مقايسة النواة الدقيقة على الدم الكامل المحفوظ بالتبريد

Summary

نقدم هنا بروتوكولا محسنا لمقايسة النواة الدقيقة المكونة من كتلة السيتوكينات على عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد. هذه الطريقة المثلى للحفظ بالتبريد للدم الكامل لتحليل النواة الدقيقة هي تقنية موثوقة لأخذ العينات على نطاق واسع والدراسات متعددة المراكز ويمكن استخدامها في المقايسات الأخرى المتعلقة بالدم أيضا.

Abstract

مقايسة النواة الدقيقة في كتلة السيتوكينات في المختبر (CBMN) هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع في أبحاث البيولوجيا الإشعاعية ، وقياس الجرعات البيولوجية ، ودراسات السمية الجينية ، واختبار الحساسية الإشعاعية في المختبر . تعتمد هذه الطريقة الوراثية الخلوية على اكتشاف النوى الدقيقة في الخلايا ثنائية النواة الناتجة عن شظايا الكروموسومات المتخلفة أثناء انقسام الخلايا. عينات الدم الكاملة الطازجة هي أكثر أنواع العينات المفضلة لفحص CBMN. ومع ذلك ، فإن عيوب العمل مع عينات الدم الطازجة تشمل المعالجة الفورية بعد جمع الدم والعدد المحدود من التحليلات المتكررة التي يمكن إجراؤها دون أخذ عينات دم إضافية.

نظرا لأن الحاجة إلى عينات دم جديدة يمكن أن تكون صعبة من الناحية اللوجستية ، فإن مقايسة CBMN على عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد ستكون ذات فائدة كبيرة ، خاصة في دراسات المرضى واسعة النطاق. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتجميد عينات الدم الكاملة وإجراء فحص CBMN على عينات الدم المجمدة هذه. تم تجميد عينات الدم من المتطوعين الأصحاء وإذابتها في نقاط زمنية مختلفة ثم إخضاعها لبروتوكول فحص النواة الدقيقة المعدل. توضح النتائج أن هذا الإجراء الأمثل يسمح بأداء مقايسة CBMN على عينات الدم المجمدة. قد يكون بروتوكول الحفظ بالتبريد الموصوف مفيدا جدا أيضا للمقايسات الوراثية الخلوية الأخرى ومجموعة متنوعة من المقايسات الوظيفية التي تتطلب تكاثر الخلايا الليمفاوية.

Introduction

منذ اكتشافه ، كان استخدام الإشعاع المؤين (IR) موضع نقاش بين الباحثين بسبب آثاره الضارة على الكائنات الحية. عادة ما يتجلى التأثير الضار من خلال تلف الحمض النووي مثل الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل (DSBs) ، ويؤدي الفشل في إصلاح هذه DSBs إلى انحرافات وطفرات كروموسومية ، وهي سمات مميزة مهمة للسرطان ^1,2. يمكن فحص هذه الانحرافات الكروموسومية بواسطة المقايسات الخلوية مثل مقايسة النواة الدقيقة لكتلة السيتوكينات (CBMN). النوى الدقيقة هي شظايا كروموسومية متخلفة لا يمكن دمجها في النوى البنوية، ومن ثم تترك وراءها أثناء الانقسام الميتوزي.

CBMN هي تقنية وراثية خلوية شائعة الاستخدام وموثوقة لتقييم تلف الكروموسومات لدى الأفراد المعرضين للإشعاع المؤين في الجسم الحي أو في المختبر. يمكن استخدام الدم الكامل الطازج أو خلايا الدم أحادية النواة المحيطية المعزولة (PBMCs) في اختبار CBMN. الدم الكامل الطازج هو في الغالب المادة البيولوجية المفضلة لأن عزل ومعالجة PBMCs يمكن أن يستغرق وقتا طويلا ويرافقه فقدان بلازما المصل التي تعمل كوسيط داعم لبقاء الخلايا ونموها. لتحقيق محصول جيد من الخلايا ثنائية النواة ، يجب معالجة الدم الكامل الطازج مباشرة بعد جمعه. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الحاجة إلى المعالجة الفورية صعبة من الناحية اللوجستية أثناء ضيق الوقت. علاوة على ذلك ، عندما يفترض الحصول على العديد من العينات على مدى فترة طويلة أو جمعها في نقاط بعيدة عن مراكز المعالجة ، يمكن أن يكون تخزين عينات الدم الطازجة عاملا مقيدا ^3,4.

علاوة على ذلك ، للسماح بتحليل MN المتكرر في نفس الفرد / المريض ، سيكون تجميد عينات الدم مفيدا. تتمثل إحدى طرق تخزين الخلايا الليمفاوية للتطبيق اللاحق لمقايسة CBMN في تجميد PBMCs^{المعزولة 5,6}. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية عدة خطوات معالجة قبل تجميد PBMCs. لذلك ، فإن الحفظ بالتبريد للدم الكامل سيمثل بديلا بسيطا وفعالا من حيث الوقت للحفظ بالتبريد ل PBMCs المعزولة. لا يتوفر سوى القليل من المعلومات المتعلقة باستخدام الدم الكامل المجمد للمقايسات الوراثية الخلوية أو المقايسات التي تتطلب تكاثر الخلايا الليمفاوية. تشير ورقة واحدة فقط إلى استخدام الدم الكامل المحفوظ بالتبريد لتحليل الطور^{الاستوائي 7}.

نظرا لأن الحفظ بالتبريد للدم الكامل سيوفر العديد من المزايا في مجال المراقبة الحيوية وقياس الجرعات الحيوية وتقييم الحساسية الإشعاعية ، فقد قامت مجموعتنا بتحسين بروتوكول الحفظ بالتبريد للدم الكامل الذي يسمح بتطبيق اختبار CBMN⁸. لقد أثبتنا أن الخلايا الليمفاوية الموجودة في مزارع الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد تحتفظ بسلامتها الجينومية وقدرتها على الانتشار لمدة 1 سنة على الأقل. في ورقة الطرق هذه ، نصف بالتفصيل إجراء الحفظ بالتبريد وبروتوكول فحص CBMN ، والذي تم تحسينه بواسطة Beyls et ^al.8 ، والإبلاغ عن النتائج التي تم الحصول عليها لعينات الدم المجمدة ل 30 فردا سليما. بالنسبة لفحص CBMN ، تم تشعيع مزارع الدم في المختبر بجرعات 0.5 و 1 و 2 Gy لتقييم استجابة MN في الخلايا الليمفاوية لعينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد.

Protocol

في هذه الدراسة ، تم جمع عينات الدم عن طريق بزل الوريد من 30 متبرعا صحيا تتراوح أعمارهم بين 17 و 65 عاما. تم إعادة استخدام بيانات MN من 20 متبرعا من ورقة Beyls et ^al.8 يتوافق جمع عينات الدم مع المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة غنت (رقم التسجيل: 2019/1565) ، بلجيكا. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المشاركين. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. جمع عينات الدم

1. قبل البدء ، تأكد من توفر الموافقة الخطية المستنيرة للمشاركين واتباع الإرشادات الأخلاقية بشكل صحيح.
2. اجمع الدم في أنابيب Li-Heparin واحفظه في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح جاهزا للمعالجة للحفظ بالتبريد.

2. الحفظ بالتبريد للدم الكامل

ملاحظة: يتم إجراء جميع الخطوات حتى يتم حصاد الخلايا بشكل معقم في تدفق الهواء الصفحي المعقم.

1. للحفاظ على 1 مل من الدم بالتبريد ، اصنع 1 مل من وسط التجميد عن طريق خلط 800 ميكرولتر من مصل عجل الجنين (FCS) و 200 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
   ملاحظة: يتم تحضير وسط التجميد بحجم مساو لعينات الدم التي يجب تجميدها.
2. للحفظ بالتبريد للدم الكامل ، انقل عينة الدم من أنبوب الهيبارين إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 أو 50 مل
   ملاحظة: تعتمد سعة الأنبوب على حجم الدم.
3. دوامة الدم بسرعة منخفضة مع إضافة مستمرة ولكن قطرة من حجم متساو من وسط التجمد.
4. نقل 2 مل من مزيج تجميد الدم إلى كريوفيال (2 مل) حيث تحتوي كل حصة على 1 مل من عينة الدم الممزوجة ب 1 مل من خليط التجميد.
5. تجميد تدريجي تدريجي
   1. انقل الكريوفيالات إلى صندوق تبريد يحتوي على الأيزوبروبانول وضعها في الفريزر (-80 درجة مئوية) طوال الليل.
   2. نقل cryovials إلى النيتروجين السائل للاستخدام على المدى الطويل.

3. ذوبان الدم المحفوظ بالتبريد

ملاحظة: للحد من الوقت الإجمالي لعملية الذوبان ، يجب التعامل مع 8 كريوفيال كحد أقصى (2 مل لكل منهما) في المرة الواحدة.

1. اعداد
   1. قم بتسخين 200 مل من المحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات (PBS) إلى 37 درجة مئوية قبل إذابة الدم.
   2. إعداد حل عملي لوسط الاستزراع المطلوب في ظل ظروف معقمة. تأكد من أن الوسط لكل مزرعة يحتوي على 1.6 مل من الوسط الكامل: وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) مكملة بالبنسلين / الستربتومايسين (0.5٪) ، 0.2 مل من FCS ، 20 ميكرولتر من بيروفات الصوديوم ، و 2 ميكرولتر من β-mercaptoethanol.
      ملاحظة: نظرا لأنه يمكن فقدان عدد كبير من خلايا الدم أثناء الذوبان ، يتم استزراع الدم المذاب في آبار صغيرة مثل 24 صفيحة بئر بحجم إجمالي 2 مل. يتم استخدام لوحة واحدة متعددة الآبار لكل جرعة.
   3. لكل بئر مزرعة ، أشر إلى رمز المتبرع و A / B على الغطاء جنبا إلى جنب مع التاريخ والجرعة ، كما هو مقترح أدناه (الشكل 1).

الشكل 1: التخطيط المقترح للوحة 24 بئرا لزراعة الدم الكامل لفحص النواة الدقيقة. ضع علامة على الآبار وأشر إلى رموز المانحين في الأماكن المناسبة على الغطاء. لكل عينة مريض ، يجب أن تكون الآبار المكررة مجاورة لبعضها البعض. لاحظ أنه تخطيط موحي لميزاء 10 × 10 ويمكن تغييره وفقا لحجم ميزاء أو عينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. خطوات ذوبان وزراعة الدم الكامل
   1. قم بتسخين حمام الماء إلى 37 درجة مئوية.
   2. أخرج المبردات المطلوبة من النيتروجين السائل (يعتمد العدد على المتطلبات مثل عدد الجرعات).
      ملاحظة: يحتوي المبرد الواحد على 1 مل من الدم و 1 مل من وسط التجمد. لذلك ، يمكن إنشاء ثقافتين بالدم من cryovial واحد.
   3. قم بإذابة الجليد جزئيا في حمام الماء الدافئ (حتى لا تزال تظهر بلورات الثلج الصغيرة).
   4. أخرج القوارير من الحمام المائي ونظف الجزء الخارجي من القوارير بورق مناديل معقمة.
   5. في غطاء تدفق الهواء الصفحي المعقم ، افتح القوارير ببطء شديد لمنع فقاعات الهواء المتكونة داخل الأنابيب من الانسكاب.
   6. أعد تعليق محتويات كل قارورة وانقلها بشكل فردي إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل (1 أنبوب لكل قارورة).
   7. إلى الأنابيب المعنية ، أضف قطرة قطرة 1 مل من برنامج تلفزيوني دافئ (37 درجة مئوية) أثناء تدوير الأنبوب برفق. أعد التعليق باستخدام ماصة P1000.
   8. للتخفيف والغسيل المنتظم ، أضف 7 مل من PBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) وأعد التعليق باستخدام ماصة P1000.
   9. جهاز طرد مركزي الدم لمدة 8 دقائق عند 180 × جم (مع ضبط عند التسارع 1 ، الفرامل 1) في درجة حرارة الغرفة.
   10. خلال خطوة الانتظار هذه ، املأ الآبار الفارغة (بخلاف تلك التي سيتم فيها زراعة الخلايا) ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
   11. ضع ألواح البئر مرة أخرى في الحاضنة للتسخين.
   12. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، تاركا وراءها حوالي 1 مل لتجنب إزعاج حبيبات الخلية.
   13. أعد تعليق الحبيبات في المادة الطافية المتبقية باستخدام ماصة P1000.
   14. أضف 8 مل من برنامج تلفزيوني دافئ (37 درجة مئوية) إلى الأنابيب المعنية أثناء تدوير الأنابيب برفق. بعد ذلك ، أعد التعليق باستخدام ماصة P1000.
   15. جهاز طرد مركزي الدم المعلق لمدة 8 دقائق عند 180 × جم (مع ضبط عند التسارع 9 ، الفرامل 9).
   16. خلال خطوة الانتظار هذه ، قم بنقل 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر من الآبار المحددة.
   17. احتفظ بالألواح مرة أخرى في الحاضنة لتبقى عند 37 درجة مئوية.
   18. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بحركة مستمرة (لتجنب إزعاج حبيبات الخلية السائبة) ، ولكن اترك وراءك حوالي 80 ميكرولتر من المادة الطافية.
   19. إلى الحبيبات ، أضف 280 ميكرولتر من FCS (درجة حرارة الغرفة) وأعد التعليق (إلى حجم إجمالي 360 ميكرولتر).
   20. نقل 180 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر وإعادة تعليقه (= 0.5 مل من "الدم" / الثقافة). يبلغ الحجم الإجمالي في كل بئر الآن 380 ميكرولتر ، مما ينتج عنه طبقة متوسطة 2 مم.
   21. احتضان الألواح في حاضنة CO₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل قبل التشعيع.

4. مقايسة G0 MN

1. أخرج الألواح من الحاضنة وقم بتشعيع ثقافة الخلية بالجرعات المطلوبة مثل الأشعة السينية 0.5 و 1 و 2 Gy (220 كيلو فولت ، 13 مللي أمبير ، 0.15 مم نحاس) في درجة حرارة الغرفة. استخدم العينات المشععة الوهمية كعناصر تحكم لتحديد عوائد MN التلقائية.
2. بعد التشعيع مباشرة ، أضف 1.62 مل من وسط الاستزراع (37 درجة مئوية) إلى كل بئر.
3. لتحفيز انقسام الخلايا في الخلايا اللمفاوية التائية ، أضف 40 ميكرولتر من Phytohemagglutinin (PHA) إلى كل بئر وأعد تعليقه جيدا.
4. ضع هذه الألواح مرة أخرى في الحاضنة (5٪ CO₂ ، 37 درجة مئوية).
   ملاحظة: سيكون هذا هو وقت بدء الفحص.
5. منع التحفيز الخلوي بعد 23 ساعة من التحفيز عن طريق إضافة 8 ميكرولتر من السيتوكلاسين B (6 ميكروغرام / مل) لكل بئر وإعادة التعليق بشكل صحيح.
6. حصاد مزارع الخلايا 70 ساعة بعد وقت التحفيز / الثقافة. أعد تعليق الخلايا ونقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. شطف كل بئر مع 2 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة هذا البرنامج الرسولي إلى أنبوب 15 مل المعني.
7. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 8 دقائق في 180 × غرام ، في درجة حرارة الغرفة.
8. تخلص من المادة الطافية ولكن اترك حوالي 500 ميكرولتر فوق الحبيبات.
9. دوامة الحبيبات (بأقصى سرعة) وأثناء الدوامة ، أضف ببطء قطرة قطرة 2 مل من كلوريد البوتاسيوم البارد (KCl ، 4 °C).
10. أجهزة الطرد المركزي على الفور الخلايا في 180 × غرام لمدة 8 دقائق.
11. تخلص من المادة الطافية ، تاركا حوالي 500 ميكرولتر من المادة الطافية.
12. دوامة الحبيبات (بأقصى سرعة) وأثناء الدوامة ، أضف ببطء قطرة قطرة 2 مل من المثبت البارد 1 (محلول الميثانول / حمض الخليك / رينجر بنسبة 4: 1: 5).
13. اترك أنابيب العينة طوال الليل عند 4 درجات مئوية (الحد الأدنى 12 ساعة والحد الأقصى 96 ساعة).
14. أجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 × غرام.
15. تخلص من المادة الطافية.
16. دوامة الحبيبات (بأقصى سرعة) وأثناء الدوامة ، أضف ببطء قطرة 2 مل من المثبت البارد 2 (الميثانول / حمض الخليك بنسبة 4: 1).
17. أجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 × غرام.
18. تخلص من المادة الطافية.
19. دوامة الحبيبات (بأقصى سرعة) ثم أضفها ببطء (قطرة) ، بينما الدوامة ، 2 مل من المثبت البارد 2 إلى الحبيبات.
20. اترك أنابيب العينة عند 4 درجات مئوية (الحد الأدنى 12 ساعة والحد الأقصى 96 ساعة).
21. نظف الشرائح باستخدام الأيزوبروبانول وقم بتسميتها بشكل صحيح.
    ملاحظة: استخدم الملصقات المطبوعة لوضع الملصقات حيث يمكن مسح حبر العلامة بسهولة أثناء المعالجة.
22. أجهزة الطرد المركزي أنابيب العينة لمدة 8 دقائق في 180 × غرام.
23. نقل المادة الطافية إلى أنبوب آخر لتركيز الخلايا وفقا لحجم الحبيبات.
24. دوامة بيليه.
25. إسقاط 40 ميكرولتر من الخلايا الثابتة على شريحة جافة ونظيفة.
26. دع الشرائح تجف في درجة حرارة الغرفة. تخزين الشرائح في مربع أو وصمة عار على الفور للمراقبة.

5. تلطيخ البرتقال أكريدين (AO)

1. اغمر الشرائح في بقعة AO لمدة 1 دقيقة ، متبوعا بغسل سريع في الماء المقطر ، ثم ضع الشرائح في محلول الفوسفات (درجة الحموضة 6.8) لمدة 1 دقيقة.
2. أخرج الشرائح من المحلول العازل وباستخدام ورق مناديل نظيف ، وجفف الجزء الخلفي من الشرائح ، وضع الشرائح على ورق مناديل نظيف.
3. قم بإسقاط 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفوسفات أعلى الشريحة وقم بتغطيته برفق بغطاء نظيف ، وتجنب فقاعات الهواء.
4. ختم هذه الشرائح مع الاسمنت السيليكون.
   ملاحظة: نظرا لأن AO حساس للضوء ويتلاشى بمرور الوقت ، للحصول على تباين لطيف ومضان ، يوصى بتسجيل الشرائح في غضون 5 أيام من تلطيخها. قم دائما بتخزين الشرائح في غرفة باردة (4 درجات مئوية) ، عندما لا يتم فحصها.

6. تسجيل الشرائح الملطخة

1. ضع شريحتك تحت المجهر الفلوري وافحص 1000 خلية ثنائية النواة (BNs). عد يدويا MNs ، والتي تعد واحدة من المؤشرات الحيوية الستة للسمية. للقيام بذلك ، اطلب من اثنين من الهدافين المستقلين فحص 500 خلية BN / شريحة تحت نفس التكبير.
   ملاحظة: فيما يلي بعض النقاط البارزة لمعايير التسجيل ، على النحو الموصى به من قبل Fenech لتسجيل الشرائح الملطخة⁹
   1. حدد خلية BN من خلال البحث عن خلايا مستديرة بشكل جيد مع سيتوبلازم سليم ، مع نواتين متميزتين جيدا من نفس الحجم تقريبا والشكل المنتظم ونمط التلطيخ. تأكد من أن السيتوبلازم في خلية BN يمكن تمييزه عن السيتوبلازم في الخلية المجاورة.
   2. سجل MN ، مع ملاحظة أنه مطابق شكليا للنواة الرئيسية ولكنه أصغر منها ؛ حتى أكبر MN لا يمكن أن يكون أكثر من 1/3 من قطر النوى الرئيسية. سجل MN فقط إذا لم يلمس النوى الرئيسية أو على الأقل يمكن تمييز الحدود النووية الدقيقة عن حدود النوى الرئيسية.

النتائج

للتحقق من قابلية استنساخ البروتوكول ، أجرينا اختبار MN على عينات دم محفوظة بالتبريد ل 30 متطوعا سليما تتراوح أعمارهم بين 17 و 65 عاما. متوسط عمر المجموعة هو 35 سنة. تراوح وقت الحفظ بالتبريد من 1 أسبوع إلى 154 أسبوعا. بعد تعريض مزرعة خلايا الدم بأكملها لجرعات إشعاعية مختلفة (0.5 و 1 و 2 غراي) ، تم فحص إنتاج النوى الدقيقة في خلايا 1000 BN تحت المجهر. تشير الخلايا ثنائية النواة المستديرة بشكل جيد (كما هو موضح في الشكل 2) إلى استرجاع ناجح للخلايا السليمة القابلة للحياة من عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد. وتجدر الإشارة إلى أن الاستجابة الإشعاعية للخلايا الليمفاوية ظلت مستقرة بعد التخزين طويل الأجل في درجات حرارة منخفضة للغاية (النيتروجين السائل). وتتماشى هذه الملاحظة مع الاستجابة المتوقعة من عينات الدم الجديدة.

الشكل 2: النوى الدقيقة كما لوحظ في الخلايا ثنائية النواة المسترجعة من عينة دم كاملة مجمدة تم حفظها بالتبريد قبل عام واحد. (أ) التكبير 200x، (ب) التكبير 400x؛ الأسهم التي تشير إلى MNs. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مع زيادة جرعات الإشعاع (0.5 و 1 و 2 غراي) ، لوحظت زيادة خطية تربيعية في إنتاجية النواة الدقيقة (الجدول 1 والشكل 3). تمثل غلة MN في عينات التحكم المشععة الوهمية (0 Gy) غلة MN الخلفية التي هي أساسا نتيجة للكروموسومات المتأخرة.

الجرعة (غراي)	0	0.5	1	2
متوسط	18	107	247	601
إس دي	10.8	23.9	53.3	101.1
السيرة الذاتية (٪)	59.9	22.3	21.6	16.8
نطاق	5-41	62-140	139-324	395-755

الجدول 1: نطاق ومعامل التباين جنبا إلى جنب مع متوسط غلة MN ، كما لوحظ في عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد ل 30 متبرعا صحيا ، مما يدل على التباين بين الأفراد. الاختصارات: CV = معامل الاختلاف ؛ SD = الانحراف المعياري.

الشكل 3: غلة النوى الدقيقة كما لوحظ في عينات الدم الكاملة الضابطة والمحفوظة بالتبريد المشععة ل 30 متبرعا. تراوحت فترات الحفظ بالتبريد من 1 أسبوع إلى 154 أسبوعا. يظهر الرسم البياني للرسم المبعثر القيم الفردية. تمثل الخطوط في المجموعات متوسط ± SD للمجموعة. الاختصارات: MN = micronuclei; BN = ثنائي النواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

للتحقيق في التباين بين الأفراد في عائد MN للأشخاص ، تم حساب معامل الاختلاف (CV) (انظر الجدول 1). بالنسبة ل MN الناجم عن الإشعاع ، تم الحصول على CV < 25٪ لجميع الجرعات (0.5 و 1 و 2 Gy) ، مما يشير إلى قابلية جيدة لاستنساخ البروتوكول المعدل.

Discussion

البروتوكول المعدل لتطبيق مقايسة CBMN هو وسيلة سهلة ومريحة نسبيا لتخزين عينات الدم بكميات كبيرة. يحدد الإجراء كل التفاصيل الدقيقة ولكن المهمة التي يجب الاهتمام بها أثناء الحفظ بالتبريد وفحص CBMN. تستخدم بروتوكولات المختبر الأخرى عادة 10٪ DMSO في خليط التجميد ، بينما يحتوي خليط التجميد لدينا على 20٪ DMSO جنبا إلى جنب مع 80٪ FCS⁷. نظرا لأن خليط التجميد هذا يضاف بأحجام متساوية إلى عينة الدم الكاملة ، فإن التركيز النهائي هو أيضا 10٪ DMSO. لتحسين معدل بقاء الخلية وتحفيز انقسام الخلايا ، نضيف 1٪ بيروفات الصوديوم و 0.1٪ بيتا ميركابتوإيثانول إلى وسط الاستزراع الكامل (cRPMI). هذا يتوافق مع بروتوكول زراعة الخلايا الذي وضعته مجموعتنا البحثية ^6,8.

على الرغم من أن مشكلة تكتل الخلايا أثناء الذوبان لا يمكن حلها بالكامل في هذا البروتوكول ، إلا أن فصل الخلايا كان أفضل من البروتوكولات التقليدية الأخرى. بدلا من الإضافة المتسقة والمفاجئة لوسائط الاستزراع لاستعادة الخلايا بعد الذوبان ، حصلنا على نتائج أفضل عند إضافة PBS المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بالتنقيط أثناء خطوات الغسيل. يساعد هذا التحسن في تقليل الإجهاد الخلوي ويقلل من التكتل مع استعادة عالية مثبتة للخلايا. علاوة على ذلك ، لا يمكن ملاحظة أي اختلاف واضح في صلاحية الخلية عند استخدام PBS عبر RPMI. تم التحقق من صحة المجموعة من أن طول فترة الحفظ بالتبريد (حتى 1 سنة) لن يؤثر على غلة MN ، سواء في العينات المشععة وغير المشععة ^6,8. تشير الدراسات إلى أنه يمكن تحقيق قابلية جيدة للخلايا وتكاثر PBMCs من خلال التجميد التدريجي عند درجات حرارة منخفضة (النيتروجين السائل) ، تليها الإضافة التدريجية للوسط المسخن مسبقا أثناء إذابة^10,11. أظهر الباحثون أن المجموعات الفرعية للخلايا اللمفاوية التائية في الدم الكامل المذاب قابلة للمقارنة مع تلك التي لوحظت في PBMCs^{المذابة 12}. علاوة على ذلك ، ثبت أن الأنواع الفرعية للخلايا المستردة من عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد تشبه تلك التي لوحظت في عينات الدم الكاملة الطازجة^13,14.

إذا قمنا بفحص النتائج الإرشادية التي تم الحصول عليها في التقرير ، فإننا نرى أن الزيادة التربيعية الخطية مع الجرعة (الشكل 3) تتفق مع تقارير الأدبيات الأخرى حول النوى الدقيقة التي يسببها نقل الطاقة الخطي (LET)^15,16. التباين في غلة MN التي لوحظت في عينات الدم الكاملة المحفوظة بالتبريد (الجدول 1) في نطاق مع التباين المبلغ عنه لمزارع الدم الكامل الطازجة^8،17،18. تم التحقق من صحة البروتوكول الموصوف بالتفصيل هنا على دم كامل طازج ومحفوظ بالتبريد ل 20 متطوعا سليما⁸. كان مؤشر الانقسام النووي (NDI) ، وهو معلمة مهمة لتكاثر الخلايا لوحظ في هذا التقرير⁸ ، متفقا مع المؤشر المقترح للدم الكامل الطازج^19,20. مجتمعة ، يوفر هذا البروتوكول الأمثل للحفظ بالتبريد للدم الكامل ومقايسة النواة الدقيقة المعدلة إنتاجية أفضل للخلايا ، وبالتالي ، يوصى بتكييف هذا البروتوكول لتقييم الحساسية الإشعاعية. نظرا لأن قابلية استنساخ البروتوكول قد تم التحقق منها بالفعل⁸ ، يقترح أن يكون قابلا للتطبيق في الدراسات واسعة النطاق ومتعددة المراكز.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifuge tubes	Greiner	188271
24-well cell suspension plate	VWR	734-2779
96% alcohol	ChemLab	CL00.1807.2500
Acetic acid	Merck life science	8,18,75,52,500
Acridine orange	Merck life science	235474-5g
CaCl2	Merck life science	C5670-100g
cover slips	VWR	631-1365	22 x 50
Cryobox (Mr.Frosty)	Nalgene, Sigma Aldrich
Cryovials 2ml	Novolab	A04573
Cytochalsin B	Merck life science	C6762-10	10 mg
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Merck life science	D4540-500ml
Fetal calf serum (FCS)	Thermo Fischer scientific	10270-106
Fixative 1			Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5
Fixative 2			Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1
GURR buffer	Thermo Fischer scientific	10582013	phosphate buffer (pH 6.8)
KCl	Merck life science	1,04,93,60,250	75 mM
KH2PO4	Merck life science	1,04,87,30,250
Li-heparin tubes	BD Life sciences	367526-LH170 I.U.	BD Vacutainer
Methanol	fisher scinetific	M/4000/17
Na2HPO2	Merck life science	10,65,80,500
NaCl	Merck life science	S7653-1kg
Object slides	VWR	MENZAA00000112E04
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fischer scientific	15140-122	10,000 U/mL + 10,000 µg/mL
Phytohemagglutinin (PHA-M)	Thermo Fischer scientific	10576-015
Ringer solution			contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water
RPMI-1640	Thermo Fischer scientific	52400041
Silicon rubber adhesive sealent	collall	CF-100
Sodium pyruvate	Thermo Fischer scientific	11360039
Sterile warm PBS (37 °C)			contains NaCl,  Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water
β-mercaptoethanol	Thermo Fischer scientific	31350-010