JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمثل محتوى هيدرو بيروكسيد الدهون المؤشر الأكثر استخداما لموت الخلايا الحديدية. توضح هذه المقالة تحليل قياس التدفق الخلوي خطوة بخطوة لمحتوى هيدرو بيروكسيد الدهون في الخلايا عند تحريض الفيروسات.

Abstract

تفاعل الحديد والأكسجين هو جزء لا يتجزأ من تطور الحياة على الأرض. ومع ذلك ، لا تزال هذه الكيمياء الفريدة تبهر وتحير ، مما يؤدي إلى مشاريع بيولوجية جديدة. في عام 2012 ، أدركت مجموعة من جامعة كولومبيا هذا التفاعل كحدث مركزي يؤدي إلى نوع جديد من موت الخلايا المنظم يسمى "ferroptosis". السمة الرئيسية لداء الحديديات هي تراكم هيدروبيروكسيدات الدهون بسبب (1) الدفاع المضاد للأكسدة المختل وظيفيا و / أو (2) الإجهاد التأكسدي الساحق ، والذي يتزامن في أغلب الأحيان مع زيادة محتوى الحديد الحر في الخلية. يتم منع ذلك عادة عن طريق المحور الكنسي المضاد للحديد الذي يضم ناقل السيستين xCT والجلوتاثيون (GSH) و GSH peroxidase 4 (GPx4). نظرا لأن داء الحديد ليس نوعا مبرمجا من موت الخلايا ، فإنه لا يتضمن مسارات إشارات مميزة لموت الخلايا المبرمج. الطريقة الأكثر شيوعا لإثبات هذا النوع من موت الخلايا هي استخدام مضادات الأكسدة المحبة للدهون (فيتامين E ، ferrostatin-1 ، إلخ) لمنعه. يمكن لهذه الجزيئات الاقتراب من الضرر التأكسدي وإزالة السموم منه في غشاء البلازما. جانب آخر مهم في الكشف عن النمط الظاهري الحديدي هو الكشف عن التراكم السابق لهيدروبيروكسيدات الدهون ، والتي تستخدم لها صبغة محددة BODIPY C11. ستوضح المخطوطة الحالية كيف يمكن إحداث داء الحديد في خلايا الورم الأرومي النخاعي من النوع البري باستخدام محفزات مختلفة: erastin و RSL3 والمتبرع بالحديد. وبالمثل ، سيتم استخدام خلايا xCT-KO التي تنمو في وجود NAC ، والتي تخضع لداء الحديد بمجرد إزالة NAC. يظهر النمط الظاهري "الفقاعي" المميز تحت المجهر الضوئي في غضون 12-16 ساعة من لحظة حدوث داء الحديديات. علاوة على ذلك ، سيتم استخدام تلطيخ BODIPY C11 متبوعا بتحليل FACS لإظهار تراكم هيدروبيروكسيدات الدهون وما يترتب على ذلك من موت الخلايا باستخدام طريقة تلطيخ PI. لإثبات الطبيعة الحديدية لموت الخلايا ، سيتم استخدام ferrostatin-1 كعامل محدد لمنع الإصابة بالفيروسات.

Introduction

Ferroptosis هو نوع من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تعتمد على السياق حديثا من موت الخلايا1. إلى جانب أنواع الأكسجين التفاعلية ، يلعب الحديد دورا (أدوارا) حاسما في هذا النوع من موت الخلايا ، ومن هنا جاء الاسم2. الخطوة الأخيرة والتنفيذية لداء الحديديات هي التراكم المحفز بالحديد للضرر التأكسدي للدهون في غشاء البلازما الذي يؤدي في النهاية إلى ضعف سلامة الغشاء والنفاذية الانتقائية ، وأخيرا موت الخلايا عن طريق الفقاعات. حدث هيدروبيروكسيد الدهون هو ظاهرة تحدث بشكل طبيعي. ومع ذلك ، يتم منع انتشاره في جميع أنحاء الغشاء الخلوي عن طريق الدفاع المضاد للأكسدة للخلية. اللاعب الرئيسي في هذا السياق هو Se-protein glutathione peroxidase 4 (GPx4) ، والذي يمكنه الاقتراب من الغشاء وتحويل هيدروبيروكسيدات الدهون إلى مشتقات الكحول الأقل سمية3. يتم توفير الطاقة المختزلة ل GPx4 بشكل أساسي ، ولكن ليس حصريا ، بواسطة الجلوتاثيون (GSH) ، وهو ثلاثي الببتيد يتكون من الأحماض الأمينية غير الأساسية: الجلايسين والغلوتامات والسيستين. الأحماض الأمينية التي تحد من معدل التخليق الحيوي ل GSH هي السيستين4. على الرغم من تصنيف السيستين على أنه حمض أميني غير أساسي ، إلا أن متطلباته يمكن أن تتجاوز بسهولة إنتاجه الداخلي في الخلايا التكاثرية للغاية (مثل الخلايا السرطانية). وبالتالي تم إعادة تصنيفها في مجموعة الأحماض الأمينية شبه الأساسية. يحدث الاستيراد الضروري للسيستين بشكل رئيسي من خلال نظام Xc ، والذي يسمح باستيراد الشكل المؤكسد (المهيمن) من السيستين (المعروف أيضا باسم السيستين) على حساب تصدير الغلوتامات5. يتكون نظام Xc من وحدة نقل فرعية مستقلة Na + ، تعتمد على Cl ، تعرف باسم xCT ، ووحدة فرعية مرافقة ، تعرف باسم CD98. حتى وقت قريب ، كان ينظر إلى الخصائص المضادة للحديد لمحور xCT-GSH-GPx4 على أنها فريدة وغير قابلة للتكرار6. ومع ذلك ، في عام 2019 ، تم وصف مسار بديل مضاد للحديد ، يتكون من يوبيكوينول (الإنزيم المساعد Q10) وإنزيمه التجديدي - بروتين مثبط الحديدي 1 (FSP1) ، 7,8. بعد ذلك بوقت قصير ، تم الإبلاغ عن نظام آخر لإزالة السموم من هيدرو بيروكسيد الدهون يتضمن GTP cyclohydrolase-1 / tetrahydrobiopterin (GCH1 / BH4)9. ومع ذلك ، يبدو أن الدور المركزي لمحور xCT-GSH-GPx4 في الوقاية من داء الحديديات لا يتم تحديه.

على مدى العقد الماضي ، تمت دراسة داء الحديديات على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من أنواع الأورام ، مما أظهر إمكانات كبيرة كاستراتيجية مضادة للسرطان (تمت مراجعته بواسطة Lei et al.10). علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن أن الخلايا السرطانية التي تظهر مقاومة عالية للعلاج الكيميائي التقليدي و / أو الميل إلى الانتقال حساسة بشكل مدهش لمحفزات داء الحديد ، مثل مثبطات GPx411،12،13. ومع ذلك ، في سياق أورام المخ ، لا تزال إمكانات المحرضات الحديدية غير مدروسة إلى حد كبير. في حين أن هذا النوع من موت الخلايا قد ارتبط ارتباطا وثيقا بإصابة نقص التروية الدماغية14والأمراض التنكسية العصبية15 ، فإن إمكاناته في سياق أورام المخ اقتصرت بشكل أساسي على الورم الأرومي الدبقي ، وهو الورم القحفي الدماغي الخبيث الأكثر شيوعا (تمت مراجعته بواسطة Zhuo et al.16). من ناحية أخرى ، لا تزال حساسية الورم الأرومي النخاعي ، وهو ورم الدماغ الخبيث الأكثر شيوعا لدى الأطفال والسبب الرئيسي لوفيات الأطفال ، لمحفزات داء الحديد غير مستكشفة إلى حد كبير. على حد علمنا ، هناك أدبيات نادرة تمت مراجعتها من قبل الأقران تربط بين داء الحديديات والورم الأرومي النخاعي. ومع ذلك ، فقد كشفت بعض الدراسات أن الحديد يلعب دورا حاسما في البقاء على قيد الحياة والانتشار والإمكانات السرطانية لكل من الخلايا الجذعية لسرطان الورم الأرومي النخاعي والورم الأرومي الدبقي (CSCs)17,18 ، مما قد يجعلها أكثر عرضة لتحريض داء الحديديات. هذا مهم بشكل خاص لأن الورم الأرومي النخاعي يشتهر بسكانه الفرعيين من الخلايا الجذعية السرطانية ، أو الخلايا البادئة / المنتشرة للورم ، والتي يبدو أنها مسؤولة إلى حد كبير عن المقاومة الكيميائية للورم وانتشاره وانتكاسه19.

عادة ما يتم فحص الحساسية لتحريض داء الحديديات عن طريق قياس محتوى / تراكم هيدرو بيروكسيد الدهون ، والذي قد يؤدي أو لا يؤدي إلى موت الخلايا. محرضات داء الحديد الأكثر استخداما هي (1) ممحاة ، مثبط لناقل xCT20 ، (2) RSL3 ، مثبط لإنزيم GPx42 ، و / أو (3) مانحون للحديد ، مثل سترات الأمونيوم الحديدية (FAC) 21. يتم تقييم محتوى هيدرو بيروكسيد الدهون باستخدام المسبار الانتقائي BODIPY 581/591 C1122 ، والذي يحتوي على أقصى إثارة وانبعاث عند 581/591 نانومتر في حالته المنخفضة. عند التفاعل مع هيدروبيروكسيدات الدهون وأكسدتها ، يحول المسبار الحد الأقصى للإثارة والانبعاث إلى 488/510 نانومتر. عادة ، تسبق الزيادة الكبيرة في محتوى هيدرو بيروكسيد الدهون موت الخلايا الحديدية. نظرا لأن داء الحديديات ليس موتا مبرمجا للخلايا ، فلا يوجد سلسلة إشارات جزيئية تؤدي إلى تنفيذه. لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة لتأكيد ذلك هي مراقبة محتوى هيدروبيروكسيد الدهون واستخدام مثبطات محددة لهذا النوع من موت الخلايا ، مثل ferrostatin 123. Ferrostatin 1 هو أحد مضادات الأكسدة المحبة للدهون التي يمكن أن تخترق حجرة الدهون في الخلية وتزيل السموم من هيدروبيروكسيدات الدهون ، وبالتالي تمنع الأحداث الحديدية.

Protocol

أجريت الدراسة الحالية باستخدام خطوط خلايا الورم الأرومي النخاعي من النوع البري DAOY (WT) ، والتي تم استزراعها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في وسط DMEM مع 8٪ FBS. تم الحفاظ على خط الخلية المحذوف xCT في ظل نفس الظروف ، مع إجراء تجارب في وسائط مكملة ب 1 mM N-acetylcysteine (NAC). تم فحص الخلايا بانتظام بحثا عن الميكوبلازما باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن الميكوبلازما المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) وتم استزراعهاحتى المقطع 10.

1. حصاد وبذر الخلايا

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام تقنيات معقمة معقمة في غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة. خلايا الورم الأرومي النخاعي DAOY ملتصقة ، مما يعني أنه يمكن التخلص من جميع الخلايا غير المرتبطة عن طريق الغسيل بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون Ca2+ و Mg2+.

  1. خذ طبق المرق (طبق بتري ، قطر 100 مم) مع الخلايا وقم بإزالة الخلايا العائمة والمتوسطة من اللوحة باستخدام شفاط.
  2. أضف 5-10 مل من PBS إلى الطبق ، واغسل الجزء السفلي بحركات دائرية للطبق ، ثم أخرج PBS من اللوحة باستخدام شفاط.
  3. أضف 1 مل من التربسين (تخفيف 10x) إلى الطبق. احتضن اللوحة حتى يؤدي النقر اللطيف على اللوحة إلى إزاحة الخلايا. خذ 10 مل من وسط زراعة DMEM المكمل ب 8٪ FBS واحصد الخلايا ميكانيكيا من الطبق.
  4. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل.
  5. خذ 500 ميكرولتر من تعليق الخلية وضعه في كوفيت للعد. احسب عدد الخلايا لكل مل من تعليق الخلية. تم استخدام عداد خلية آلي لهذه الدراسة (انظر جدول المواد).
  6. احسب الحجم اللازم لأخذه من معلق الخلية للحصول على 1،00،000 خلية.
  7. خذ صفيحة من 6 آبار وأضف الحجم المحسوب لتعليق الخلية في كل بئر ، ثم أضف وسائط استزراع DMEM مكملة ب 8٪ FBS إلى 2 مل في كل بئر.

2. علاج الخلايا

ملاحظة: يتم إجراء السيطرة والعلاجات في ثلاث نسخ. المجموعات هي كما يلي: التحكم (DMSO) ، 1 ميكرومتر من إراستين ، 0.3 ميكرومتر من RSL3 ، 250 ميكرومتر من FAC ، 2 ميكرومتر من فيروستاتين 1 ، 1 ميكرومتر من إراستين + 2 ميكرومتر من فيروستاتين 1 ، 0.3 ميكرومتر RSL3 + 2 ميكرومتر من فيروستاتين 1 ، 250 ميكرومتر من FAC + 2 ميكرومتر من فيروستاتين 1. هناك حاجة إلى أربع لوحات 6 آبار للتجربة ، كما هو موضح في الجدول 1). يتم سرد التفاصيل التجارية لجميع الكواشف اللازمة في جدول المواد.

  1. بعد 24 ساعة من البذر ، أضف العلاج المقابل إلى البئر مع الخلايا.
  2. اترك الأطباق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في الحاضنة.

3. تلطيخ هيدروبيروكسيدات الدهون للخلايا المعالجة باستخدام مسبار BODIPY 581/591 C11

ملاحظة: يتم تحضير محلول المخزون للمسبار الخاص بهيدرو بيروكسيد الدهون في DMSO بتركيز 1 mM. يتم تخزين حصص محلول المخزون عند -20 درجة مئوية في أنابيب غير شفافة. للتلطيخ ، قم بإعداد حل عمل 2 ميكرومتر للمسبار في وسائط DMEM مكملا ب 8٪ FBS.

  1. 6 ساعات بعد العلاج ، راقب الخلايا تحت المجهر الضوئي (يجب أن يكون تقريب الخلية مرئيا).
  2. أخرج الأطباق من الحاضنة وضعها في غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة.
    باستخدام شفاط ، قم بإزالة الوسائط والخلايا العائمة (الميتة).
  3. أضف 2 مل من PBS برفق إلى كل بئر ، واغسل القاع بحركات دائرية لألواح 6 آبار ، ثم قم بإزالة PBS من الآبار باستخدام شفاط.
  4. أضف 2 مل من محلول عمل المسبار (تركيز نهائي 2 ميكرومتر في DMEM مكمل ب FBS).
  5. اترك الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة في الظلام (يمكن لف الألواح بورق الألمنيوم).

4. تحليل التدفق الخلوي لمحتوى هيدرو بيروكسيد الدهون في الخلايا المعالجة

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات التالية في الظلام (لا توجد أضواء في غطاء التدفق الصفحي).

  1. أخرج الأطباق من الحاضنة وضعها في غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة.
    باستخدام شفاط ، قم بإزالة محلول التلطيخ.
  2. أضف 2 مل من PBS برفق إلى كل بئر ، واغسل القاع بحركات دائرية لألواح 6 آبار ، ثم قم بإزالة PBS من الآبار باستخدام شفاط.
  3. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى وقم بشفط أي برنامج تلفزيوني متبقي من البئر باستخدام شفاط.
  4. أضف 150 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في قاع كل بئر واحتضن اللوحة حتى يؤدي النقر اللطيف على اللوحة إلى إزاحة الخلايا. خذ 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (PBS ، 2 mM EDTA ، 0.5٪ BSA) واحصد الخلايا ميكانيكيا من الآبار.
  5. انقل الخلايا إلى أنبوب FACS المقابل (المحدد مسبقا) مع غطاء المرشح. ضع الأنبوب مع الخلايا على الجليد في الظلام حتى يتم إجراء التحليل (يجب إجراء التحليل في غضون ساعة بعد تلطيخ).
    ملاحظة: يعتمد إعداد ماكينة FACS ومعايرتها على الماكينة المستخدمة (انظر جدول المواد).
  6. قم بإنشاء تجربة جديدة وأعطها اسما (Ferroptosis في DAOY - هيدروبيروكسيدات الدهون).
  7. في تصميم التجربة ، اختر الليزر (488 نانومتر) والفلتر (FITC).
  8. في عرض البيانات ، حدد حجم الخلية المناسب (>12 ميكرومتر) ، واضبط الفولتية PMT (يجب أن يظهر محتوى الخلية في الربع الأول من المخطط النقطي SSC-H / FSC-H) ، وقم ببوابة الرسم النقطي.
  9. أضف مخططا جديدا - مدرجا تكراريا ، مع FITC-A على المحور ص والمقياس اللوغاريتمي.
  10. دوامة العينات في أنبوب FACS ، ضعها في جهاز FACS وقم بتحميل العينة. سجل 10000 حدث فردي FSC وقم بتسمية الملف (على سبيل المثال ، DAOY WT CTL 6h). تصدير الملف بتنسيق .fcs.

5. تلطيخ يوديد البروبيديوم (PI) للخلايا الميتة عند العلاج

ملاحظة: تصميم التجربة هو نفسه تماما لقياس هيدرو بيروكسيد الدهون (انظر الخطوة 1 والخطوة 2).

  1. بعد 24 ساعة من البذر ، أخرج الأطباق من الحاضنة وضعها في غطاء التدفق الصفحي.
  2. جمع الوسائط (مع الخلايا الميتة) في أنبوب 15 مل.
  3. أضف 1 مل من PBS إلى كل بئر ، واغسل القاع بحركات دائرية لألواح 6 آبار ، ثم اجمع PBS في الأنبوب باستخدام الوسائط المعنية.
  4. أضف 200 ميكرولتر من التربسين (تخفيف 10x) في قاع كل بئر واحتضن اللوحة حتى يؤدي النقر اللطيف على اللوحة إلى إزاحة الخلايا. استخدم الوسائط المعنية + PBS لحصاد الخلايا من الآبار.
  5. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 180 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام شفاط.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وضعها على الثلج حتى التحليل.
  7. قبل التحليل مباشرة ، أضف محلول PI (انظر جدول المواد) إلى تركيز نهائي قدره 2 ميكروغرام / مل.

6. تحليل التدفق الخلوي للخلايا الميتة بعد 24 ساعة من العلاج

ملاحظة: تتم إعدادات ومعايرة ماكينة FACS كما هو موضح سابقا (انظر الخطوة 4).

  1. قم بإنشاء تجربة جديدة وأعطها اسما (Ferroptosis في DAOY - موت الخلايا).
  2. في تصميم التجربة ، اختر الليزر (488 نانومتر) والفلتر (PE).
  3. في عرض البيانات ، حدد حجم الخلية المناسب (>12 ميكرومتر) ، واضبط الفولتية PMT (يجب أن يظهر محتوى الخلية في الربع الأول من المخطط النقطي SSC-H / FSC-H) ، وقم ببوابة الرسم النقطي.
  4. أضف مخططا جديدا - مدرجا تكراريا ، مع PE-A على المحور ص والمقياس اللوغاريتمي.
  5. دوامة العينات في أنبوب FACS ، ضعها في جهاز FACS وقم بتحميل العينة.
  6. سجل 10000 حدث فردي FSC وقم بتسمية الملف (على سبيل المثال ، DAOY WT CTL 6h). تصدير الملف بتنسيق .fcs.

7. تحليل التدفق الخلوي لمحتوى هيدرو بيروكسيد الدهون في خلايا DAOY xCT / -

ملاحظة: تم إنشاء خلايا xCT-/- كما هو موضح سابقا24.

  1. في هذه التجربة ، قم بزرع الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2 ، ولكن بدلا من العلاج ، استكمل الوسائط ب 1 mM NAC طوال الليل.
  2. في اليوم التالي ، احتفظ ب NAC في مجموعة واحدة وقم بإزالته من المجموعة الأخرى.
  3. قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لمحتوى هيدرو بيروكسيد الدهون بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة 6.

8. تحليل نتائج مقياس التدفق الخلوي

  1. افتح مستند .fcs في برنامج FlowJo (انظر جدول المواد).
  2. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الفردي لفتح جميع الأحداث (وليس فقط مفردات FCS) المسجلة في العينة الفردية (مخطط نقطة SSC-A / FSC-A). نظرا لأن الإعدادات لا يتم فيها الحفاظ على البوابة التي يتم إجراؤها على الجهاز ، فمن الضروري إنشاء البوابة مرة أخرى وتسمية السكان (على سبيل المثال ، DAOY WT).
  3. انقر نقرا مزدوجا فوق السكان المسورة لفتح نافذة أخرى باستخدام الرسم البياني.
  4. قم بتغيير المحور Y إلى مرشح الفلورسنت المستخدم (Comp-FITC / PE-A).
  5. قم بتغيير المحور X إلى مشروط (تطبيع كل قمة إلى وضعها ، أي إلى٪ من الحد الأقصى لعدد الخلايا الموجودة في حاوية معينة).
  6. انسخ الرسم البياني إلى محرر التخطيط. كرر هذا لجميع العينات ، وفي كل مرة يتم فيها لصق مدرج تكراري جديد في محرر التخطيط ، اسحبه فوق الرسم البياني السابق بحيث يتم تراكب الرسوم البيانية (نصف إزاحة).

النتائج

تم استزراع خط خلايا الورم الأرومي النخاعي DAOY في وسط DMEM قياسي مكمل ب 8٪ FBS حتى وصل إلى التقاء 60٪ تقريبا. في يوم التجربة ، تم حصاد الخلايا ، وتم طلاء 1،00،000 خلية لكل بئر في ألواح من 6 آبار ، وفقا للجدول 1. في اليوم التالي ، عولجت الخلايا (في ثلاث نسخ) إما ب 1 ميكرومتر من الممحاة ، أو 0.3 ميكروم...

Discussion

السمة المميزة الأساسية لموت الخلايا الحديدية هي التراكم غير المنضبط لهيدروبيروكسيدات الدهون في غشاء البلازما. قد يحدث هذا الضرر التأكسدي بطريقة إنزيمية أو غير إنزيمية ، ولكن في كلتا الحالتين ، يكون التفاعل معتمدا على الحديد / محفزا ، وهو ما يفسر اسم هذا النوع من موت الخلايا. غالبا ما يتم ت...

Disclosures

نعلن عدم وجود تضارب في المصالح في الدراسة المقدمة طيه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل حكومة إمارة موناكو ، وكذلك من قبل "Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte لمكافحة السرطان" (GEMLUC) ومؤسسة Flavien ، التي وفرت وسائل شراء BD FACS Melody.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BODIPY 581/591 C11Thermo FisherD3861
Cell counterBeckmanCoulter Z1
DMEM medium Gibco10569010
ErastinSigma-AldrichE7781-5MG
Ferroamminium citrateAcros Organics211842500
Ferrostatin-1Sigma-AldrichSML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)Dominique Dutcher500105N1N
Flow CytometerBD BiosciencesFACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo Fisher11599686
N-acetylcysteineSigma-AldrichA7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection KitInvivoGenrep-pt1
propidium iodideInvitrogenP3566
RSL3Sigma-AldrichSML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mLDominique DutcherX0930-100

References

  1. Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
  2. Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).
  3. Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
  4. Meister, A., Anderson, M. E. Glutathione. Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).
  5. Lewerenzm, J., et al. The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).
  6. Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
  7. Bersuker, K., et al. The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature. 575, 688-692 (2019).
  8. Doll, S., et al. FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature. 575, 693-698 (2019).
  9. Hu, Q., et al. Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis. Front Cell Dev Biol. 10, (2022).
  10. Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer. Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).
  11. Viswanathan, V. S., et al. Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature. 547, 453-457 (2017).
  12. Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer. Redox Biol. 37, 101697 (2020).
  13. Hangauer, M. J., et al. Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature. 551, 247-250 (2017).
  14. Zhang Tuo, Q., et al. Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion. Signal Transduct Target Ther. 7, 59 (2022).
  15. Sun, Y. Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases. Front Aging Neurosci. 14, (2022).
  16. Zhuo, S. Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges. Front Mol Biosci. 9, (2022).
  17. Bisaro, B. Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma. Mol Cell Ther. 3, 8 (2015).
  18. Schonberg, D. L., et al. Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells. Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).
  19. Werbowetski-Ogilvie, T. E. From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma. FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).
  20. Dixon, S. J. Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. Elife. 3, e02523 (2014).
  21. Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells. Cell Death Dis. 4, e592 (2013).
  22. Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology. Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).
  23. Miotto, G. Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1. Redox Biol. 28, 101328 (2020).
  24. Daher, B. Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses. Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).
  25. Shimada, K. Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis. Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).
  26. Yang, W. S. Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).
  27. Gaschler, M. M. FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation. Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).
  28. Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death. Elife. 7, e37503 (2018).
  29. Cheloni, G., Slaveykova, V. I. Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry. Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).
  30. Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma. Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).
  31. Sato, M., et al. The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin's cytotoxicity in cancer cells. Sci Rep. 8, 968 (2018).
  32. Cheff, D. M., et al. The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1. Redox Biol. 62, 102703 (2023).
  33. Wang, C., et al. Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect. Eur J Med Chem. 247, 115072 (2023).
  34. Vucetic, M., et al. Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis. Cell Death Dis. 11, 789 (2020).
  35. Meira, W., et al. A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers (Basel). 13 (6), 1434 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

XCT GPx4 RSL3 C11 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved