Perfil da Comunidade Bacteriana de Fermentação de Uvas Traminette durante a Produção de Vinho utilizando Sequenciamento Metagenômico Amplicon

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever a metagenômica amplicon para determinar a comunidade bacteriana de uvas Traminette, uvas em fermentação e vinho final.

Resumo

Os avanços na tecnologia de sequenciamento e o acesso relativamente fácil ao uso de ferramentas de bioinformática para traçar o perfil das estruturas da comunidade microbiana têm facilitado uma melhor compreensão dos micróbios cultiváveis e não cultiváveis em uvas e vinhos. Durante a fermentação industrial, micróbios, conhecidos e desconhecidos, são frequentemente responsáveis pelo desenvolvimento de produtos e dessabor. Portanto, o perfil das bactérias da uva ao vinho pode permitir uma fácil compreensão da dinâmica microbiana in situ . Neste estudo, as bactérias do mosto de uvas Traminette submetidas à fermentação, e o vinho final foi submetido à extração de DNA que resultou em 15 ng/μL a 87 ng/μL. O amplicon 16S da região hipervariável da região V4 foi sequenciado, bactérias relativamente abundantes constituídas pelos filos Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota e seguidas pelos Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota e Acidobacteriota. Uma análise do diagrama de Venn das unidades taxonômicas operacionais únicas compartilhadas (OTU) revelou que 15 filos de bactérias eram comuns ao mosto de uva, ao estágio de fermentação e ao vinho final. Filos não relatados anteriormente foram detectados usando o sequenciamento do amplicon 16S, assim como gêneros como Enterobacteriaceae e Lactobacillaceae. Testou-se a variação no uso de nutrientes orgânicos no vinho e seu impacto sobre as bactérias; Tanque Traminette R contendo Fermaid O e Traminette L estimulado com Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. A diversidade alfa usando o teste de Kruskal-Wallis determinou o grau de equitabilidade. A diversidade beta indicou uma mudança nas bactérias no estágio de fermentação para os dois tratamentos, e as bactérias finais do vinho pareceram semelhantes. O estudo confirmou que o sequenciamento de amplicon 16S pode ser usado para monitorar as mudanças bacterianas durante a produção de vinho para apoiar a qualidade e melhor utilização das bactérias da uva durante a produção de vinho.

Introdução

A uva Traminette caracteriza-se pela produção de vinhos de qualidade superior, além de rendimento apreciável e resistência parcial a diversas infecções fúngicas ^1,2,3. A fermentação natural das uvas depende de microrganismos associados, ambiente de produção de vinho e vasos de fermentação ^4,5. Muitas vezes, muitas vinícolas dependem de leveduras e bactérias selvagens para fermentação, produção de álcool, ésteres, aroma e desenvolvimento de sabor⁶.

O objetivo deste estudo é examinar a composição bacteriana de uvas e monitorar sua dinâmica durante a fermentação. No entanto, o uso moderno de culturas iniciadoras, como a Saccharomyces cerevisiae, para fermentação primária, onde o álcool é produzido, é comum a diferentes estilos de vinho⁷. Além disso, a fermentação secundária, em que o ácido málico é descarboxilado por Oenococcus oeni em ácido lático, melhora o perfil organoléptico e gustativo do vinho e reduz a acidez do vinho ^8,9. Com os recentes avanços no uso de métodos independentes de cultura, agora é possível determinar diferentes micróbios associados à uva vinífera e às espécies que são transferidas para o mosto e participar da fermentação em diferentes momentos até o produto final¹⁰.

Os papéis e a dinâmica de bactérias selvagens de diferentes uvas transferidas para o mosto durante a fermentação do vinho são pouco compreendidos. A taxonomia de muitas dessas bactérias ainda não é conhecida, ou suas propriedades fenotípicas não estão caracterizadas. Isso faz com que sua aplicação na fermentação da cocultura ainda seja pouco utilizada. No entanto, a análise microbiológica baseada em cultura tem sido utilizada para determinar a população bacteriana associada à uva e ao vinho¹⁰. Sabe-se que o plaqueamento seletivo de cultura é tedioso, propenso à contaminação, tem baixa reprodutibilidade e o resultado pode ser duvidoso; Também perde espécies bacterianas cujas necessidades de crescimento são desconhecidas. Estudos prévios indicam que metodologias baseadas no gene 16S rRNA, independentes de cultura, oferecem uma abordagem mais confiável e custo-efetiva para caracterizar comunidades microbianas complexas¹¹. Por exemplo, o sequenciamento das regiões hipervariáveis do gene 16S rRNA tem sido empregado com sucesso para estudar bactérias em folhas de uvas, bagas e vinho 12,13,14. Estudos têm mostrado que o uso de metabarcoding de 16S rRNA ou sequenciamento metagenômico completo é adequado para estudos de microbioma¹⁵. Estão surgindo informações sobre a possível ligação da diversidade bacteriana aos seus atributos metabólicos durante a produção do vinho, o que poderia auxiliar na determinação das propriedades enológicas e do terroir¹⁶.

A necessidade de maximizar as vantagens das ferramentas metagenômicas utilizando o sequenciamento de próxima geração (NGS) para estudar a ecologia microbiana da uva e do vinho tem sido enfatizada^16,17. Além disso, o uso de métodos independentes de cultura baseados em sequenciamento de alto rendimento para traçar o perfil da diversidade microbiana do ecossistema alimentar e fermentativo tornou-se muito relevante e valioso para muitos laboratórios, sendo recomendado para uso industrial^18,19. Fornece uma vantagem de detecção e perfil taxonômico das populações microbianas presentes e a contribuição de micróbios ambientais, sua abundância relativa e diversidade alfa e beta²⁰. O sequenciamento da região variável da região 16S tornou-se um importante gene de escolha e tem sido utilizado durante diferentes estudos ecológicos microbianos.

Enquanto muitos estudos se concentram em fungos, especialmente leveduras, durante a fermentação do vinho²¹, este estudo relatou o sequenciamento de amplicon 16S e ferramentas de bioinformática usadas para estudar as bactérias durante a fermentação de uvas Traminette para produção de vinho.

Protocolo

1. Produção experimental de vinho

1. Obtenha uvas Traminnette do vinho Dynamis Estate em Jonesville, vinhedo da Carolina do Norte, destale e esmague para liberar o mosto em dois fermentadores abertos separados de 600 L e deixe em cascas por cerca de 4 dias com as tampas ligadas.
2. Perfure as tampas uma vez por dia para manter as peles molhadas e limitar a produção de ácido volátil (VA).
   OBS: A ideia é que muitos dos precursores aromáticos (monoterpenos) fiquem situados nas cascas e deixem o suco em contato com a pele para aumentar o potencial aromático do vinho.
3. Após 4 dias, pitch Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Esta levedura foi selecionada por ser um fermentador forte e está associada ao reforço do caráter varietal no vinho das uvas.
4. Em um tanque, Traminette R, adicione 20 g/hL Fermaid O quando o brix estiver a 17,7 e 20 g/hL Fermaid O e 12,5 g/hL Fermaid K a 13,1 g/hL para alcançar a segurança de fermentação, enquanto no outro tanque Traminette L, adicione 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc quando o brix estiver em 17,1. Adicione também 20 g/hL Fermaid O quando o brix estiver em 13,4 para realçar o caráter varietal do vinho.
5. Colher amostras duplicadas de mosto (dia 1), levedura adicionada (dia 4), mosto fermentado (dia 15) e amostras de vinho acabado (dia 30) e manter a -20 °C antes da extracção de ADN e análise metagenómica.

2. Extração de DNA para metagenômica

1. Manter todas as amostras duplicadas obtidas acima no gelo até a primeira centrifugação.
2. Transferir 20 mL da amostra fermentada para um tubo estéril de tampa de rosca de 50 mL.
3. Adicionar 10 mL de água fria e homogeneizar (vórtice). Centrifugar durante 1 min a 800 x g a 4 °C e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 ml.
   NOTA: Esta etapa removerá os sólidos da amostra.
4. Repita o passo 2.3 duas vezes e junte os sobrenadantes no mesmo tubo.
5. Centrifugar sobrenadante a 3.000 x g a 4 °C por 20 min para peletizar as células. Descarte o sobrenadante.
6. Ressuspender o pellet em 1 mL de PBS, transferir para um tubo de tampa de rosca de 2 mL e centrifugar a 14.000 x g por 2 min. Realize mais duas lavagens usando PBS.
7. Nesta etapa, congele os pellets a -20°C ou siga o passo 2.8. É importante que todas as amostras sejam tratadas da mesma forma.
8. Adicionar 978 μL de tampão fosfato de sódio. Preparar tampão fosfato de sódio, adicionar 3,1 g de NaH₂PO₄· H₂O e 10,9 g de Na₂HPO₄ (anidro) para destilar H₂O para fazer um volume de 1 L, e ajustar o pH para 7,4.
9. Adicionar 122 μL de tampão de DNA (kit de spin de DNA) e vórtice.
10. Deixe descansar na geladeira (4 °C) por 45 min-1 h. Vórtice as amostras a cada 15 min. Esta etapa pode ser deixada durante a noite (o/n) ou até que esteja pronta para continuar usando o kit de spin de DNA.
11. Transfira 1 mL de amostra para um tubo de solução de lise 1 (kit de spin de DNA) e aperte a tampa (escreva o número da amostra na lateral do tubo e não na tampa; os reagentes do kit removerão qualquer coisa escrita na tampa).
12. Homogeneizar a amostra em um moedor batedor de contas (6,5 m/s, CY: 24 x 2) por 60 s três vezes. Se o moedor de contas tiver o dispositivo para colocar gelo, coloque 50 g de gelo seco sob os tubos. Caso contrário, manter as amostras em gelo úmido por 5 min entre cada etapa de homogeneização.
13. Centrífuga Lysing Matrix E tubos (kit de spin DNA) por 1 min a 16800 x g (ou velocidade máxima).
14. Transfira o sobrenadante para um microtubo limpo. Em seguida, adicione 250 μL de reagente de solução de precipitação proteica (PPS) (kit de spin de DNA) e misture agitando o tubo manualmente 10 vezes.
15. Centrifugar por 5 min a 16800 x g para pellet o precipitado.
16. Transfira o sobrenadante para um tubo estéril de 15 mL. Adicionar 1 mL de suspensão de matriz de ligação (kit de spin de DNA) ao sobrenadante.
    NOTA: Ressuspenda a suspensão da matriz de ligação antes de usar até que ela fique homogênea.
17. Inverta os tubos manualmente por 2 min, em seguida, deixe os tubos em um rack por 3 min (para permitir o assentamento da matriz de sílica).
18. Retire cuidadosamente 1 ml do sobrenadante. Ressuspenda a matriz no sobrenadante restante.
19. Transfira 600 μL da mistura para um tubo de filtro de spin (kit de spin de DNA) e centrífuga por 1 min a 14500 x g.
20. Adicione a mistura restante e centrifuga.
21. Decantar o fluxo e adicionar 500 μL de solução de lavagem (kit de spin de DNA) no tubo do filtro de spin e centrifugar por 1 min a 14500 x g (certifique-se de adicionar EtOH à solução de lavagem; consulte o manual do produto). Decantar o fluxo e repetir a lavagem mais duas vezes (3 lavagens no total).
22. Decantar o fluxo e centrifugar por mais 2 min a 14.500 x g para secar a matriz da solução de lavagem residual.
23. Retire o filtro de spin e coloque-o em um tubo de captura fresco (kit de spin de DNA). Seque o filtro de spin ao ar por 5 min à temperatura ambiente (TR).
24. Aqueça a água livre de DNAse (kit de spin de DNA) a 55 °C por 5 min. Adicione 50 μL de água sem DNAse e agite suavemente a matriz na membrana do filtro com uma ponta de pipeta para uma eluição eficiente do DNA. Deixe as amostras repousarem em RT por 1 min e, em seguida, centrifugar por 1 min a 14500 x g para eluir o DNA.
25. Coloque as amostras no gelo. Carregar a mistura da amostra (2 μL de amostra + 2 μL de água + 1 μL de tampão de carga) num gel. Medir a concentração de DNA.
26. Conservar as amostras a -20 °C.
27. Use um espectrofotômetro para quantificar o DNA extraído.
    NOTA: Um volume de 1 μL de DNA foi descartado e quantificado, e a qualidade do DNA foi observada em uma proporção A260/A280.

3. Eletroforese de DNA

1. Preparar gel de agarose a 1% em tampão 0,5 Tris/Borato/EDTA (TBE) (20 mL para um mini gel, 70-100 mL para um gel médio). Pese agarose+tampão, ferva no micro-ondas para derreter a agarose, pese novamente e adicione dH₂O ao peso original. Arrefecer a solução de agarose a 55-60 °C e deitar na formadora de gel com o conjunto do pente. Deixe o gel solidificar.
2. Adicionar 1 μL de tampão de carregamento de 10x gel à amostra (10 μL) e carregar no gel junto a um marcador de peso molecular. Passe de negativo (preto) para positivo (vermelho) a 100-115 V (gel grande) ou 90 V (mini gel) até que o corante azul esteja perto do fundo.
3. Coloração em gel por 30 min em brometo de etídio de 1 μL/mL ou verde SYBR (luvas e óculos de nitrilo necessários), enxaguar em água e visualizar sob fonte de luz ultravioleta (UV). A partir das amostras duplicadas, selecione o maior rendimento para processamento posterior.

4. Sequenciamento de alto rendimento

1. Amplificar a região hipervariável V4 do gene 16S rRNA usando os primers específicos 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') e 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')²². Definir as condições de reação em cadeia da polimerase (PCR) em 94 °C por 2 min, 30 ciclos de 94 °C por 20 s, 58 °C por 20 s, 65 °C por 1 min e 65 °C por 10 min (extensão final).
2. Realizar reações de PCR com um master mix de PCR de alta fidelidade (Tabela de Materiais).
3. Gere bibliotecas com kit de preparação de biblioteca de DNA e, em seguida, sequencie usando sequenciamento de extremidade emparelhada em uma plataforma de sequenciamento.
   NOTA: Aqui, as bibliotecas geradas com o NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit foram sequenciadas usando sequenciamento Illumina pareado (2 × 250 pb) na plataforma novaseq6000.
4. Siga as etapas de sequenciamento:
   1. Passo 1: Cisalhe o DNA com uma enzima, geralmente por um método que seleciona para um tamanho geral.
      1. Adicionar 3,5 μL de tampão de sequenciação e 1,5 μL de mistura enzimática a 25 μL de ADN (cerca de 1 μg), misturar 10 vezes com uma pipeta e girar rapidamente.
      2. Coloque em um termociclador com as seguintes condições: pré-aqueça a tampa a 75°C, (1) 30 min para 20 °C (2) 30 min para 65 °C (3) segure a 4°C.
   2. Passo 2: Adicionar adaptadores via ligadura
      1. Adicionar 15 μL de mistura mestre de ligadura, 1,25 μL de adaptador, 0,5 μL de intensificador de ligadura e 30 μL de mistura de DNA de preparação final com uma pipeta.
      2. Incubar a 20 °C durante 15 minutos num termociclador e, em seguida, adicionar 1,5 μL de enzima reagente de excisão específica para uracila (USER) à mistura de ligadura para obter um total de 48,26 μL. Incubar 37 °C durante 15 minutos.
      3. Adicione 43,5 μL de esferas magnéticas ao DNA de ligadura do adaptador, misture 20 vezes com uma pipeta e incube por 5 min em RT. Separe as contas com um rack magnético, incube por 5-10 min e descarte o sobrenadante.
      4. Lave o pellet com 100 μL de etanol 80%, seque por 30 s e lave novamente. Contas eluídas e pellet em 8,5 μL de Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H₂0, misturar com uma pipeta e incubar em TR por 2 min.
      5. Incubar no rack magnético e remover 7,5 μL de DNA eluído como sobrenadante. Coloque a eluição em um tubo novo e realize uma etapa de PCR.
      6. Primeiro, adicione 12,5 μL de mistura mestra, 2,5 μL de primer índice i7 primer e 2,5 μL de primer universal de PCR/primer i5 a 7,5 μL de DNA ligado a adaptador para obter 25 μL de mistura de reação de PCR. Use a seguinte condição de PCR: pré-aqueça a tampa a 103 °C. 98 °C por 30 s, 98 °C por 10 s, 65 °C por 75 s, 65 °C por 5 min e mantenha a 4 °C após 10 ciclos.
      7. Limpe o DNA amplificado de 25 μL. Adicionar 22,5 μL de esferas magnéticas e misturar 20 vezes. Incubar em TR por 5 min e remover 50 μL do sobrenadante. Lave as contas com 100 μL de etanol 80% e retire todo o etanol secando as contas suavemente por 30 s.
      8. Ressuspenda as contas castanhas escuras em 16 μL de água, misture 20 vezes com uma pipeta e coloque no rack magnético por 30-60 s. Transferir 15 μL para um novo tubo.
      9. Determinar a concentração de DNA usando um fluorômetro. Misture 90 μL de tampão + 1 μL de corante + 2 μL de amostra de biblioteca de DNA e leia a concentração. Diluir o DNA em 2 nM, carregar 27-30 μL na célula de fluxo e colocá-lo no sequenciador.
   3. Passo 3: Sequenciar os adaptadores, hibridizar as bibliotecas geradas acima para a matriz da célula de fluxo padronizada e capturar o DNA de acordo com as instruções do fabricante. Use-o como modelo para a segunda síntese.
      1. Em seguida, amplie a segunda fita em um cluster clonal. Linearize o cluster e bloqueie os sites ativos. Adicionar primer de sequenciamento para fornecer um local para sequenciamento por síntese na sequência de acordo com o protocolo do fabricante.
         NOTA: Quimicamente, os nucleotídeos modificados ligam-se à fita molde de DNA usando complementaridade natural. Cada nucleotídeo tem uma etiqueta fluorescente e um terminador reversível que bloqueia a inclusão da próxima base. Portanto, a presença de um sinal fluorescente indica qual nucleotídeo está inserido, e o terminador é clivado para a próxima base se ligar.
   4. Passo 4: Amplificar a fita de ligação única para dar agrupamentos de sequências que são sequenciadas em conjunto por síntese.
      NOTA: Os clusters fornecem um sinal mais brilhante do que uma única fita através de varredura bidirecional e química de sequenciamento de dois canais. O software de sequenciamento transfere automaticamente os arquivos de chamada base (*.cbcl) para o local da pasta de saída especificada para análise de dados.

5. Bioinformática

1. Gere os dados de sequência como arquivos FASTQ. Analise para incluir as seguintes partes.
   1. Parte I:
      1. Salve os arquivos FASTQ obtidos do sequenciador, clique para abrir um arquivo de planilha e crie arquivos de mapeamento/metadados.
      2. Abra o site da Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), carregue os arquivos FASTQ, leia o QC, filtre e corte no QIIME2²². Deposite as sequências brutas como sequence read archive (SRA) e GenBank no NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
   2. Parte II: Vá para o site da Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), faça as leituras de extremidade emparelhada desmultiplexadas, substituição de filtros e erros de quimera e mescle usando DADA2²³. Utilizar o classificador Naive Bayes treinado no banco de dados Silva versão 132 99% OTU para realizar a atribuição taxonômica bacteriana a 97% de similaridade²⁴.
   3. Parte III: Abra o site do MicrobiomeDB, clique para fazer upload de arquivos e gere curvas de diversidade alfa, beta, abundância relativa e rarefação (https://microbiomedb.org/mbio/app) da OTU.
   4. Parte IV: Abra uma planilha e transfira dados para fazer mapas de calor, diagramas de Venn e tamanho de efeito de análise discriminante linear (https://microbiomedb.org/mbio/app).

6. Análise estatística

1. Abra o QIIME2²² e determine as diferenças significativas na diversidade alfa entre os grupos usando o script de significância de grupo alfa. Este também realizará o teste de Kruskal-Wallis.
2. Determinar as diferenças na diversidade beta entre os grupos usando PERMANOVA, incluindo um teste pareado²⁵.
3. Obter as diferenças significativas na estrutura da comunidade bacteriana entre os grupos usando MicrobiomeDB. Um valor de p ≤0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A quantidade e a qualidade do DNA extraído do mosto de uvas, do vinho fermentado e do vinho final foram primeiramente determinadas; o valor da quantidade varia de 15-87 ng/μL (Tabela 1).

Sequenciamento e bioinformática
O sequenciador de alta taxa de transferência do Illumina gerou um arquivo FASTQ que foi importado para o Nephele e visualizado na plataforma QIIME 2²⁶. Primeiramente, foi utilizado o software FastQ...

Discussão

O protocolo de metagenômica começa a partir da amostragem do mosto de uva, e quando a levedura foi adicionada ao mosto, o vinho fermentador e amostras finais de vinho. Isso foi seguido pela extração de DNA duplicado que foi extraído com sucesso dessas amostras. As quantidades obtidas variaram em concentração de 15 ng/μL a 87 ng/μL. Isso mostra que o protocolo de extração de DNA é eficaz para estudos metagenômicos do vinho. Embora a qualidade do DNA em A260/A280 varie, isso pode ser atribuído a diferentes pa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose gel	Promega, Madison, WI USA	V3121	Electrophoresis
FastPrep DNA spinKit for soil	MP Biomedicals, Solon, OH USA	116560-200	DNA extraction
FastQC software	Babraham Institute, United Kingdom		Bioinformatics
Fermaid O	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation
High-Fidelity PCR Master Mix	New England Biolabs, USA	F630S	Polymerase chain reaction for sequencing
NEBNext Ultra	New England Biolabs, USA	NEB #E7103	DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
NovaSeq Control Software (NVCS)	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
Novaseq6000 platform	Illumina, San Diego, CA  USA		DNA sequencing
QuiBit	Thermoscientific, Waltham, MA, USA		DNA quantification
Quickdrop spectrophotometer	Molecular device, San Jose, CA, USA		DNA quantification
Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	342483	DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc	Scott Laboratory, Petaluma, CA USA		Fermentation