Entschlüsselung des ferroptotischen Phänotyps des Medulloblastoms

Zusammenfassung

Der Gehalt an Lipidhydroperoxid ist der am häufigsten verwendete Indikator für den feroptotischen Zelltod. Dieser Artikel zeigt die Schritt-für-Schritt-Durchflusszytometrie-Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts in Zellen nach Ferroptose-Induktion.

Zusammenfassung

Die Wechselwirkung von Eisen und Sauerstoff ist ein integraler Bestandteil der Entwicklung des Lebens auf der Erde. Nichtsdestotrotz fasziniert und rätselt diese einzigartige Chemie immer wieder und führt zu neuen biologischen Unternehmungen. Im Jahr 2012 erkannte eine Gruppe der Columbia University diese Wechselwirkung als zentrales Ereignis, das zu einer neuen Art des regulierten Zelltods namens "Ferroptose" führt. Das Hauptmerkmal der Ferroptose ist die Akkumulation von Lipidhydroperoxiden aufgrund von (1) dysfunktionaler antioxidativer Abwehr und/oder (2) überwältigendem oxidativem Stress, der am häufigsten mit einem erhöhten Gehalt an freiem labilem Eisen in der Zelle zusammenfällt. Dies wird normalerweise durch die kanonische antiferroptotische Achse verhindert, die aus dem Cystintransporter xCT, Glutathion (GSH) und GSH-Peroxidase 4 (GPx4) besteht. Da es sich bei der Ferroptose nicht um eine programmierte Art des Zelltods handelt, sind keine für die Apoptose charakteristischen Signalwege beteiligt. Der gebräuchlichste Weg, diese Art des Zelltods nachzuweisen, ist die Verwendung von lipophilen Antioxidantien (Vitamin E, Ferrostatin-1 usw.), um ihn zu verhindern. Diese Moleküle können sich oxidativen Schäden in der Plasmamembran nähern und diese entgiften. Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Aufklärung des ferroptotischen Phänotyps ist der Nachweis der vorangegangenen Akkumulation von Lipidhydroperoxiden, für die der spezifische Farbstoff BODIPY C11 verwendet wird. Das vorliegende Manuskript wird zeigen, wie Ferroptose in Wildtyp-Medulloblastomzellen mit Hilfe verschiedener Induktoren induziert werden kann: Erastin, RSL3 und Eisendonor. In ähnlicher Weise werden die xCT-KO-Zellen verwendet, die in Gegenwart von NAC wachsen und nach der Entfernung von NAC einer Ferroptose unterzogen werden. Der charakteristische "bubble" Phänotyp ist unter dem Lichtmikroskop innerhalb von 12-16 Stunden ab dem Zeitpunkt der Auslösung der Ferroptose sichtbar. Darüber hinaus wird eine BODIPY C11-Färbung mit anschließender FACS-Analyse verwendet, um die Akkumulation von Lipidhydroperoxiden und den daraus resultierenden Zelltod mit der PI-Färbemethode zu zeigen. Um die ferroptotische Natur des Zelltods nachzuweisen, wird Ferrostatin-1 als spezifisches Ferroptose-verhinderndes Mittel verwendet.

Einleitung

Ferroptose ist eine neu kontextualisierte, von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) abhängige Art des Zelltods¹. Neben ROS spielt Eisen eine entscheidende Rolle(n) bei dieser Art des Zelltods, daher der Name². Der letzte und ausführende Schritt der Ferroptose ist die eisenkatalysierte Akkumulation oxidativer Schäden an Lipiden in der Plasmamembran, die schließlich zu einer Beeinträchtigung der Membranintegrität und selektiven Permeabilität und schließlich zum Zelltod durch Blasenbildung führt. Das Lipid-Hydroperoxidationsereignis ist ein natürlich vorkommendes Phänomen. Seine Ausbreitung in der Zellmembran wird jedoch durch die antioxidative Abwehr der Zelle verhindert. Der Hauptakteur in diesem Zusammenhang ist die Se-Protein-Glutathionperoxidase 4 (GPx4), die sich der Membran nähern und Lipidhydroperoxide in ihre weniger toxischen Alkoholderivate^{umwandeln kann 3}. Die reduzierende Kraft für GPx4 wird hauptsächlich, aber nicht ausschließlich, durch Glutathion (GSH) bereitgestellt, ein Tripeptid, das aus den nicht-essentiellen Aminosäuren Glycin, Glutamat und Cystein besteht. Die geschwindigkeitsbestimmende Aminosäure für die Biosynthese von GSH ist Cystein⁴. Obwohl Cystein als nicht-essentielle Aminosäure eingestuft wird, kann sein Bedarf seine interne Produktion in stark proliferativen Zellen (wie Krebszellen) leicht übersteigen. Damit wurde es wieder in die Gruppe der semi-essentiellen Aminosäuren eingeordnet. Der notwendige Import von Cystein erfolgt hauptsächlich durch das Xc-System, das den Import der oxidierten (dominanten) Form von Cystein (aka Cystin) auf Kosten des Glutamatexports^{ermöglicht 5}. Das Xc-System setzt sich aus einer Na+-unabhängigen, Cl-abhängigen Transportuntereinheit, bekannt als xCT, und einer Chaperon-Untereinheit, bekannt als CD98, zusammen. Bis vor kurzem galten die antiferroptotischen Eigenschaften der xCT-GSH-GPx4-Achse als einzigartig und unreproduzierbar⁶. Im Jahr 2019 wurde jedoch ein alternativer antiferroptotischer Signalweg, bestehend aus Ubiquinol (Coenzym Q10) und seinem regenerativen Enzym - dem Ferroptose-Suppressorprotein 1 (FSP1) - beschrieben ^7,8. Bald darauf wurde über ein weiteres Lipidhydroperoxid-Entgiftungssystem mit GTP-Cyclohydrolase-1/Tetrahydrobiopterin (GCH1/BH4) berichtet⁹. Nichtsdestotrotz scheint die zentrale Rolle der xCT-GSH-GPx4-Achse bei der Prävention der Ferroptose nicht in Frage gestellt zu werden.

In den letzten zehn Jahren wurde die Ferroptose bei einer Vielzahl von Tumorarten ausgiebig untersucht, was ein großes Potenzial als Anti-Krebs-Strategie zeigt (überprüft von Lei et ^al.10). Darüber hinaus wurde berichtet, dass Krebszellen, die eine hohe Resistenz gegen konventionelle Chemotherapeutika und/oder eine Neigung zur Metastasierung aufweisen, überraschend empfindlich auf Ferroptose-Induktoren, wie z. B. Inhibitoren von GPx4 11,12,13, reagieren. Im Zusammenhang mit Hirntumoren ist das Potenzial ferroptotischer Induktoren jedoch noch weitgehend wenig untersucht. Während diese Art des Zelltods eng mit zerebralen Ischämie-Reperfusionsschäden¹⁴und neurodegenerativen Erkrankungen¹⁵ in Verbindung gebracht wurde, beschränkte sich ihr Potenzial im Zusammenhang mit Hirntumoren hauptsächlich auf das Glioblastom, den häufigsten bösartigen Schädel-Hirn-Tumor (überprüft von Zhuo et ^al.16). Auf der anderen Seite ist die Empfindlichkeit des Medulloblastoms, dem häufigsten bösartigen Hirntumor bei Kindern und einer der Hauptursachen für die Kindersterblichkeit, gegenüber Ferroptose-Induktoren weitgehend unerforscht. Nach unserem Kenntnisstand gibt es kaum begutachtete Literatur, die Ferroptose und Medulloblastom in Verbindung bringt. Nichtsdestotrotz haben einige Studien gezeigt, dass Eisen eine entscheidende Rolle für das Überleben, die Proliferation und das tumorigene Potenzial sowohl von Medulloblastom- als auch von Glioblastom-Krebsstammzellen (CSCs) ^spielt17,18 und sie möglicherweise anfälliger für Ferroptose-Induktion macht. Dies ist von besonderer Bedeutung, da das Medulloblastom berüchtigt ist für seine Subpopulation von CSCs oder tumorinitiierenden/-vermehrenden Zellen, die weitgehend für die Chemoresistenz, Dissemination und den Rückfall von Tumoren verantwortlich zu sein scheinen¹⁹.

Die Empfindlichkeit gegenüber der Ferroptose-Induktion wird in der Regel durch Messung des Gehalts/der Akkumulation von Lipidhydroperoxiden untersucht, die zum Zelltod führen können oder auch nicht. Die am häufigsten verwendeten Ferroptose-Induktoren sind (1) Erastin, ein Inhibitor des xCT-Transporters²⁰, (2) RSL3, ein Inhibitor des GPx4-Enzyms², und/oder (3) Eisendonoren, wie z. B. Ferroammoniumcitrat (FAC)²¹. Der Gehalt an Lipidhydroperoxid wird mit der selektiven Sonde BODIPY 581/591 C11²² bestimmt, die im reduzierten Zustand Anregungs- und Emissionsmaxima bei 581/591 nm aufweist. Bei Wechselwirkung mit und Oxidation durch Lipidhydroperoxide verschiebt die Sonde ihre Anregungs- und Emissionsmaxima auf 488/510 nm. Typischerweise geht ein signifikanter Anstieg des Lipidhydroperoxidgehalts dem feroptotischen Zelltod voraus. Da es sich bei der Ferroptose nicht um einen programmierten Zelltod handelt, gibt es keine molekulare Signalkaskade, die zu ihrer Ausführung führt. Daher besteht die einzige Möglichkeit, dies zu bestätigen, darin, den Gehalt an Lipidhydroperoxid zu überwachen und spezifische Inhibitoren für diese Art des Zelltods zu verwenden, wie z. B. Ferrostatin 1²³. Ferrostatin 1 ist ein lipophiles Antioxidans, das in das Lipidkompartiment der Zelle eindringen und Lipidhydroperoxide entgiften kann, wodurch ferroptotische Ereignisse verhindert werden.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde mit DAOY-Wildtyp-Medulloblastom-Zelllinien (WT) durchgeführt, die bei 37 °C mit 5 % CO₂ in DMEM-Medium und 8 % FBS supplementiert wurden. Die xCT-deletierte Zelllinie wurde unter den gleichen Bedingungen aufrechterhalten, wobei die Experimente in Medien durchgeführt wurden, die mit 1 mM N-Acetylcystein (NAC) ergänzt wurden. Die Zellen wurden regelmäßig mit einem kommerziell erhältlichen Mykoplasmen-Detektionskit auf Mykoplasmen untersucht und bis zur 10^. Passage kultiviert.

1. Ernte und Aussaat der Zellen

HINWEIS: Alle Schritte werden mit sterilen aseptischen Techniken in einer Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube durchgeführt. DAOY-Medulloblastomzellen sind adhärent, was bedeutet, dass alle nicht gebundenen Zellen durch Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ verworfen werden können.

1. Nehmen Sie die Brühschale (Petrischale, 100 mm Durchmesser) mit den Zellen und entfernen Sie die schwimmenden Zellen und das Medium mit einem Aspirator von der Platte.
2. Geben Sie 5-10 ml PBS in die Schüssel, waschen Sie den Boden mit kreisenden Bewegungen der Schale und entfernen Sie dann das PBS mit einem Aspirator von der Platte.
3. Geben Sie 1 ml Trypsin (10-fache Verdünnung) in die Schale. Inkubieren Sie die Platte, bis sich die Zellen durch leichtes Klopfen der Platte lösen. Nehmen Sie 10 ml DMEM-Kulturmedium, das mit 8 % FBS ergänzt ist, und ernten Sie die Zellen mechanisch aus der Schale.
4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen.
5. Nehmen Sie 500 μl der Zellsuspension und geben Sie sie zur Zählung in eine Küvette. Zählen Sie die Anzahl der Zellen pro ml Zellsuspension. Für diese Studie wurde ein automatisierter Zellzähler verwendet (siehe Materialtabelle).
6. Berechnen Sie das Volumen, das erforderlich ist, um 1.00.000 Zellen aus der Zellsuspension zu entnehmen.
7. Nehmen Sie eine 6-Well-Platte und geben Sie das berechnete Volumen der Zellsuspension in jede Vertiefung, dann fügen Sie DMEM-Kulturmedien hinzu, die mit 8 % FBS auf 2 ml in jeder Vertiefung ergänzt sind.

2. Behandlung der Zellen

HINWEIS: Die Kontrolle und die Behandlungen werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Gruppen sind wie folgt: Kontrolle (DMSO), 1 μM Erastin, 0,3 μM RSL3, 250 μM FAC, 2 μM Ferrostatin 1, 1 μM Erastin + 2 μM Ferrostatin 1, 0,3 μM RSL3 + 2 μM Ferrostatin 1, 250 μM FAC + 2 μM Ferrostatin 1. Für das Experiment werden vier 6-Well-Platten benötigt, wie in Tabelle 1 angegeben). Die kaufmännischen Details aller notwendigen Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. 24 h nach der Aussaat die entsprechende Behandlung mit den Zellen in die Vertiefung geben.
2. Lassen Sie die Gerichte bei 37 °C und 5 % CO₂ im Inkubator.

3. Lipidhydroperoxid-Färbung der behandelten Zellen mit der Sonde BODIPY 581/591 C11

HINWEIS: Die Stammlösung der Lipidhydroperoxid-spezifischen Sonde wird in DMSO in einer Konzentration von 1 mM hergestellt. Aliquote der Stammlösung werden bei -20 °C in undurchsichtigen Röhrchen gelagert. Bereiten Sie zum Färben eine 2 μM Arbeitslösung der Sonde in DMEM-Medien vor, die mit 8 % FBS ergänzt ist.

1. 6 h nach der Behandlung die Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachten (Zellrundungen sollten sichtbar sein).
2. Nehmen Sie die Schalen aus dem Inkubator und legen Sie sie in eine Laminar-Flow-Haube der Gewebekultur.
   Entfernen Sie mit einem Aspirator das Medium und die schwimmenden (toten) Zellen.
3. Geben Sie vorsichtig 2 ml PBS in jede Vertiefung, waschen Sie den Boden mit kreisenden Bewegungen der 6-Well-Platten und entfernen Sie dann das PBS mit einem Aspirator aus den Vertiefungen.
4. Fügen Sie 2 mL der Arbeitslösung der Sonde hinzu (2 μM Endkonzentration in DMEM, ergänzt mit FBS).
5. Lassen Sie das Gericht bei 37 °C und 5 % CO₂ 30 min im Dunkeln im Inkubator stehen (die Platten können in Alufolie eingewickelt werden).

4. Durchflusszytometrische Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts in den behandelten Zellen

HINWEIS: Alle folgenden Schritte werden im Dunkeln durchgeführt (keine Lichter in der Laminar-Flow-Haube).

1. Nehmen Sie die Schalen aus dem Inkubator und legen Sie sie in eine Laminar-Flow-Haube der Gewebekultur.
   Entfernen Sie mit einem Aspirator die Fleckenlösung.
2. Geben Sie vorsichtig 2 ml PBS in jede Vertiefung, waschen Sie den Boden mit kreisenden Bewegungen der 6-Well-Platten und entfernen Sie dann das PBS mit einem Aspirator aus den Vertiefungen.
3. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal und saugen Sie das restliche PBS mit einem Aspirator aus der Vertiefung ab.
4. Geben Sie 150 μl eines handelsüblichen Zelldissoziationsreagenzes (siehe Materialtabelle) auf den Boden jeder Vertiefung und inkubieren Sie die Platte, bis sich die Zellen durch leichtes Klopfen auf die Platte lösen. Nehmen Sie 250 μl FACS-Puffer (PBS, 2 mM EDTA, 0,5 % BSA) und ernten Sie die Zellen mechanisch aus den Wells.
5. Übertragen Sie die Zellen in das entsprechende (zuvor gekennzeichnete) FACS-Röhrchen mit der Filterkappe. Legen Sie das Röhrchen mit den Zellen im Dunkeln auf Eis, bis die Analyse durchgeführt wird (die Analyse sollte innerhalb einer Stunde nach der Färbung durchgeführt werden).
   HINWEIS: Die Einrichtung und Kalibrierung der FACS-Maschine hängt von der verwendeten Maschine ab (siehe Materialtabelle).
6. Erstellen Sie ein neues Experiment und geben Sie ihm einen Namen (Ferroptose in DAOY - Lipidhydroperoxide).
7. Wählen Sie im Versuchsdesign den Laser (488 nm) und den Filter (FITC).
8. Wählen Sie in den Ansichtsdaten die richtige Zellgröße (>12 μm) aus, stellen Sie die PMT-Spannungen ein (die Zellpopulation sollte im ersten Quadranten des SSC-H/FSC-H-Punktdiagramms angezeigt werden) und schalten Sie das Punktdiagramm ein.
9. Fügen Sie ein neues Diagramm - Histogramm mit FITC-A auf der y-Achse und logarithmischer Skala hinzu.
10. Wirbeln Sie die Proben in das FACS-Röhrchen, legen Sie sie in die FACS-Maschine und laden Sie die Probe. Zeichnen Sie 10.000 FSC-Singulett-Ereignisse auf und benennen Sie die Datei (z. B. DAOY WT CTL 6h). Exportieren Sie die Datei als .fcs.

5. Propidiumiodid (PI)-Färbung der abgestorbenen Zellen nach der Behandlung

HINWEIS: Das Versuchsdesign ist genau das gleiche wie bei der Messung von Lipidhydroperoxid (siehe Schritt 1 und Schritt 2).

1. 24 h nach der Aussaat nehmen Sie die Schalen aus dem Inkubator und stellen Sie sie in die Laminar-Flow-Haube.
2. Sammeln Sie das Medium (mit abgestorbenen Zellen) in einem 15-ml-Röhrchen.
3. Geben Sie 1 mL PBS in jede Vertiefung, waschen Sie den Boden mit kreisenden Bewegungen der 6-Well-Platten und sammeln Sie dann das PBS in das Röhrchen mit dem entsprechenden Medium.
4. Geben Sie 200 μl Trypsin (10-fache Verdünnung) auf den Boden jeder Vertiefung und inkubieren Sie die Platte, bis sich die Zellen durch leichtes Klopfen auf die Platte lösen. Verwenden Sie das jeweilige Medium + PBS, um die Zellen aus den Wells zu ernten.
5. Die Zellsuspension bei 180 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit einem Aspirator.
6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μl FACS-Puffer und legen Sie es bis zur Analyse auf Eis.
7. Geben Sie kurz vor der Analyse PI-Lösung (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 2 μg/ml.

6. Durchflusszytometrische Analyse toter Zellen 24 Stunden nach der Behandlung

HINWEIS: Die FACS-Geräteeinstellungen und die Kalibrierung erfolgen wie zuvor angegeben (siehe Schritt 4).

1. Erstellen Sie ein neues Experiment und geben Sie ihm einen Namen (Ferroptose in DAOY - Zelltod).
2. Wählen Sie im Versuchsdesign den Laser (488 nm) und den Filter (PE).
3. Wählen Sie in den Ansichtsdaten die richtige Zellgröße (>12 μm) aus, stellen Sie die PMT-Spannungen ein (die Zellpopulation sollte im ersten Quadranten des SSC-H/FSC-H-Dotplots erscheinen) und gaten Sie das Dotplot.
4. Fügen Sie ein neues Diagramm - Histogramm mit PE-A auf der y-Achse und logarithmischer Skala hinzu.
5. Wirbeln Sie die Proben in das FACS-Röhrchen, legen Sie sie in die FACS-Maschine und laden Sie die Probe.
6. Zeichnen Sie 10.000 FSC-Singulett-Ereignisse auf und benennen Sie die Datei (z. B. DAOY WT CTL 6h). Exportieren Sie die Datei als .fcs.

7. Durchflusszytometrische Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts in den DAOY xCT-/- Zellen

HINWEIS: xCT^-/- Zellen wurden wie zuvor beschrieben^{erzeugt 24}.

1. Für dieses Experiment säen Sie die Zellen wie in Schritt 2 angegeben, aber ergänzen Sie das Medium anstelle der Behandlung über Nacht mit 1 mM NAC.
2. Behalten Sie am nächsten Tag die NAC in einer Gruppe bei und entfernen Sie sie aus der anderen.
3. Führen Sie die durchflusszytometrische Analyse des Lipidhydroperoxidgehalts auf genau die gleiche Weise durch, wie in Schritt 6 beschrieben.

8. Analyse der Ergebnisse des Durchflusszytometers

1. Öffnen Sie das .fcs-Dokument in der FlowJo-Software (siehe Materialtabelle).
2. Mit einem Doppelklick auf die einzelne Datei öffnen Sie alle Events (nicht nur FCS-Singuletts), die in der einzelnen Probe aufgezeichnet wurden (SSC-A/FSC-A Dot Plot). Da die Einstellungen so sind, dass das an der Maschine vorgenommene Gating nicht beibehalten wird, ist es notwendig, das Tor erneut zu erstellen und die Population zu benennen (z. B. DAOY WT).
3. Doppelklicken Sie auf die Gated Population , um ein weiteres Fenster mit dem Histogramm zu öffnen.
4. Ändern Sie die Y-Achse auf den verwendeten Leuchtstofffilter (Comp-FITC/PE-A).
5. Ändern Sie die X-Achse in modal (normalisieren Sie jeden Peak auf seinen Modus, d. h. auf % der maximalen Anzahl von Zellen in einem bestimmten Bin).
6. Kopieren Sie das Histogramm in den Layout-Editor. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Beispiele, und ziehen Sie jedes Mal, wenn ein neues Histogramm in den Layout-Editor eingefügt wird, es über das vorherige, sodass die Histogramme überlagert werden (halber Versatz).

Ergebnisse

Die Medulloblastom-Zelllinie DAOY wurde in einem Standard-DMEM-Medium kultiviert, das mit 8 % FBS ergänzt wurde, bis sie eine Konfluenz von etwa 60 % erreichte. Am Tag des Experiments wurden die Zellen geerntet und 1.00.000 Zellen pro Well in 6-Well-Platten plattiert, wie aus Tabelle 1 hervorgeht. Am folgenden Tag wurden die Zellen (in dreifacher Ausfertigung) entweder mit 1 μM Erastin, 0,3 μM RSL3 oder 250 μM FAC behandelt. Die Platten wurden dann bei 37 °C und 5 % CO₂ in den Inkubator g...

Diskussion

Das primäre Kennzeichen des ferroptotischen Zelltods ist die unkontrollierte Akkumulation von Lipidhydroperoxiden in der Plasmamembran. Diese oxidative Schädigung kann auf enzymatische oder nicht-enzymatische Weise auftreten, aber in beiden Fällen ist die Reaktion eisenabhängig/katalysiert, was den Namen dieser Art des Zelltods erklärt. Die Lipidhydroperoxidation wird oft indirekt durch Messung der Abbauprodukte der Lipidhydroperoxidation geschätzt, wie z. B. 4-Hydroxy-2,3-trans-nonenal (4-HNE) oder Malonaldehyd (M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100