Il test del micronucleo su sangue intero crioconservato

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per il test del micronucleo del blocco della citochinesi su campioni di sangue intero crioconservato. Questo metodo ottimizzato di crioconservazione del sangue intero per l'analisi del micronucleo è una tecnica affidabile per il campionamento su larga scala e gli studi multicentrici e può essere utilizzato anche per altri test correlati al sangue.

Abstract

Il test in vitro del micronucleo a blocco di citochinesi (CBMN) è una tecnica ampiamente utilizzata nella ricerca in radiobiologia, nella dosimetria biologica, negli studi di genotossicità e nei test di radiosensibilità in vitro . Questo metodo citogenetico si basa sull'individuazione di micronuclei in cellule binucleate derivanti da frammenti cromosomici in ritardo durante la divisione cellulare. I campioni di sangue intero fresco sono il tipo di campione preferito per il test CBMN. Tuttavia, gli svantaggi di lavorare con campioni di sangue fresco includono l'elaborazione immediata dopo la raccolta del sangue e il numero limitato di analisi ripetute che possono essere eseguite senza ulteriori prelievi di sangue.

Poiché la necessità di campioni di sangue fresco può essere logisticamente impegnativa, il test CBMN su campioni di sangue intero crioconservati sarebbe di grande vantaggio, soprattutto negli studi su pazienti su larga scala. Questo documento descrive un protocollo per congelare campioni di sangue intero ed eseguire il test CBMN su questi campioni di sangue congelato. I campioni di sangue di volontari sani sono stati congelati e scongelati in diversi momenti e poi sottoposti a un protocollo di analisi del micronucleo modificato. I risultati dimostrano che questa procedura ottimizzata consente l'esecuzione del test CBMN su campioni di sangue congelato. Il protocollo di crioconservazione descritto può essere molto utile anche per altri saggi citogenetici e per una varietà di saggi funzionali che richiedono linfociti proliferanti.

Introduzione

Fin dalla sua scoperta, l'uso delle radiazioni ionizzanti (IR) è stato oggetto di dibattito tra i ricercatori a causa dei suoi effetti negativi sugli esseri viventi. L'effetto dannoso si manifesta solitamente con danni al DNA come le rotture a doppio filamento (DSB) e la mancata riparazione di questi DSB porta ad aberrazioni cromosomiche e mutazioni, che sono importanti segni distintivi del cancro ^1,2. Tali aberrazioni cromosomiche possono essere esaminate mediante saggi citogenici come il test del micronucleo a blocchi di citochinesi (CBMN). I micronuclei sono frammenti cromosomici ritardati che non possono essere incorporati nei nuclei figli e, quindi, vengono lasciati durante la mitosi.

La CBMN è una tecnica citogenetica affidabile e comunemente usata per valutare il danno cromosomico in individui esposti a radiazioni ionizzanti in vivo o in vitro. Nel test CBMN possono essere utilizzati sangue intero fresco o cellule mononucleate isolate del sangue periferico (PBMC). Il sangue intero fresco è per lo più il materiale biologico di scelta poiché l'isolamento e l'elaborazione delle PBMC possono richiedere molto tempo ed è accompagnata da una perdita di plasma sierico che funge da mezzo di supporto per la sopravvivenza e la crescita cellulare. Per ottenere una buona resa cellulare binucleata, il sangue intero fresco deve essere trattato immediatamente dopo la raccolta. Tuttavia, la necessità di un'elaborazione immediata può essere logisticamente impegnativa a causa dei vincoli di tempo. Inoltre, quando si suppone che molti campioni vengano acquisiti per un periodo prolungato o raccolti in punti lontani dai centri di elaborazione, la conservazione di campioni di sangue fresco può essere un fattore limitante ^3,4.

Inoltre, per consentire l'analisi MN ripetuta nello stesso individuo/paziente, sarebbe utile il congelamento dei campioni di sangue. Un modo per conservare i linfociti per una successiva applicazione del test CBMN è il congelamento delle PBMC isolate ^5,6. Questa tecnica, tuttavia, richiede diverse fasi di elaborazione prima che le PBMC possano essere congelate. Pertanto, la crioconservazione del sangue intero rappresenterebbe un'alternativa semplice ed efficiente in termini di tempo alla crioconservazione di PBMC isolate. Sono disponibili poche informazioni sull'uso del sangue intero congelato per i saggi citogenetici o per i saggi che richiedono la proliferazione dei linfociti. Solo un articolo riporta l'uso di sangue intero crioconservato per l'analisi della metafase⁷.

Poiché la crioconservazione del sangue intero offrirebbe molti vantaggi nel campo del biomonitoraggio, della biodosimetria e della valutazione della radiosensibilità, il nostro gruppo ha ottimizzato un protocollo di crioconservazione per il sangue intero che consente l'applicazione del test CBMN⁸. Abbiamo dimostrato che i linfociti presenti nelle colture di sangue intero crioconservate mantengono la loro integrità genomica e la capacità di proliferazione per almeno 1 anno. In questo documento sui metodi, descriviamo in dettaglio la procedura di crioconservazione e il protocollo del saggio CBMN, che è stato ottimizzato da Beyls et ^al.8, e riportiamo i risultati ottenuti per campioni di sangue congelati di 30 individui sani. Per il test CBMN, le emocolture sono state irradiate in vitro con dosi di 0,5, 1 e 2 Gy per valutare la risposta MN nei linfociti di campioni di sangue intero crioconservato.

Protocollo

Per questo studio, sono stati raccolti campioni di sangue mediante venipuntura da 30 donatori sani di età compresa tra 17 e 65 anni. I dati MN di 20 donatori sono stati riutilizzati dall'articolo di Beyls et ^al.8 La raccolta dei campioni di sangue è conforme alle linee guida del Comitato etico dell'ospedale universitario di Gand (numero di registrazione: 2019/1565), Belgio. È stato ottenuto il consenso informato scritto da parte di tutti i partecipanti. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Raccolta di campioni di sangue

1. Prima di iniziare, assicurati che sia disponibile il consenso informato scritto dei partecipanti e che le linee guida etiche siano seguite correttamente.
2. Raccogliere il sangue in provette di Li-eparina e conservarlo a temperatura ambiente fino al momento della lavorazione per la crioconservazione.

2. Crioconservazione del sangue intero

NOTA: Tutte le fasi fino alla raccolta delle cellule vengono eseguite in modo asettico in flusso d'aria laminare sterile.

1. Per crioconservare 1 mL di sangue, preparare 1 mL di terreno di congelamento mescolando 800 μL di siero fetale di vitello (FCS) e 200 μL di dimetilsolfossido (DMSO).
   NOTA: Il terreno di congelamento viene preparato in un volume pari ai campioni di sangue che devono essere congelati.
2. Per la crioconservazione del sangue intero, trasferire il campione di sangue dalla provetta eparinizzata alle provette da centrifuga da 15 o 50 mL
   NOTA: La capacità della provetta dipende dal volume del sangue.
3. Vorticare il sangue a bassa velocità con l'aggiunta continua ma goccia a goccia di un uguale volume di mezzo di congelamento.
4. Trasferire 2 mL di miscela per congelamento del sangue in crioviali (2 mL) dove ogni aliquota contiene 1 mL di campione di sangue miscelato con 1 mL di miscela congelante.
5. Congelamento graduale graduale
   1. Trasferire i crioviali in una criobox contenente isopropanolo e metterli in congelatore (-80 °C) per una notte.
   2. Trasferire i crioviali in azoto liquido per un uso a lungo termine.

3. Scongelamento del sangue crioconservato

NOTA: Per limitare il tempo totale del processo di scongelamento, è necessario gestire un massimo di 8 crioviali (2 mL ciascuno) alla volta.

1. Preparazione
   1. Preriscaldare 200 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) a 37 °C prima di scongelare il sangue.
   2. Preparare una soluzione di lavoro del terreno di coltura richiesto in condizioni sterili. Assicurarsi che il terreno per coltura includa 1,6 mL di terreno completo: terreno di coltura Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) integrato con penicillina/streptomicina (0,5%), 0,2 mL di FCS, 20 μL di piruvato di sodio e 2 μL di β-mercaptoetanolo.
      NOTA: Poiché un numero significativo di cellule del sangue può essere perso durante lo scongelamento, il sangue scongelato viene coltivato in piccoli pozzetti come piastre da 24 pozzetti con un volume totale di 2 ml. Viene utilizzata una piastra a più pozzetti per dose.
   3. Per ogni pozzetto di coltura, indicare il codice del donatore e A/B sul coperchio insieme alla data e alla dose, come suggerito di seguito (Figura 1).

Figura 1: Layout suggerito di una piastra a 24 pozzetti per la coltura di sangue intero per il test del micronucleo. Contrassegnare i pozzetti e indicare i codici donatori nei punti appropriati del coperchio. Per ogni campione del paziente, i pozzetti duplicati devono essere adiacenti l'uno all'altro. Si noti che si tratta di un layout suggestivo per un collimatore 10 x 10 e può essere modificato in base alle dimensioni del collimatore o dei campioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Passaggi per lo scongelamento e la coltura del sangue intero
   1. Riscaldare il bagnomaria a 37 °C.
   2. Estrarre i crioviali necessari dall'azoto liquido (il numero dipende dai requisiti, come il numero di dosi).
      NOTA: Un crioviale contiene 1 mL di sangue e 1 mL di terreno di congelamento. Pertanto, è possibile impostare due colture con sangue proveniente da un crioviale.
   3. Scongelare parzialmente i crioviali a bagnomaria (fino a quando non sono ancora visibili piccoli cristalli di ghiaccio).
   4. Estrarre i flaconcini dal bagnomaria e pulire l'esterno dei flaconcini con carta velina sterile.
   5. In una cappa sterile a flusso d'aria laminare, aprire i flaconcini molto lentamente per evitare che le bolle d'aria formatesi all'interno delle provette fuoriescano fuori.
   6. Risospendere il contenuto di ciascun flaconcino e trasferirlo singolarmente in una provetta da centrifuga conica da 15 mL (1 provetta per flaconcino).
   7. Alle rispettive provette, aggiungere goccia a goccia 1 mL di PBS caldo (37 °C) mentre si agita delicatamente la provetta. Risospendere con una pipetta P1000.
   8. Per la diluizione e il lavaggio uniforme, aggiungere goccia a goccia 7 mL di PBS preriscaldato (37 °C) e risospendere con una pipetta P1000.
   9. Centrifugare il sangue per 8 minuti a 180 × g (con impostazione all'accelerazione 1, freno 1) a temperatura ambiente.
   10. Durante questa fase di attesa, riempire i pozzetti vuoti (diversi da quello in cui verranno coltivate le cellule) con 500 μL di PBS.
   11. Riposizionare le piastre a pozzetti nell'incubatrice per preriscaldarle.
   12. Una volta completata la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante, lasciando circa 1 mL per evitare di disturbare il pellet cellulare.
   13. Risospendere il pellet nel surnatante rimanente con una pipetta P1000.
   14. Aggiungere goccia a goccia 8 mL di PBS caldo (37 °C) nelle rispettive provette agitando delicatamente le provette. Successivamente, risospendere con una pipetta P1000.
   15. Centrifugare il sangue risospeso per 8 min a 180 × g (con impostazione ad accelerazione 9, freno 9).
   16. Durante questa fase di attesa, trasferire 200 μL di terreno di coltura in ciascuno dei pozzetti contrassegnati.
   17. Tenere le piastre nell'incubatrice per rimanere a 37 °C.
   18. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con un movimento continuo (per evitare di disturbare il pellet di cellule sciolte), ma lasciare circa 80 μL del surnatante.
   19. Al pellet aggiungere 280 μL di FCS (temperatura ambiente) e risospendere (per un volume totale di 360 μL).
   20. Trasferire 180 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto e risospendere (= 0,5 mL di "sangue"/coltura). Il volume totale in ogni pozzetto è ora di 380 μL, con conseguente strato medio di 2 mm.
   21. Incubare le piastre in un incubatore a CO₂ a 37 °C per almeno 10 minuti prima dell'irradiazione.

4. Saggio G0 MN

1. Estrarre le piastre dall'incubatore e irradiare la coltura cellulare con le dosi richieste come raggi X da 0,5, 1 e 2 Gy (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) a temperatura ambiente. Utilizzare campioni irradiati fittizi come controlli per identificare le rese spontanee di MN.
2. Subito dopo l'irradiazione, aggiungere 1,62 mL di terreno di coltura (37 °C) in ciascun pozzetto.
3. Per stimolare la divisione cellulare nei linfociti T, aggiungere 40 μL di fitoemoagglutinina (PHA) a ciascun pozzetto e risospendere accuratamente.
4. Rimettere queste piastre nell'incubatrice (5% CO₂, 37 °C).
   NOTA: Questa sarà l'ora di inizio del test.
5. Bloccare la citochinesi 23 ore dopo la stimolazione aggiungendo 8 μL di citocalasina B (6 μg/mL) per pozzetto e risospendere correttamente.
6. Prelevare le colture cellulari 70 ore dopo la stimolazione/coltura. Risospendere e trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. Sciacquare ogni pozzetto con 2 mL di PBS e aggiungere questo PBS alla rispettiva provetta da 15 mL.
7. Centrifugare le provette per 8 minuti a 180 × g, a temperatura ambiente.
8. Scartare il surnatante ma lasciare circa 500 μL sul pellet.
9. Agitare il pellet (alla massima velocità) e durante il vortice, aggiungere lentamente 2 mL di cloruro di potassio freddo (KCl, 4 °C).
10. Centrifugare immediatamente le cellule a 180 × g per 8 min.
11. Scartare il surnatante, lasciando circa 500 μL di surnatante.
12. Agitare il pellet (alla massima velocità) e durante il vortice, aggiungere lentamente 2 mL di fissativo a freddo 1 (soluzione di metanolo/acido acetico/Ringer in un rapporto di 4:1:5).
13. Lasciare le provette per una notte a 4 °C (minimo 12 ore e massimo 96 ore).
14. Centrifugare per 8 minuti a 180 × g.
15. Scartare il surnatante.
16. Vorticare il pellet (alla massima velocità) e durante il vortice, aggiungere lentamente goccia a goccia 2 mL di fissativo freddo 2 (metanolo/acido acetico in un rapporto di 4:1).
17. Centrifugare per 8 min a 180 × g.
18. Scartare il surnatante.
19. Agitare il pellet (alla massima velocità) e poi aggiungere lentamente (goccia a goccia), mentre si vortex, 2 mL di fissativo freddo 2 al pellet.
20. Lasciare le provette a 4 °C (minimo 12 h e massimo 96 h).
21. Pulire i vetrini con isopropanolo ed etichettarli correttamente.
    NOTA: Utilizzare adesivi stampati per etichettare poiché l'inchiostro del pennarello viene facilmente rimosso durante l'elaborazione.
22. Centrifugare le provette per 8 minuti a 180 × g.
23. Trasferire il surnatante in un'altra provetta per concentrare le cellule in base alle dimensioni del pellet.
24. Vorticare il pellet.
25. Far cadere 40 μL delle celle fisse su un vetrino asciutto e pulito.
26. Lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente. Conservare immediatamente i vetrini in una scatola o in una macchia per l'osservazione.

5. Colorazione arancione acridina (AO)

1. Immergere i vetrini in una colorante AO per 1 minuto, seguito da un rapido lavaggio in acqua distillata, quindi posizionare i vetrini in tampone fosfato (pH 6,8) per 1 minuto.
2. Estrarre i vetrini dalla soluzione tampone e con carta velina pulita, asciugare il retro dei vetrini e mettere i vetrini su una carta velina pulita.
3. Far cadere 20 μL di tampone fosfato sulla parte superiore del vetrino e coprirlo delicatamente con un vetrino coprioggetti pulito, evitando la formazione di bolle d'aria.
4. Sigillare questi vetrini con cemento siliconico.
   NOTA: Poiché l'AO è sensibile alla luce e sbiadisce nel tempo, per un buon contrasto e fluorescenza, si consiglia di segnare i vetrini entro 5 giorni dalla colorazione. Conservare sempre i vetrini in una cella frigorifera (4 °C), quando non vengono esaminati.

6. Punteggio dei vetrini macchiati

1. Posiziona il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza ed esamina 1.000 cellule binucleate (BN). Contare manualmente i MN, che sono uno dei sei biomarcatori di tossicità. A tale scopo, due marcatori indipendenti esaminano 500 celle/vetrini da BN con lo stesso ingrandimento.
   NOTA: Di seguito sono riportati alcuni punti salienti dei criteri di punteggio, come raccomandato da Fenech per assegnare un punteggio⁹ ai vetrini colorati
   1. Selezionare una cellula BN cercando cellule ben arrotondate con citoplasma intatto, con due nuclei ben distinti di circa le stesse dimensioni, forma regolare e schema di colorazione. Assicurarsi che il citoplasma della cellula BN sia distinguibile dal citoplasma della cellula adiacente.
   2. Segnare un MN, notando che è morfologicamente identico ma più piccolo dei nuclei principali; anche il MN più grande non può essere più di 1/3 del diametro dei nuclei principali. Segnare un MN solo se non tocca i nuclei principali o almeno il confine micronucleare è distinguibile dal confine dei nuclei principali.

Discussione

Il protocollo modificato per l'applicazione del test CBMN è un modo relativamente semplice e conveniente per conservare campioni di sangue in massa. La procedura delinea tutti i dettagli minuti ma importanti che devono essere curati durante la crioconservazione e il test CBMN. Altri protocolli di laboratorio utilizzano normalmente il 10% di DMSO nella miscela di congelamento, mentre la nostra miscela di congelamento contiene il 20% di DMSO insieme all'80% di FCS⁷. Poiché questa miscela di congelamento viene aggiunta in volumi uguali al campione di sangue intero, anche la concentrazione finale è del 10% di DMSO. Per migliorare il tasso di sopravvivenza cellulare e stimolare la divisione cellulare, aggiungiamo l'1% di piruvato di sodio e lo 0,1% di beta-mercaptoetanolo al terreno di coltura completo (cRPMI). Questo è in accordo con il protocollo di coltura cellulare stabilito dal nostro gruppo di ricerca ^6,8.

Sebbene il problema dell'aggregazione cellulare durante lo scongelamento non potesse essere risolto completamente in questo protocollo, la segregazione cellulare era migliore rispetto agli altri protocolli convenzionali. Invece di un'aggiunta costante e brusca di terreni di coltura per recuperare le cellule dopo lo scongelamento, abbiamo ottenuto risultati migliori quando il PBS preriscaldato (37 °C) è stato aggiunto goccia a goccia durante le fasi di lavaggio. Questo miglioramento aiuta a ridurre lo stress cellulare e riduce al minimo l'aggregazione con un comprovato elevato recupero di cellule. Inoltre, non è stata osservata alcuna chiara differenza nella vitalità cellulare quando il PBS è stato utilizzato su RPMI. È stato convalidato dal gruppo che la durata del periodo di crioconservazione (fino a 1 anno) non influirà sulle rese di MN, sia nei campioni irradiati che in quelli non irradiati ^6,8. Gli studi suggeriscono che una buona vitalità cellulare e la proliferazione delle PBMC possono essere ottenute con un congelamento graduale a basse temperature (azoto liquido), seguito da un'aggiunta graduale di terreno preriscaldato durante lo scongelamento^10,11. I ricercatori hanno dimostrato che le sottopopolazioni di linfociti T nel sangue intero scongelato sono paragonabili a quelle osservate nelle PBMC^{scongelate 12}. Inoltre, è dimostrato che i sottotipi di cellule recuperati da campioni di sangue intero crioconservati sono simili a quelli osservati in campioni di sangue intero fresco^13,14.

Se esaminiamo i risultati indicativi ottenuti nel rapporto, vediamo che l'aumento quadratico lineare con la dose (Figura 3) è in accordo con altri rapporti della letteratura sui micronuclei indotti dal trasferimento di energia lineare (LET)^15,16. La variabilità delle rese di MN osservata nei campioni di sangue intero crioconservato (Tabella 1) è in linea con quella riportata per le colture di sangue intero fresco ^8,17,18. Il protocollo qui descritto in dettaglio è stato validato su sangue intero fresco e crioconservato di 20 volontari sani⁸. L'indice di divisione nucleare (NDI), che è un parametro importante della proliferazione cellulare osservato in tale relazione⁸, era in accordo con quello suggerito per il sangue intero fresco^19,20. Nel complesso, questo protocollo ottimizzato di crioconservazione del sangue intero e il test del micronucleo modificato forniscono una migliore resa cellulare e, pertanto, l'adattamento di questo protocollo è raccomandato per le valutazioni della radiosensibilità. Poiché la riproducibilità del protocollo è già stata validata⁸, si suggerisce di averne l'applicabilità in studi su larga scala e multicentrici.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifuge tubes	Greiner	188271
24-well cell suspension plate	VWR	734-2779
96% alcohol	ChemLab	CL00.1807.2500
Acetic acid	Merck life science	8,18,75,52,500
Acridine orange	Merck life science	235474-5g
CaCl2	Merck life science	C5670-100g
cover slips	VWR	631-1365	22 x 50
Cryobox (Mr.Frosty)	Nalgene, Sigma Aldrich
Cryovials 2ml	Novolab	A04573
Cytochalsin B	Merck life science	C6762-10	10 mg
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Merck life science	D4540-500ml
Fetal calf serum (FCS)	Thermo Fischer scientific	10270-106
Fixative 1			Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5
Fixative 2			Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1
GURR buffer	Thermo Fischer scientific	10582013	phosphate buffer (pH 6.8)
KCl	Merck life science	1,04,93,60,250	75 mM
KH2PO4	Merck life science	1,04,87,30,250
Li-heparin tubes	BD Life sciences	367526-LH170 I.U.	BD Vacutainer
Methanol	fisher scinetific	M/4000/17
Na2HPO2	Merck life science	10,65,80,500
NaCl	Merck life science	S7653-1kg
Object slides	VWR	MENZAA00000112E04
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fischer scientific	15140-122	10,000 U/mL + 10,000 µg/mL
Phytohemagglutinin (PHA-M)	Thermo Fischer scientific	10576-015
Ringer solution			contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water
RPMI-1640	Thermo Fischer scientific	52400041
Silicon rubber adhesive sealent	collall	CF-100
Sodium pyruvate	Thermo Fischer scientific	11360039
Sterile warm PBS (37 °C)			contains NaCl,  Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water
β-mercaptoethanol	Thermo Fischer scientific	31350-010