعديد من الالتهابات الفطرية1،2،3. يعتمد التخمير الطبيعي للعنب على الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة به ، وبيئة إنتاج النبيذ ، وأوعية التخمير 4,5. في كثير من الأحيان ، تعتمد العديد من مصانع النبيذ على الخميرة البرية والبكتيريا للتخمير وإنتاج الكحول والإسترات والرائحة وتطوير النكهة6.

الهدف من هذه الدراسة هو فحص التركيب البكتيري للعنب ومراقبة ديناميكياته أثناء التخمير. على الرغم من أن الاستخدام الحديث للثقافات البادئة مثل Saccharomyces cerevisiae للتخمير الأولي ، حيث يتم إنتاج الكحول ، أمر شائع في أنماط النبيذ المختلفة7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التخمير الثانوي ، حيث يتم نزع الكربوكسيل من حمض الماليك بواسطة Oenococcus oeni إلى حمض اللبنيك ، يحسن المظهر الحسي والذوق للنبيذ ويقلل من حموضة النبيذ 8,9. مع التطورات الحديثة في استخدام الأساليب المستقلة عن الثقافة ، أصبح من الممكن الآن تحديد الميكروبات المختلفة المرتبطة بعنب النبيذ والأنواع التي يتم نقلها إلى يجب والمشاركة في التخمير في أوقات مختلفة حتى المنتج النهائي10.

إن أدوار وديناميات البكتيريا البرية من العنب المختلفة المنقولة إلى الضرورة أثناء تخمير النبيذ غير مفهومة بشكل جيد. تصنيف العديد من هذه البكتيريا غير معروف حتى ، أو أن خصائصها المظهرية غير مميزة. وهذا يجعل تطبيقها في تخمير الاستزراع المشترك لا يزال غير مستغل بشكل جيد. ومع ذلك ، فقد تم استخدام التحليل القائم على الثقافة الميكروبيولوجية لتحديد عدد البكتيريا المرتبطة بالعنب والنبيذ10. من المعروف على نطاق واسع أن طلاء الثقافة الانتقائية ممل ، وعرضة للتلوث ، وله قابلية استنساخ منخفضة ، ويمكن أن يكون الإنتاج مشكوكا فيه ؛ كما أنه يفتقد الأنواع البكتيرية التي لا تعرف متطلبات نموها. تشير الدراسات السابقة إلى أن المنهجيات القائمة على الجينات 16S rRNA المستقلة عن الثقافة تقدم نهجا أكثر موثوقية وفعالية من حيث التكلفة لتوصيف المجتمعات الميكروبية المعقدة11. على سبيل المثال ، تم استخدام تسلسل المناطق شديدة التغير لجين 16S rRNA بنجاح لدراسة البكتيريا في أوراق العنب والتوت والنبيذ12،13،14. أظهرت الدراسات أن استخدام إما 16S rRNA metabarcoding أو التسلسل الميتاجينومي الكامل مناسب لدراسات الميكروبيوم15. هناك معلومات ناشئة حول الارتباط المحتمل للتنوع البكتيري بخصائصها الأيضية أثناء إنتاج النبيذ ، والتي يمكن أن تساعد في تحديد خصائص الخمور والأرض16.

تم التأكيد على الحاجة إلى تعظيم مزايا الأدوات metagenomic باستخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) لدراسة البيئة الميكروبية للعنب والنبيذ16,17. أيضا ، أصبح استخدام الأساليب المستقلة عن الثقافة القائمة على التسلسل عالي الإنتاجية لتعريف التنوع الميكروبي للنظام البيئي للأغذية والتخمير وثيق الصلة وقيمة للعديد من المختبرات ويوصى به للاستخدام الصناعي18,19. وهو يوفر ميزة الكشف عن التجمعات الميكروبية الحالية والتنميط التصنيفي لها ومساهمة الميكروبات البيئية، ووفرتها النسبية، وتنوع ألفا وبيتا20. أصبح تسلسل المنطقة المتغيرة لمنطقة 16S جينا مهما مفضلا وقد استخدم خلال الدراسات البيئية الميكروبية المختلفة.

بينما تركز العديد من الدراسات على الفطريات ، وخاصة الخميرة ، أثناء تخمير النبيذ21 ، أبلغت هذه الدراسة عن تسلسل 16S amplicon وأدوات المعلوماتية الحيوية المستخدمة لدراسة البكتيريا أثناء تخمير عنب Traminette لإنتاج النبيذ.

Protocol

1. إنتاج النبيذ التجريبي

  1. احصل على عنب Traminnette من نبيذ Dynamis Estate في كرم جونسفيل بولاية نورث كارولينا ، وقم بإزالته ، وسحقه لتحريره في جهازي تخمير منفصلين مفتوحين سعة 600 لتر واتركه على الجلود لمدة 4 أيام تقريبا مع وضع الأغطية.
  2. قم بضرب الأغطية مرة واحدة يوميا للحفاظ على رطوبة القشرة والحد من إنتاج الأحماض المتطايرة (VA).
    ملاحظة: الفكرة هي أن الكثير من السلائف العطرية (monoterpenes) تقع في الجلود وتترك العصير ملامسا للجلد لزيادة الإمكانات العطرية للنبيذ.
  3. بعد 4 أيام ، الملعب Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). تم اختيار هذه الخميرة لأنها مخمرة قوية وترتبط بتعزيز الطابع المتنوع في النبيذ من العنب.
  4. في خزان واحد ، Traminette R ، أضف 20 جم / ساعة Fermaid O عندما يكون البركس عند 17.7 و 20 جم / ساعة Fermaid O و 12.5 جم / ساعة Fermaid K عند 13.1 جم / ساعة لتحقيق أمان التخمير ، بينما يضيف الخزان الآخر Traminette L 40 جم / ساعة Stimula Sauvignon blanc عندما يكون البريكس عند 17.1. أضف أيضا 20 جم / ساعة Fermaid O عندما يكون البريكس عند 13.4 لتعزيز الطابع المتنوع للنبيذ.
  5. خذ عينات مكررة من يجب (اليوم 1) ، والخميرة المضافة (اليوم 4) ، والمخمرة (اليوم 15) ، وعينات النبيذ النهائية (اليوم 30) واحتفظ بها عند -20 درجة مئوية قبل استخراج الحمض النووي والتحليل الميتاجينومي.

2. استخراج الحمض النووي للميتاجينوميات

  1. احتفظ بجميع العينات المكررة التي تم الحصول عليها أعلاه على الجليد حتى الطرد المركزي الأول.
  2. انقل 20 مل من العينة المخمرة إلى أنبوب غطاء لولبي معقم سعة 50 مل.
  3. أضف 10 مل من الماء البارد وتجانس (دوامة). أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 800 × جم عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
    ملاحظة: ستؤدي هذه الخطوة إلى إزالة المواد الصلبة للعينة.
  4. كرر الخطوة 2.3 مرتين وقم بتجميع المواد الطافية في نفس الأنبوب.
  5. طافية الطرد المركزي عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتكوير الخلايا. تخلص من المادة الطافية.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS ، وانقلها إلى أنبوب بغطاء لولبي سعة 2 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 14000 × جم لمدة دقيقتين. قم بإجراء غسلتين أخريين باستخدام PBS.
  7. في هذه الخطوة, قم بتجميد الكريات عند -20 درجة مئوية أو اتبع الخطوة 2.8. من المهم أن يتم التعامل مع جميع العينات بنفس الطريقة.
  8. أضف 978 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم. تحضير العازلة فوسفات الصوديوم ، إضافة 3.1 غرام من NaH2PO4 · H2O و 10.9 g من Na2HPO4 (لا مائي) إلى H2O المقطر لعمل حجم 1 لتر ، وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
  9. أضف 122 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحمض النووي (مجموعة دوران الحمض النووي) والدوامة.
  10. اتركه في الثلاجة (4 درجات مئوية) لمدة 45 دقيقة -1 ساعة. دوامة العينات كل 15 دقيقة. يمكن ترك هذه الخطوة بين عشية وضحاها (o / n) أو حتى تصبح جاهزة لمواصلة استخدام مجموعة دوران الحمض النووي.
  11. انقل 1 مل من العينة إلى أنبوب محلول تحلل 1 (مجموعة دوران الحمض النووي) وشد الغطاء (اكتب رقم العينة على جانب الأنبوب وليس على الغطاء ؛ ستزيل كواشف المجموعة أي شيء مكتوب على الغطاء).
  12. تجانس العينة في مطحنة ضرب بالخرز (6.5 م / ث ، CY: 24 × 2) لمدة 60 ثانية ثلاث مرات. إذا كانت مطحنة ضرب الخرزة تحتوي على جهاز لوضع الثلج ، فضع 50 جم من الثلج الجاف تحت الأنابيب. إذا لم يكن الأمر كذلك ، احتفظ بالعينات على الثلج الرطب لمدة 5 دقائق بين كل خطوة تجانس.
  13. أنابيب Lysing Matrix E لأجهزة الطرد المركزي (مجموعة دوران الحمض النووي) لمدة 1 دقيقة عند 16800 × جم (أو السرعة القصوى).
  14. نقل المادة الطافية إلى أنبوب دقيق نظيف. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من كاشف محلول ترسيب البروتين (PPS) (مجموعة دوران الحمض النووي) واخلطه عن طريق هز الأنبوب يدويا 10 مرات.
  15. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 16800 × جم لحبيبات الراسب.
  16. انقل المادة الطافية إلى أنبوب معقم سعة 15 مل. أضف 1 مل من تعليق مصفوفة الربط (مجموعة دوران الحمض النووي) إلى المادة الطافية.
    ملاحظة: أعد تعليق تعليق مصفوفة الربط قبل الاستخدام حتى يصبح متجانسا.
  17. اقلب الأنابيب يدويا لمدة 2 دقيقة ، ثم اترك الأنابيب تقف في رف لمدة 3 دقائق (للسماح بترسب مصفوفة السيليكا).
  18. قم بإزالة 1 مل من المادة الطافية بعناية. أعد تعليق المصفوفة في المادة الطافية المتبقية.
  19. نقل 600 ميكرولتر من الخليط إلى أنبوب مرشح الدوران (مجموعة دوران الحمض النووي) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 14500 × غرام.
  20. أضف الخليط المتبقي وأجهزة الطرد المركزي.
  21. صب التدفق من خلال وإضافة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل (مجموعة دوران الحمض النووي) في أنبوب مرشح الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 14500 × جم (تأكد من إضافة EtOH إلى محلول الغسيل ؛ انظر كتيب المنتج). صب التدفق وكرر الغسيل مرتين أخريين (3 غسلات في المجموع).
  22. صب التدفق من خلال وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة إضافية عند 14500 × جم لتجفيف مصفوفة محلول الغسيل المتبقي.
  23. قم بإزالة مرشح الدوران وضعه في أنبوب صيد جديد (مجموعة دوران الحمض النووي). جفف مرشح الدوران في الهواء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  24. قم بتسخين الماء الخالي من الحمض النووي (مجموعة دوران الحمض النووي) على حرارة 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 50 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي وحرك المصفوفة برفق على غشاء المرشح باستخدام طرف ماصة لشطف الحمض النووي بكفاءة. دع العينات تقف في RT لمدة 1 دقيقة ، ثم أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 14500 × جم لإزالة الحمض النووي.
  25. ضع العينات على الثلج. قم بتحميل خليط العينة (2 ميكرولتر من العينة + 2 ميكرولتر من الماء + 1 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت) في هلام. قياس تركيز الحمض النووي.
  26. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  27. استخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد كمية الحمض النووي المستخرج.
    ملاحظة: تم إسقاط حجم 1 ميكرولتر من الحمض النووي وتحديده كميا ، ولوحظت جودة الحمض النووي بنسبة A260 / A280.

3. رحلان الحمض النووي الكهربائي

  1. تحضير 1٪ هلام الأغاروز في 0.5 تريس / بورات / EDTA (TBE) العازلة (20 مل لهلام صغير ، 70-100 مل لهلام متوسط). يزن الأغاروز + المخزن المؤقت ، ويغلى في الميكروويف لإذابة الأغاروز ، ويعيد وزنه ، ويضاف dH2O إلى الوزن الأصلي. يبرد محلول الأغاروز إلى 55-60 درجة مئوية ويصب في الجل السابق مع تجميع المشط. اترك الجل ليتصلب.
  2. أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الجل 10x إلى العينة (10 ميكرولتر) وقم بتحميله على الجل بجوار علامة الوزن الجزيئي. اركض من سالب (أسود) إلى موجب (أحمر) عند 100-115 فولت (هلام كبير) أو 90 فولت (هلام صغير) حتى تقترب الصبغة الزرقاء من القاع.
  3. جل البقع لمدة 30 دقيقة في 1 ميكرولتر / مل بروميد الإيثيديوم أو SYBR الأخضر (قفازات النتريل والنظارات الواقية) ، اشطفها بالماء ، وشاهدها تحت مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV). من العينات المكررة ، حدد أعلى عائد لمزيد من المعالجة.

4. تسلسل عالي الإنتاجية

  1. قم بتضخيم منطقة V4 شديدة التغير لجين 16S rRNA باستخدام بادئات محددة 515F (5 '-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') و 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. اضبط شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، و 30 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 58 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (التمديد النهائي).
  2. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مزيج رئيسي عالي الدقة من تفاعل البوليميراز المتسلسل (جدول المواد).
  3. قم بإنشاء مكتبات باستخدام مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي ثم التسلسل باستخدام تسلسل النهاية المزدوجة على منصة تسلسل.
    ملاحظة: هنا ، تم تسلسل المكتبات التي تم إنشاؤها باستخدام NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit باستخدام تسلسل Illumina المزدوج (2 × 250 bp) على منصة novaseq6000.
  4. اتبع خطوات التسلسل:
    1. الخطوة 1: قص الحمض النووي بإنزيم ، عادة بطريقة تختار الحجم العام.
      1. أضف 3.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتسلسل و 1.5 ميكرولتر من مزيج الإنزيم إلى 25 ميكرولتر من الحمض النووي (حوالي 1 ميكروغرام ،) اخلطها 10 مرات باستخدام ماصة وقم بتدويرها بسرعة.
      2. ضعه في جهاز تدوير حراري بالشروط التالية: سخن الغطاء عند 75 درجة مئوية ، (1) 30 دقيقة لمدة 20 درجة مئوية (2) 30 دقيقة ل 65 درجة مئوية (3) امسك عند 4 درجات مئوية.
    2. الخطوة 2: إضافة محولات عبر الربط
      1. أضف 15 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للربط ، و 1.25 ميكرولتر من المحول ، و 0.5 ميكرولتر من محسن الربط ، و 30 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي للتحضير النهائي مع ماصة.
      2. احتضن عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في دورة حرارية ثم أضف إنزيم كاشف الاستئصال الخاص باليوراسيل (USER) 1.5 ميكرولتر إلى مزيج الربط للحصول على إجمالي 48.26 ميكرولتر. احتضان 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      3. أضف 43.5 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى الحمض النووي لربط المحول ، واخلطها 20 مرة باستخدام ماصة ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في RT. افصل الخرزات برف مغناطيسي ، ثم احتضانها لمدة 5-10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
      4. اغسل الحبيبات ب 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ ، وجففها لمدة 30 ثانية ، واغسلها مرة أخرى. حبات وحبيبات Elute في 8.5 ميكرولتر من 10 mM Tris HCl / 0.1x Tris-EDTA (TE) / HPLCH 20 ، تخلط مع ماصة وتحتضن في RT لمدة دقيقتين.
      5. احتضان في الرف المغناطيسي وإزالة 7.5 ميكرولتر من الحمض النووي المستخلصة باعتبارها طافية. ضع elute في أنبوب جديد وقم بإجراء خطوة PCR.
      6. أولا ، أضف 12.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، و 2.5 ميكرولتر من التمهيدي للمؤشر i7 ، و 2.5 ميكرولتر من التمهيدي العالمي PCR / i5 التمهيدي إلى 7.5 ميكرولتر من الحمض النووي المرتبط بالمحول للحصول على 25 ميكرولتر من مزيج تفاعل تفاعل PCR. استخدم حالة PCR التالية: سخني الغطاء إلى 103 درجة مئوية. 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 65 درجة مئوية لمدة 75 ثانية ، 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، مع الاستمرار عند 4 درجات مئوية بعد 10 دورات.
      7. نظف الحمض النووي المضخم 25 ميكرولتر. أضف 22.5 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي واخلطه 20 مرة. احتضان في RT لمدة 5 دقائق وإزالة 50 ميكرولتر من طاف. اغسل الخرزات ب 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ ، وقم بإزالة كل الإيثانول عن طريق تجفيف الخرز برفق لمدة 30 ثانية.
      8. أعد تعليق الخرزات البنية الداكنة في 16 ميكرولتر من الماء ، واخلطها 20 مرة مع ماصة ، وضعها في الرف المغناطيسي لمدة 30-60 ثانية. نقل 15 ميكرولتر إلى أنبوب جديد.
      9. أوجد تركيز الحمض النووي (DNA) باستخدام مقياس الفلور. امزج 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت + 1 ميكرولتر صبغة + 2 ميكرولتر من عينة مكتبة الحمض النووي ، واقرأ التركيز. قم بتخفيف الحمض النووي إلى 2 نانومتر ، وقم بتحميل 27-30 ميكرولتر إلى خلية التدفق ، وضعها في جهاز التسلسل.
    3. الخطوة 3: تسلسل المحولات ، وتهجين المكتبات التي تم إنشاؤها أعلاه إلى مصفوفة خلية التدفق المنقوشة ، والتقاط الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدمه كقالب للتوليف الثاني.
      1. ثم قم بتضخيم الشريط الثاني إلى مجموعة نسيلية. خطي الكتلة وحظر المواقع النشطة. أضف التمهيدي للتسلسل لتوفير موقع للتسلسل عن طريق التوليف في التسلسل وفقا لبروتوكول manuacturer.
        ملاحظة: كيميائيا ، ترتبط النيوكليوتيدات المعدلة بحبل قالب الحمض النووي باستخدام التكامل الطبيعي. تحتوي كل نيوكليوتيد على علامة فلورية وفاصل عكسي يمنع إدراج القاعدة التالية. لذلك ، يشير وجود إشارة الفلورسنت إلى النوكليوتيدات التي يتم إدخالها ، ويتم شق الفاصل للقاعدة التالية للارتباط.
    4. الخطوة 4: قم بتضخيم الشريط أحادي الارتباط لإعطاء مجموعات من التسلسلات التي يتم تسلسلها جنبا إلى جنب عن طريق التوليف.
      ملاحظة: تعطي المجموعات إشارة أكثر إشراقا من حبلا واحد من خلال المسح ثنائي الاتجاه وكيمياء التسلسل ثنائي القناة. يقوم برنامج التسلسل تلقائيا بنقل ملفات الاستدعاء الأساسي (* .cbcl) إلى موقع مجلد الإخراج المحدد لتحليل البيانات.

5. المعلوماتية الحيوية

  1. إنشاء بيانات التسلسل كملفات FASTQ. حلل لتضمين الأجزاء التالية.
    1. الجزء الأول:
      1. احفظ ملفات FASTQ التي تم الحصول عليها من جهاز التسلسل ، وانقر لفتح ملف جدول بيانات ، وقم بإنشاء ملفات تعيين/بيانات تعريف.
      2. افتح موقع Nephele على الويب (https://nephele.niaid.nih.gov/) ، وقم بتحميل ملفات FASTQ ، وقراءة مراقبة الجودة ، والتصفية ، والتشذيب في QIIME222. قم بإيداع التسلسلات الأولية كأرشيف قراءة التسلسل (SRA) وبنك الجينات في NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
    2. الجزء الثاني: انتقل إلى موقع Nephele على الويب (https://nephele.niaid.nih.gov/) ، وقم بقراءات النهاية المزدوجة غير المتعددة ، واستبدال المرشح ، وأخطاء الوهم ، والدمج باستخدام DADA223. استخدم مصنف Naive Bayes المدرب على قاعدة بيانات Silva الإصدار 132 99٪ OTU لأداء التعيين التصنيفي البكتيري عند تشابه 97٪24.
    3. الجزء الثالث: افتح موقع MicrobiomeDB على الويب ، وانقر لتحميل الملفات ، وقم بإنشاء تنوع ألفا OTU ، وتنوع بيتا ، والوفرة النسبية ، ومنحنيات التخلخل (https://microbiomedb.org/mbio/app).
    4. الجزء الرابع: افتح جدول بيانات وانقل البيانات لعمل خرائط حرارية ومخططات Venn وحجم تأثير التحليل التمييزي الخطي (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. التحليل الإحصائي

  1. افتح QIIME222 ، وحدد الاختلافات المهمة في تنوع ألفا بين المجموعات باستخدام نص أهمية مجموعة ألفا. سيؤدي هذا أيضا إلى إجراء اختبار كروسكال واليس.
  2. تحديد الاختلافات في تنوع بيتا بين المجموعات باستخدام PERMANOVA ، بما في ذلك اختبار زوجي25.
  3. الحصول على الاختلافات الهامة في بنية المجتمع البكتيري بين المجموعات باستخدام MicrobiomeDB. تم اعتبار القيمة p ≤0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

يجب أولا تحديد كمية ونوعية الحمض النووي المستخرج من العنب ، وتخمير النبيذ ، والنبيذ النهائي. تتراوح قيمة الكمية من 15-87 نانوغرام / ميكرولتر (الجدول 1).

التسلسل والمعلوماتية الحيوية
أنشأ جهاز التسلسل عالي الإنتاجية Illumina ملف FASTQ تم استيراده إلى Nephele ...

Discussion

يبدأ بروتوكول metagenomics من أخذ عينات من العنب يجب ، وعندما تمت إضافة الخميرة إلى الضرورة ، والنبيذ المخمر وعينات النبيذ النهائية. تبع ذلك استخراج الحمض النووي المكرر الذي تم استخلاصه بنجاح من هذه العينات. وتراوحت الكميات التي تم الحصول عليها في التركيز من 15 نانوغرام/ميكرولتر إلى 87 نانوغرام/م...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

إن التمويل المقدم من منحة مجلس بحوث جامعة ولاية الآبالاش (URC) وزمالة CAPES Print Travel التي دعمت زيارة منظمة الأغذية والزراعة إلى جامعة ساو باولو ، ريبيراو بريتو - ساو باولو ، البرازيل ، نعرب عن امتناننا. تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - قانون المالية 001. ECPDM ممتنة لمنحة CAPES Print Travel التي دعمت زيارتها إلى جامعة ولاية أبالاتشي. ECPDM هو زميل باحث 2 من المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجيا ، البرازيل (CNPq).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose gel Promega, Madison, WI USAV3121Electrophoresis 
FastPrep DNA spinKit for soil MP Biomedicals, Solon, OH USA116560-200DNA extraction 
FastQC softwareBabraham Institute, United KingdomBioinformatics 
Fermaid OScott Laboratory, Petaluma, CA USA Fermentation 
High-Fidelity PCR Master Mix New England Biolabs, USAF630SPolymerase chain reaction for sequencing 
NEBNext UltraNew England Biolabs, USANEB #E7103DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit Illumina, San Diego, CA  USADNA sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS)Illumina, San Diego, CA  USADNA sequencing 
Novaseq6000 platform Illumina, San Diego, CA  USADNA sequencing 
QuiBitThermoscientific, Waltham, MA, USADNA quantification 
Quickdrop spectrophotometer Molecular device, San Jose, CA, USADNA quantification 
Sodium Phosphate Sigma Aldrich342483DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon BlancScott Laboratory, Petaluma, CA USA Fermentation 

References

  1. Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
  2. Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).
  3. Reisch, B. I., et al. . Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin. , (1996).
  4. Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must. Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).
  5. Attila, K. &. #. 1. 9. 5. ;., Kluz, M. Natural microflora of wine grape berries. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).
  6. Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).
  7. Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization. Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).
  8. Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role. Frontiers in Microbiology. 11, 3192 (2021).
  9. Burns, T. R., Osborne, J. P. Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine. American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).
  10. Piao, H., et al. Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes. Frontier of Microbiology. 6, 809 (2015).
  11. Figdor, D., Gukabivale, K. Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics. 18, 62-77 (2011).
  12. Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine. Plos ONE. 7 (5), e36357 (2012).
  13. Berbegal, C., et al. A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine. International Journal of Molecular Science. 20, 3980 (2019).
  14. Leveau, J. H., Tech, J. J. Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons. International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).
  15. Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies. Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).
  16. Bokulich, N. A., et al. Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics. Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).
  17. Siren, K., et al. Multi-omics and potential applications in wine production. Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).
  18. Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines. Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).
  19. Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).
  20. Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine. Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).
  21. Stefanini, I., Cavalier, D. Metagenomic approaches to investigate the contribution of the vineyard environment to the quality of wine fermentation: potentials and difficulties. Frontiers in Microbiology. 9, 991 (2018).
  22. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 5, 335-336 (2010).
  23. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  24. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  25. Anderson, M. J. A new method for non-parametric multivariate analysis of variance. Austral Ecology. 26 (1), 32-46 (2001).
  26. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  27. Fadiji, A. E., Babalola, O. O. Metagenomics methods for the study of plant-associated microbial communities: A review. Journal of Microbiological Methods. 170, 105860 (2020).
  28. van Hijum, S. A., Vaughan, E. E., Vogel, R. F. Application of state-of-art sequencing technologies to indigenous food fermentations. Current Opinion in Biotechnology. 24, 178-186 (2013).
  29. Víquez-R, L., Fleischer, R., Wilhelm, K., Tschapka, M., Sommer, S. Jumping the green wall: The use of PNA-DNA clamps to enhance microbiome sampling depth in wildlife microbiome research. Ecology and Evolution. 10 (20), 11779-11786 (2020).
  30. Bukin, Y. S., Galachyants, P., Yu, I. V., Morozov, S. V., Bukin, A. S., Zakharenko, T. I., Zemskaya, The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6, 190007 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved