メタゲノムアンプリコンシーケンシングを用いたワイン生産中の発酵トラミネットブドウの細菌群集のプロファイリング

要約

ここでは、トラミネットブドウ、発酵ブドウ、および最終ワインの細菌群集を決定するためのアンプリコンメタゲノムを説明するためのプロトコルを提示します。

要約

シーケンシング技術の進歩と、微生物群集構造をプロファイリングするためのバイオインフォマティクスツールの使用が比較的容易になったことで、ブドウとワインの培養可能な微生物と培養不可能な微生物の両方についての理解が深まりました。工業的発酵では、既知および未知の微生物が、製品開発や異臭の原因となることがよくあります。したがって、ブドウからワインまでの細菌をプロファイリングすることで、in situ微生物の動態を簡単に理解することができます。この研究では、トラミネットブドウのバクテリアを発酵させ、最終的なワインをDNA抽出し、15 ng / μLから87 ng / μLを生成しました。V4領域の超可変領域の16Sアンプリコンは、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリオタ門、ファーミキューテス門、バクテロイドタ門、フソバクテリオタ門からなる比較的豊富な細菌を配列決定し、続いて疣贅微生物叢、ハロバクタタ門、デスルホバクタ門、粘液球菌門、およびアシドバクテリオタ門が続いた。共通の固有分類単位(OTU)のベン図分析により、ブドウの果汁、発酵段階、最終ワインの両方に共通する15の細菌門が明らかになりました。これまで報告されていなかった門は、16Sアンプリコンシーケンシングを用いて検出されたほか、腸内細菌科や乳酸菌科などの属も検出されました。ワインの有機栄養素の使用の変動とバクテリアへの影響がテストされました。Fermaid OとTraminette LをStimula Sauvignon blanc + Fermaid Oで刺激したTraminette Rタンクは、Kruskal-Wallisテストを使用したアルファ多様性により、均一性の程度を決定しました。ベータの多様性は、2つの処理の発酵段階でのバクテリアの変化を示しており、最終的なワインバクテリアは類似しているように見えました。この研究では、16Sアンプリコンシーケンシングを使用して、ワイン製造中の細菌の変化を監視し、ワイン製造中のブドウ細菌の品質とより良い利用をサポートできることが確認されました。

概要

トラミネットのブドウは、かなりの収量といくつかの真菌感染症に対する部分的な耐性に加えて、優れたワイン品質の生産を特徴としています^1,2,3。葡萄の自然発酵は、関連する微生物、ワイン生産環境、および発酵容器に依存しています^4,5。多くの場合、多くのワイナリーは、発酵、アルコールの生産、エステル、香り、^{風味の開発を}野生酵母とバクテリアに依存しています6。

この研究の目的は、ブドウの細菌組成を調べ、発酵中のブドウの動態を監視することです。ただし、アルコールが生成される一次発酵に出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)などのスターター培養を現代的に使用することは、さまざまなワインスタイルに共通しています⁷。さらに、リンゴ酸がオエノコッカス・オエニによって乳酸に脱炭酸される二次発酵は、ワインの官能と味のプロファイルを改善し、ワインの酸味を減らします^8,9。近年の培養に依存しない方法の進歩により、ワイン用ブドウに関連するさまざまな微生物と、最終製品までのさまざまな時期にマストに移され、発酵に関与する種を決定することが可能になりました¹⁰。

ワインの発酵中にマストに移されたさまざまなブドウの野生バクテリアの役割と動態は、ほとんど理解されていません。これらの細菌の多くは分類学さえ知られていないか、それらの表現型特性は特徴付けられていません。そのため、共培養発酵への応用はまだ十分に活用されていません。しかし、微生物学的培養ベースの分析は、ブドウとワインに関連する細菌集団を決定するために使用されています¹⁰。選択的培養めっきは手間がかかり、汚染されやすく、再現性が低く、出力が疑わしい可能性があることは広く知られています。また、増殖要件が不明な細菌種も見逃します。これまでの研究で、培養に依存しない16S rRNA遺伝子ベースの方法論が、複雑な微生物群集を特徴づけるためのより信頼性が高く費用対効果の高いアプローチを提供することが示されています¹¹。例えば、16S rRNA遺伝子の超可変領域のシーケンシングは、ブドウの葉、ベリー類、ワイン中の細菌の研究に用いられて成功している12,13,14。研究によると、16S rRNAメタバーコーディングまたは全メタゲノムシーケンシングのいずれかの使用がマイクロバイオーム研究に適していることが示されています¹⁵。ワイン生産中の細菌の多様性と代謝特性との関連の可能性に関する情報が出てきており、ワイン醸造学的特性とテロワールの決定に役立つ可能性があります¹⁶。

ブドウとワインの微生物生態学を研究するために、次世代シーケンシング(NGS)を使用したメタゲノムツールの利点を最大化する必要性が強調されています^16,17。また、食品および発酵生態系の微生物多様性をプロファイリングするためのハイスループットシーケンシングに基づく培養に依存しない方法の使用は、多くのラボにとって非常に関連性があり、価値あるものとなっており、産業利用に推奨されています^18,19。これは、現在の微生物集団の検出と分類学的プロファイリング、および環境微生物の寄与、それらの相対的な存在量、およびアルファとベータの多様性の利点を提供します²⁰。16S領域の可変領域の配列決定は、選択される重要な遺伝子となり、さまざまな微生物生態学的研究で使用されてきました。

多くの研究は、ワイン発酵中の真菌、特に酵母に焦点を当てていますが²¹、この研究では、ワイン生産のためのトラミネットブドウ発酵中の細菌を研究するために使用される16Sアンプリコンシーケンシングおよびバイオインフォマティクスツールが報告されています。

プロトコル

1. 実験的なワイン生産

1. ノースカロライナ州ジョーンズビルのブドウ園にあるデュナミスエステートワインからトラミネットブドウを入手し、除梗、粉砕してマストを2つの別々の600Lオープントップ発酵槽に放出し、蓋をした状態で約4日間皮に置きます。
2. 1日1回キャップを打ち抜いて、肌を濡らさず、揮発性酸(VA)の生成を制限します。
   注:多くの芳香族前駆体(モノテルペン)が皮にあり、果汁を皮に接触させてワインの芳香の可能性を高めるという考え方です。
3. 4日後、 Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23(Lallemand)をピッチングする。この酵母は、強力な発酵槽であり、ブドウからワインの品種の特徴を高めることに関連しているため、選択されました。
4. 一方のタンクであるトラミネット Rには、ブリックスが17.7のときに20 g/hLのフェルメイドO、13.1 g/hLのときに20 g/hLのフェルメイドOと12.5 g/hLのフェルメイドKを加えて発酵の安全性を確保し、もう一方のタンクのトラミネット Lは、ブリックスが17.1のときに40 g/hLのスティミュラ・ソーヴィニヨン・ブランを加えます。また、ブリックスが13.4のときに20 g/hLのフェルメイドOを加えて、ワインの品種の特徴を高めます。
5. マスト(1日目)、酵母添加(4日目)、発酵マスト(15日目)、完成したワインサンプル(30日目)の複製サンプルを採取し、DNA抽出およびメタゲノム分析の前に-20°Cで保管します。

2. メタゲノミクスのためのDNA抽出

1. 上記で得られたすべての重複サンプルは、最初の遠心分離まで氷上に保管してください。
2. 発酵サンプル20 mLを滅菌済み50 mLスクリューキャップチューブに移します。
3. 10 mLの冷水を加え、均質化(ボルテックス)します。4°C、800 x g で1分間遠心分離し、上清を新しい50 mLチューブに移します。
   注:この手順では、サンプルの固形物を取り除きます。
4. 手順2.3を2回繰り返し、上清を同じチューブにプールします。
5. 上清を3,000 x g 、4°C、20分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上澄みを捨てます。
6. ペレットを 1 mL の PBS に再懸濁し、2 mL スクリューキャップチューブに移し、14,000 x g で 2 分間遠心分離します。PBSを使用してさらに2回の洗浄を行います。
7. このステップでは、ペレットを-20°Cで凍結するか、ステップ2.8に従います。すべてのサンプルを同じ方法で処理することが重要です。
8. 978 μLのリン酸ナトリウム緩衝液を添加します。リン酸ナトリウム緩衝液を調製し、3.1gのNaH₂PO₄·_H2OとNa2HPO4(無水)10.9gとを蒸留して_H2Oを1Lの体積とし、pHを7.4に調整した。
9. 122 μLのDNAバッファー(DNA Spin Kit)とボルテックスを加えます。
10. 冷蔵庫(4°C)で45分〜1時間放置します。15分ごとにサンプルをボルテックスします。このステップは、一晩(o/n)またはDNAスピンキットの使用を継続する準備ができるまで放置することができます。
11. 1 mL のサンプルを溶解溶液 1 チューブ(DNA スピンキット)に移し、キャップを締めます(サンプル番号はキャップではなくチューブの側面に記入してください。
12. ビーズビートグラインダー(6.5 m/s、CY:24 x 2)で60秒間、サンプルを3回均質化します。ビーズビートグラインダーに氷を入れる装置がある場合は、チューブの下に50gのドライアイスを入れます。そうでない場合は、各均質化ステップの間にサンプルをウェットアイス上に5分間保管します。
13. Lysing Matrix Eチューブ(DNAスピンキット)を16800 x g(または最大速度)で1分間遠心分離します。
14. 上澄み液を清潔なマイクロチューブに移します。その後、タンパク質沈殿液(PPS)試薬(DNAスピンキット)250μLを加え、チューブを手で10回振とうして混合する。
15. 16800 x g で5分間遠心分離し、沈殿物をペレット化します。
16. 上清を滅菌済みの15 mLチューブに移します。1 mLの結合マトリックス懸濁液(DNAスピンキット)を上清に加えます。
    注:結合マトリックス懸濁液は、使用前に均一になるまで再懸濁してください。
17. チューブを手で2分間反転させてから、チューブをラックに3分間放置します(シリカマトリックスを沈降させるため)。
18. 上清1mLを慎重に取り除きます。残りの上清にマトリックスを再懸濁します。
19. 混合物600 μLをスピンフィルターチューブ(DNAスピンキット)に移し、14500 x gで1分間遠心分離します。
20. 残りの混合物を加えて遠心分離します。
21. フロースルーをデカントし、500 μLの洗浄液(DNAスピンキット)をスピンフィルターチューブに加え、14500 x gで1分間遠心分離します(洗浄液にEtOHを添加してください;製品ハンドブックを参照)。フロースルーをデカントし、洗浄をさらに2回繰り返します(合計3回の洗浄)。
22. フロースルーをデカントし、14,500 x g でさらに2分間遠心分離し、残留洗浄溶液のマトリックスを乾燥させます。
23. スピンフィルターを取り外し、新しいキャッチチューブ(DNAスピンキット)に入れます。スピンフィルターを室温(RT)で5分間風乾します。
24. DNAseフリー水(DNA Spin Kit)を55°Cで5分間温めます。DNAseを含まない水50 μLを加え、DNAを効率的に溶出させるために、ピペットチップでフィルターメンブレン上のマトリックスを静かに撹拌します。サンプルを室温で1分間静置し、14500 x g で1分間遠心分離してDNAを溶出します。
25. サンプルを氷の上に置きます。サンプル混合物(2 μLのサンプル + 2 μLの水 + 1 μLのローディングバッファー)をゲルにロードします。DNA濃度を測定します。
26. サンプルは-20°Cで保管してください。
27. 分光光度計を使用して、抽出したDNAを定量します。
    注:1 μL の DNA を滴下して定量し、DNA の品質を A260/A280 の比率で確認しました。

3. DNA電気泳動

1. 0.5トリス/ホウ酸塩/EDTA(TBE)バッファー(ミニゲルの場合は20 mL、中ゲルの場合は70〜100 mL)で1%アガロースゲルを調製します。アガロース+緩衝液を秤量し、電子レンジで煮沸してアガロースを溶融し、再秤量し、元の重量にdH₂Oを添加する。アガロース溶液を55〜60°Cに冷却し、コームアセンブリを備えたゲルフォーマーに注ぎます。ゲルを固化させます。
2. 1 μL の 10x ゲルローディングバッファーをサンプル(10 μL)に加え、分子量マーカーの隣のゲルにロードします。青色の染料が底に近づくまで、100〜115 V(ラージゲル)または90 V(ミニゲル)でネガティブ(黒)からポジティブ(赤)まで実行します。
3. 1 μL/mL のエチジウムブロマイドまたは SYBR グリーン(ニトリル手袋とゴーグルが必要)でゲルを 30 分間染色し、水ですすぎ、紫外線(UV)光源で観察します。重複したサンプルから、さらに処理するために最も高い収率を選択します。

4. ハイスループットシーケンシング

1. 特異的プライマー515F(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')および806R(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')²²を用いて、16S rRNA遺伝子のV4超可変領域を増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件を94°Cで2分間、94°Cで20秒間、58°Cで20秒間、65°Cで1分間、65°Cで10分間(最終伸長)の30サイクルに設定します。
2. 忠実度の高いPCRマスターミックス(材料表)でPCR反応を行います。
3. DNAライブラリ調製キットでライブラリを作製し、シーケンシングプラットフォーム上でペアエンドシーケンシングを使用してシーケンシングします。
   注:ここでは、NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit で生成したライブラリを、novaseq6000 プラットフォーム上でペアエンド Illumina シーケンシング(2 × 250 bp)を使用してシーケンシングしました。
4. 順序付けの手順に従います。
   1. ステップ1:通常、一般的なサイズを選択する方法で、酵素でDNAをせん断します。
      1. 3.5 μLのシーケンシングバッファーと1.5 μLの酵素ミックスを25 μLのDNA(約1 μg)に加え、ピペットで10回混合し、素早く泳解します。
      2. 蓋を75°Cで予熱し、(1)20°Cで30分、(2)65°Cで30分、(3)4°Cで保持します。
   2. ステップ2:ライゲーションによるアダプターの追加
      1. 15 μLのライゲーションマスターミックス、1.25 μLのアダプター、0.5 μLのライゲーションエンハンサー、および30 μLのエンドプレップDNAミックスをピペットで加えます。
      2. サーモサイクラーで20°Cで15分間インキュベートした後、ライゲーションミックスに1.5 μLのウラシル特異的切除試薬(USER)酵素を添加して、合計48.26 μLを得ます。 37°Cで15分間インキュベートします。
      3. アダプターライゲーションDNAに43.5μLの磁気ビーズを加え、ピペットで20回混合し、室温で5分間インキュベートします。 磁気ラックでビーズを分離し、5〜10分間インキュベートし、上清を廃棄します。
      4. ペレットを100μLの80%エタノールで洗浄し、30秒間乾燥させた後、再度洗浄します。ビーズとペレットを8.5 μLの10 mM Tris HCl/0.1x Tris-EDTA(TE)/HPLC_{H 2}0に溶出し、ピペットで混合し、室温で2分間インキュベートします。
      5. 磁気ラックでインキュベートし、溶出したDNA7.5 μLを上清として除去します。溶出液を新しいチューブに入れ、PCRステップを実施します。
      6. まず、マスターミックス12.5 μL、インデックスプライマーi7プライマー2.5 μL、ユニバーサルPCRプライマー/i5プライマー2.5 μLを7.5 μLのアダプターライゲーション済みDNAに加え、25 μLのPCR反応ミックスを得ます。蓋を103°Cに予熱し、98°Cで30秒、98°Cで10秒、65°Cで75秒、65°Cで5分間、10サイクル後に4°Cで保持します。
      7. 増幅した DNA 25 μL を洗浄します。22.5μLの磁気ビーズを加え、20回混合します。室温で5分間インキュベートし、上清50μLを除去します。ビーズを100μLの80%エタノールで洗浄し、ビーズを30秒間静かに乾燥させてすべてのエタノールを除去します。
      8. 暗褐色のビーズを16 μLの水に再懸濁し、ピペットで20回混合し、マグネットラックに30〜60秒間置きます。15 μLを新しいチューブに移します。
      9. 蛍光光度計を使用してDNA濃度を測定します。バッファー 90 μL + 色素 1 μL + DNA ライブラリーサンプル 2 μL を混合し、濃度を読み取ります。DNAを2 nMに希釈し、27〜30 μLをフローセルにロードし、シーケンサーに入れます。
   3. ステップ3:アダプターを配列決定し、上記で生成したライブラリをパターン化されたフローセルのマトリックスにハイブリダイズし、メーカーの指示に従ってDNAを捕捉します。これを 2 番目の合成のテンプレートとして使用します。
      1. 次に、2本目の鎖をクローンクラスターに増幅します。クラスターを線形化し、アクティブなサイトをブロックします。シーケンシングプライマーを添加して、メーカーのプロトコルごとのシーケンスで合成することによりシーケンシングを行う部位を提供します。
         注:化学的には、修飾されたヌクレオチドは、天然の相補性を利用してDNAテンプレート鎖に結合します。各ヌクレオチドには、蛍光タグと、次の塩基の包含をブロックする可逆的ターミネーターがあります。したがって、蛍光シグナルの存在は、どのヌクレオチドが挿入されたかを示し、ターミネーターは、次の塩基が結合するために切断される。
   4. ステップ4:一本鎖を増幅して、合成によって並行して配列決定された配列のクラスターを生成します。
      注:クラスターは、双方向スキャンと2チャンネルシーケンシングケミストリーにより、1本の鎖よりも明るい信号を発します。シーケンシングソフトウェアは、データ解析のために、ベースコール(*.cbcl)ファイルを指定された出力フォルダの場所に自動的に転送します。

5.バイオインフォマティクス

1. 配列データをFASTQファイルとして生成します。次の部分を含むように分析します。
   1. パートI:
      1. シーケンサーから取得したFASTQファイルを保存し、クリックしてスプレッドシートファイルを開き、マッピング/メタデータファイルを作成します。
      2. Nephele の Web サイト (https://nephele.niaid.nih.gov/) を開き、FASTQ ファイルをアップロードし、QIIME2²² の QC、フィルタリング、およびトリミングを読み取ります。生の配列を Sequence Read Archive (SRA) および GenBank として NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/) に寄託
   2. パートII:NepheleのWebサイト(https://nephele.niaid.nih.gov/)にアクセスし、逆多重化されたペアエンドリード、フィルター置換、およびキメラエラーを行い、DADA2²³を使用してマージします。Silva バージョン 132 の 99% OTU データベースでトレーニングされた単純ベイズ分類器を使用して、97% の類似性²⁴ で細菌の分類学的割り当てを実行します。
   3. パートIII:MicrobiomeDBのWebサイトを開き、クリックしてファイルをアップロードし、OTUアルファダイバーシティ、ベータダイバーシティ、相対存在量、および希薄化曲線を生成します(https://microbiomedb.org/mbio/app)。
   4. パート IV: スプレッドシートを開き、データを転送して、ヒートマップ、ベン図、線形判別分析の効果サイズ (https://microbiomedb.org/mbio/app) を作成します。

6. 統計解析

1. QIIME2²² を開き、alpha-group-significance スクリプトを使用してグループ間のアルファ多様性の有意差を判断します。これにより、Kruskal-Wallis検定も実行されます。
2. PERMANOVAを使用して、ペアワイズ検定²⁵を含むグループ間のベータ多様性の差を決定します。
3. MicrobiomeDBを使用して、グループ間の細菌群集構造の有意差を取得します。p値≤0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

葡萄から抽出されたDNAの量と質は、ワインを発酵させ、最終的なワインを最初に決定しました。量値は15〜87 ng / μLの範囲です(表 1)。

シーケンシングとバイオインフォマティクス
Illuminaハイスループットシーケンサーは、Nepheleにインポートされ、QIIME 2プラットフォーム²⁶で表示されたFASTQファイルを生成しました...

ディスカッション

メタゲノミクスのプロトコルは、ブドウの果汁のサンプリングから始まり、酵母がマストに加えられたとき、発酵ワインと最終的なワインのサンプル。これに続いて、これらのサンプルから抽出されたDNAの複製抽出に成功しました。得られた濃度は15 ng/μLから87 ng/μLまでさまざまでした。これはDNAの抽出のプロトコルがワインのmetagenomicの調査のために有効であることを示す。A260/A280のDNAの?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation