التحليل المكاني عالي الدقة لمستويات التعبير الجيني في الأوتار

Summary

توضح هذه المقالة كيفية تنفيذ بروتوكول محسن في الموقع للأوتار. تناقش هذه الطريقة تحضير الأنسجة ، ونفاذية القسم ، وتصميم المسبار ، وطرق تضخيم الإشارة.

Abstract

في السنوات الأخيرة ، تم تطوير العديد من البروتوكولات لعلم النسخ عالي الدقة في العديد من المجالات الطبية والبيولوجية المختلفة. ومع ذلك ، فقد تركت الأنسجة الغنية بالمصفوفة ، وعلى وجه التحديد ، الأوتار وراءها بسبب انخفاض عدد الخلايا ، وانخفاض كمية الحمض النووي الريبي لكل خلية ، ومحتوى المصفوفة العالي ، مما جعل تحليلها معقدة. واحدة من أحدث وأهم أدوات الخلية المفردة هي التحليل المكاني لمستويات التعبير الجيني في الأوتار. تتمتع أدوات الحمض النووي الريبي المكانية هذه بأهمية عالية على وجه التحديد في الأوتار لتحديد موقع خلايا معينة من مجموعات جديدة وغير معروفة ، والتحقق من صحة نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، وإضافة سياق نسيجي إلى بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية. ستمكن هذه الطرق الجديدة من تحليل الحمض النووي الريبي في الخلايا ذات الحساسية الاستثنائية والكشف عن أهداف الحمض النووي الريبي أحادي الجزيء على مستوى الخلية الواحدة ، مما سيساعد على توصيف الأوتار جزيئيا وتعزيز أبحاث الأوتار.

في ورقة الطريقة هذه ، سنركز على الطرق المتاحة لتحليل مستويات التعبير الجيني المكاني على الأقسام النسيجية باستخدام فحوصات تهجين جديدة في الموقع للكشف عن الحمض النووي الريبي المستهدف داخل الخلايا السليمة على مستويات الخلية الواحدة. أولا ، سنركز على كيفية تحضير أنسجة الوتر للمقايسات المختلفة المتاحة وكيفية تضخيم الإشارات الخاصة بالهدف دون ضوضاء في الخلفية ولكن بحساسية عالية وخصوصية عالية. بعد ذلك ، ستصف الورقة طرق نفاذية محددة ، وتصميمات المسبار المختلفة ، واستراتيجيات تضخيم الإشارة المتاحة حاليا. ستمكن هذه الطرق الفريدة لتحليل مستويات النسخ للجينات المختلفة في دقة الخلية المفردة من تحديد وتوصيف خلايا أنسجة الأوتار في السكان الصغار والمسنين لمختلف النماذج الحيوانية وأنسجة الأوتار البشرية. ستساعد هذه الطريقة أيضا في تحليل مستويات التعبير الجيني في الأنسجة الأخرى الغنية بالمصفوفة مثل العظام والغضاريف والأربطة.

Introduction

الأوتار هي الأنسجة الضامة التي تمكن من نقل القوة بين العضلات^{والعظام 1}. من الناحية التنموية ، يتم اشتقاق الخلايا الوسيطة من الخلايا الوسيطة داخل تصلب الجسيدات². أوتار الأطراف مشتقة من الأديم المتوسط الجانبي. وتنشأ الأوتار القحفية من سلالة القمة العصبية القحفية^3،4. يمكن تمييز الوتر بالتعبير عن عامل نسخ التصلب⁵ ، على الرغم من أن العديد من العلامات تلعب أيضا دورا رئيسيا في تطور الأوتار ، بما في ذلك tenomodulin و mohawk واستجابة النمو المبكر 1/2^6،7،8،9.

على الرغم من العلامات القليلة المعروفة للوتر ، بشكل عام ، لا يزال التوصيف الأكثر تعمقا يمثل تحديا لأن الوتر يحتوي على خلايا تمتد عبر تدرج من الخصائص الميكانيكية الحيوية. من الوصلة العضلية ، ووسط الوتر في منتصف الجسم ، والوتر الأكثر تكلس ، توجد خلايا الأوتار في مصفوفات خارج الخلية تتراوح في خصائص الشد. نظرا لأن الوتر يجب أن يتحمل إجهاد الشد الذي يفرضه الاختلاف في القوة الميكانيكية بين الأنسجة الرخوة والصلبة ، فإن التنظيم المكاني للخلايا في الوتر مهم بشكل خاص لوظيفته. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن هذه المجموعات السكانية الفرعية للأوتار.

يمكن استخدام العديد من أدوات النسخ المكاني عالية الدقة للبدء في توضيح المجموعات السكانية الفرعية للخلايا ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر ، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو التهجين في الموقع . ومع ذلك ، في حين أن فحوصات التنميط المكاني هذه تساعد في الكشف عن تعبير الحمض النووي الريبي عبر الأنسجة بعد التشريح المجهري أو التقسيم ، فإن هذه الطرق يمكن أن تكون صعبة عند إجراؤها على أنسجة الأوتار. الأوتار عبارة عن أنسجة غنية بالمصفوفة تتكون من ما يقرب من 86٪ من الكولاجين بواسطة الكتلة الجافة¹⁰ ، مما يجعل من الصعب استخراج الخلايا للتسلسل. نظرا لكل من المضاعفات في عزل الخلايا عن المصفوفة ، والطبيعة تحت الخلايا للوتر¹¹ ، وعدد الحمض النووي الريبي المنخفض نسبيا ، فإن الوتر هو نسيج يصعب تحليله.

في هذه الورقة ، نقدم طريقة لتحسين فحوصات التهجين الجديدة في الموقع للاستفادة منها للأوتار من خلال توفير طرق تحضير الأنسجة والنفاذية وتصميم المسبار. إلى جانب تقنيات التسلسل الحالية ، قد يساعد هذا الباحثين على توصيف مجموعات الأوتار الفرعية مكانيا عبر الأوتار النامية أو البالغة أو المصابة مع زيادة حساسية الفحص وخصوصيته.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على وفقا للجنة رعاية المؤسسي واستخدامه (IACUC) وإرشادات AAALAC. تم إجراء التجارب بموجب #2013N000062 بروتوكولي معتمد في مستشفى ماساتشوستس العام. في هذه الدراسة, C57BL / J6 الفئران (5 أسابيع من العمر و P0) تم استخدامها. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد العينة والتثبيت

1. قتل الفئران في غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم كطريقة ثانوية للقتل الرحيم. ثم استخدم المقص لقطع الأطراف الخلفية للفأر على طول مفصل الورك¹². في قارورة التلألؤ ، اغمر الطرف الخلفي للفأر في محلول بارافورمالدهايد (PFA) كاف بنسبة 4٪ لتغطية العينة بالكامل ، وإصلاح الأنسجة لمدة 24 ساعة.
   ملاحظة: بدلا من 4٪ PFA ، يمكن أيضا استخدام 10٪ فورمالين للتثبيت. بعد التثبيت ، يمكن تخزين العينة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) حتى مزيد من المعالجة. من خلال تثبيت الطرف الخلفي بالكامل ، يمكننا الحفاظ على التوتر على الوتر ولدينا الفرصة لفحص الوتر أو الوتر الأوسط أو الوصلة العضلية.
2. بعد إزالة PFA من قارورة التلألؤ ، اغسل العينة لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام 1x PBS عن طريق إضافة ما يكفي من PBS لتغطية العينة. بعد ذلك ، اغمر الأطراف الخلفية في 0.5 M EDTA عند 4 درجات مئوية مع التحريك لمدة 1-2 أسابيع ، واستبدلها ب EDTA الطازج كل 2-3 أيام.
3. بعد إزالة EDTA ، اغسل العينة لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام 1x PBS ، وقم بتجفيف العينات في 70٪ EtOH ، وقم بتضمينها في البارافين في الاتجاه المطلوب. استخدم تقنيات تقسيم FFPE التقليدية لتقسيم الأنسجة بسمك 3 ميكرومتر ونقل الأقسام إلى شريحة مجهر معالجة ومشحونة (انظر جدول المواد) ¹³.
   ملاحظة: يمكن تخزين الأقسام في درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.
4. إزالة البارافين
   1. اخبز الشرائح على طبق ساخن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم اترك الشرائح تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT). لإزالة شمع البارافين من الشرائح ، ضع الشرائح على رف منزلق وخفضها في طبق تلطيخ مليء بالزيلين. كرر في الزيلين الطازج لمدة 3 × 5 دقائق.
      تنبيه: الزيلين خطير. تعامل معها بعناية.
   2. لإعادة ترطيب الأقسام ، اغمر الشرائح في ما يلي لمدة 5 دقائق لكل غسلة ، كل ذلك في RT: اغسل 2x في 100٪ EtOH ، 1x في 75٪ EtOH مخفف في dH₂O ، 1x في 50٪ EtOH مخفف في PBS ، 1x في 25٪ EtOH مخفف في PBS ، و 2x في PBS.
      ملاحظة: تتم جميع خطوات الجفاف باستخدام الشرائح الموجودة على رف منزلق ومع حلول EtOH المختلفة في تلطيخ الأطباق.

2. RNAscope (ISH التجاري)^{بروتوكول 14} التكيف

1. إعداد الحلول والمجسات
   1. قم بإعداد محلول TEG للمعالجة المسبقة للعينات المقسمة عن طريق الجمع بين 25 ملي مولار من Tris-HCl عند درجة الحموضة 8 و 10 ملي مولار من EDTA و 50 ملي مولار من الجلوكوز. قم بعمل حجم كاف لجميع العينات المراد معالجتها أو تحضير الفائض ؛ تعقيم الترشيح والتخزين في RT ؛ امزج المحلول بشكل صحيح قبل استخدامه.
   2. قم بإعداد ما يكفي من 1x Wash Buffer (انظر جدول المواد) لجميع عمليات الغسيل وتخزينها في RT.
   3. في حمام مائي أو حاضنة 40 درجة مئوية ، قم بتسخين المجسات ذات الأهمية لمدة 10 دقائق. ثم قم بإعداد المجسات وفقا لبروتوكول ISH¹⁴.
2. المعالجة المسبقة للعينات
   1. بدلا من استخدام محلول المعالجة المسبقة الموصى به ، اغمر الشرائح في طبق تلطيخ يحتوي على عازلة TEG لمدة 4 ساعات عند 60 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تمديد حضانة المخزن المؤقت TEG لمدة تصل إلى 6 ساعات إذا كانت الأنسجة كثيفة بشكل خاص أو إذا كان استرجاع المستضد لفكرة ربط الحمض النووي الريبي ذات الأهمية أمرا صعبا. في هذه الحالة ، يمكن إضافة نقطة توقف هنا ، حيث يتم تجفيف الشرائح وحفظها في ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل.
   2. قم بإزالة العينات من المخزن المؤقت واتركها تجف. بعد ذلك ، ارسم حول العينات بقلم حاجز كاره للماء ، واغمرها في طبق تلطيخ آخر يحتوي على البروتياز الرابع ، واحتضنها في فرن لمدة 45 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      ملاحظة: نوصي باستخدام البروتياز الوريدي للفئران البالغة. في حالة استخدام الفئران الأصغر سنا ، مثل P0 ، نوصي باستخدام إنزيم أكثر اعتدالا ، مثل البروتياز III ، لمدة 30 دقيقة. عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها للأعمار المختلفة ، راقب سلامة الوتر وتحقق من تدهوره. إذا كانت الأنسجة تنفصل أو متدهورة ، فقم بتقليل وقت الحضانة أو تغيير البروتياز المستخدم.
   3. اغسل العينات مرة أخرى في المخزن المؤقت TEG لمدة 30 دقيقة ثم قم بتهجين المجسات وفقا لبروتوكول ISH¹⁴.
   4. أضف 50-100 ميكرولتر من كاشف التركيب أعلى العينة. ضع غطاء فوق العينات للفحص المجهري. عند التصوير ، استخدم تكبيرا عاليا (هدف 40x أو أعلى) لعرض الإشارة.

3. بروتوكول HCR^{ISH 15} التكيف

1. التثبيت اللاحق
   1. تحضير 4٪ PFA (في PBS) ، محلول PBT (0.1٪ Tween-20 في PBS) ، والبروتيناز K في PBS (تركيز المخزون 10 مجم / مل ، التركيز النهائي 5 ميكروغرام / مل).
   2. لبدء خطوة الإصلاح الأولى ، اغمر الشرائح في طبق تلطيخ يحتوي على 4٪ PFA لمدة 5 دقائق ؛ بعد ذلك ، قم بإزالة محلول PFA بنسبة 4٪ وتخزينه للاستخدام في الخطوات اللاحقة. اشطف الشرائح لمدة 2 × 5 دقائق في محلول PBT وقم بإزالة محلول PBT. ضع الشرائح في طبق تلطيخ يحتوي على محلول البروتيناز K (5 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق واشطفها في محلول PBT 2 × 5 دقائق.
   3. ابدأ خطوة postfix الثانية واغمر الشرائح في 4٪ PFA لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: هذا هو نفس 4٪ من PFA المحفوظة من الخطوة 3.1.2.
   4. اشطف الشرائح لمدة 3 × 5 دقائق في محلول PBT.
      ملاحظة: تتم جميع خطوات التثبيت مع الشرائح الموجودة على رف منزلق وفي أطباق تلطيخ تحتوي على المحاليل المعنية.
2. الأسيتيل
   1. تحضير محلول الأستلة الذي يحتوي على 625 ميكرولتر من أنهيدريد الخليك ، و 3.3 مل من 1 M ثلاثي إيثانول أمين (TEA) ، و 246 مل من ddH₂O. تأكد من الخلط جيدا واستخدامه مباشرة بعد التحضير.
   2. ضع الشرائح في محلول الأستلة لمدة 10 دقائق ثم اشطفها 3 × 5 دقائق في محلول PBT. اشطف الشرائح في ddH₂O واتركها تجف في الهواء لمدة 30 دقيقة. ثم ارسم حول العينات بقلم حاجز كاره للماء.
      ملاحظة: تتم جميع خطوات الأستلة باستخدام الشرائح الموجودة على رف منزلق وفي أطباق تلطيخ تحتوي على المحاليل المعنية
3. التهجين
   1. قم بتسخين المخزن المؤقت للتهجين إلى 37 درجة مئوية وقم بتسخين غرفة مرطبة مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
      تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت على الفورماميد، وهو مادة خطرة. إذا لم تكن الشرائح جافة بدرجة كافية ، فقم بمسح الحواف بمنديل مختبري لإزالة الدرجة العالية_{الزائدة 2}O.
   2. قم بإعداد محاليل المسبار عن طريق إضافة 0.4 مللي مول من كل خليط مسبار إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين.
      ملاحظة: في حالة استخدام تصوير dHCR ، استخدم تركيزا أعلى من المسبار لتحسين كفاءة تهجين المسبار.
   3. قم بإعداد 4 لتر من كلوريد الصوديوم سترات الصوديوم (20x SSC) عن طريق الجمع بين 3 M كلوريد الصوديوم (701.1 جم من كلوريد الصوديوم في حجم نهائي قدره 4 لتر) و 0.3 متر من Na₃CH₆H₅O₇ • 2H₂O (352.8 جم) ثم ضبط الرقم الهيدروجيني النهائي إلى 7 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك أو 10 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم. أضف ما يكفي من H₂O للوصول إلى 4 لتر ، قم بإعداد 5x SSCT عن طريق تخفيف 20x SSC إلى 5x وإضافة ما يكفي من 10٪ Tween 20 بحيث يكون 0.1٪ من الحجم الإجمالي.
   4. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين إلى العينة ، ضع الشرائح في غرفة مرطبة ، واترك الشرائح تحتضن لمدة 10 دقائق. قم بإزالة محلول التهجين واستنزاف المخزن المؤقت الزائد على الشريحة عن طريق نشاف الحواف بمسح معملي.
   5. أضف 100 ميكرولتر من محلول المسبار المحضر أعلى العينة وضع غطاء على العينة. احتضن في فرن طوال الليل أو لمدة 12-16 ساعة في غرفة مرطبة بمحلول يحتوي على 5x SSC و 50٪ فورماميد. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: نظرا لأن الحضانة بين عشية وضحاها ، فإن إضافة الغطاء هو تقليل التبخر.
   6. اترك حصة من محلول SSCT 5x في حمام مائي 37 درجة مئوية وكمية ثانية في RT. توقع أحجام هذه الحصص المطلوبة بناء على رقم العينة وعدد عمليات الغسيل في الخطوة التالية.
4. غسل
   1. باستخدام محلول SSCT 5x المسخن مسبقا ، قم بإعداد 75٪ مخزن غسيل / 25٪ 5x SSCT ، و 50٪ مخزن غسيل / 50٪ 5x SSCT ، و 25٪ مخزن غسيل / 75٪ 5x محاليل SSCT.
   2. لإزالة المجسات الزائدة ، اغمر الشرائح على التوالي لمدة 15 دقيقة لكل غسلة عند 37 درجة مئوية في 75٪ مخزن غسيل / 25٪ 5x SSCT ، 50٪ مخزن غسيل / 50٪ 5x SSCT ، و 25٪ مخزن غسيل / 75٪ 5x SSCT. اسمح للغطاء أن تطفو من العينات.
   3. احتضن الشرائح 2 × 15 دقيقة مع 100٪ 5x SSCT ثم اغمرها في 5x SSCT لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة: يمكن إجراء خطوات الغسيل باستخدام الشرائح الموجودة على رف منزلق وفي أطباق تلطيخ تحتوي على المحاليل المعنية أو مع إضافة المحاليل على شكل قطرات.
5. التضخيم
   1. قم بإعداد 6 مللي مول من دبوس الشعر h1 و 6 مللي مول من دبوس الشعر h2 عن طريق التبريد المفاجئ 2 ميكرولتر من مخزون 3 ميكرومتر (يسخن عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ويبرد إلى RT). حماية دبابيس الشعر من الضوء أثناء هذه العملية.
      ملاحظة: يتم توفير دبابيس الشعر HCR h1 و h2 في مخزن تخزين دبوس الشعر وهي جاهزة للتبريد المفاجئ. التقط دبابيس الشعر الباردة h1 و h2 في أنابيب منفصلة.
   2. جفف الشرائح عن طريق نشاف حوافها بمنديل معملي. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم أعلى العينة وضعه في غرفة مرطبة لمدة 30 دقيقة في RT. قم بإعداد خليط دبوس الشعر عن طريق إضافة دبابيس شعر h1 المبردة ودبابيس الشعر h2 المبردة إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم في RT.
   3. قم بإزالة المخزن المؤقت للتضخيم واستنزاف السائل الزائد على الشريحة عن طريق نشاف الحواف بمنديل مختبري. أضف 100 ميكرولتر من خليط دبوس الشعر المحضر مسبقا وضع البارافيلم فوق العينة. احتضن الشرائح لمدة لا تقل عن 4 ساعات أو طوال الليل في غرفة مظلمة ومرطبة في RT.
   4. لإزالة دبابيس الشعر الزائدة ، اغمر الشرائح في 5x SSCT في طبق تلطيخ واحتضنها في RT لمدة 30 دقيقة. كرر الغسيل في 5x SSCT طازج لمدة 30 دقيقة ، ومرة ثالثة لمدة 5 دقائق.
   5. جفف الشرائح عن طريق نشاف الحواف بمنديل مختبري وأضف 50-100 ميكرولتر من كاشف التثبيت أعلى العينة. ضع غطاء فوق العينات للفحص المجهري. عند التصوير ، استخدم تكبيرا عاليا (هدف 40x أو أعلى) لعرض الإشارة.

النتائج

الشكل 1: تعبير Poly A RNA في وتر العرقوب في الفأر البالغ باستخدام RNAScope. صورة تمثيلية لوضع العلامات الناجحة على بولي أ في وتر العرقوب للفأر (اللوحة اليسرى) باستخدام مقايسة ISH التجار?...

Discussion

في هذه الورقة ، نصف التعديلات التي تم إجراؤها للاستفادة من أدوات ISH الحالية بحيث يمكن استخدامها في أنسجة الأوتار بدرجة عالية من الخصوصية والحساسية. نظرا لأن الوتر عبارة عن نسيج عالي الكثافة ، فيجب إجراء تعديلات على البروتوكول في كثير من الأحيان لتحقيق درجات مماثلة من اخ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M triethanolamine buffer
10% Formalin solution
10% Tween-20
20x Saline Sodium Citrate buffer
4% PFA
ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V2	ACD	323100
Acetic Anhydride
Axio Imager Microscope	ZEISS
C57BL/J6 mice		JAX ID: 000664
Coverslips	Fisher	12-541-042
ddH2O
ETDA	Thermofisher	AM9262
EtOH
Glucose	VWR Chemicals BDH	BDH9230-500G
HCR RNA-FISH Bundle	Molecular Instruments Inc.
HybEZ II Hybridization System	ACD
Immedge Barrier Pen	Vector Laboratories	H4000
Leica SPE Confocal Microscope	Leica
Parafilm	Fisher
Phosphate-buffered saline (PBS, 1x)	Invitrogen	AM9625	Dilute 10x PBS in milli-Q water to get 1x solution
Protease IV
Proteinase K	Roche	3115836001
RNAscope H2O2 and Protease Reagents	ACD	PN 322381	Included in ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V3
RNAscope Multiplex Fluorescent Detection Kit	ACD	PN 323110	Included in ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V2
RNAscope Target Retrieval reagents	ACD	322000	Included in ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V4
RNAscope Wash Buffer	ACD	PN 310091	Included in ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V5
RNAscope Probe Diluent	ACD	300041
Slide holder	StatLab	4465A
Staining Dish with Lid	StatLab	LWS20WH
Superfrost Plus Microscope slides	Fisher	1255015	treated, charged slides
Tris-HCl
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L