Medulloblastomun Ferroptotik Fenotipinin Ortaya Çıkarılması

Özet

Lipid hidroperoksit içeriği, ferroptotik hücre ölümünün en yaygın kullanılan göstergesini temsil eder. Bu makale, ferroptoz indüksiyonu üzerine hücrelerdeki lipid hidroperoksit içeriğinin adım adım akış sitometrisi analizini göstermektedir.

Özet

Demir ve oksijenin etkileşimi, Dünya'daki yaşamın gelişiminin ayrılmaz bir parçasıdır. Bununla birlikte, bu eşsiz kimya büyülemeye ve şaşırtmaya devam ederek yeni biyolojik girişimlere yol açıyor. 2012 yılında, bir Columbia Üniversitesi grubu, bu etkileşimi "ferroptoz" adı verilen yeni bir tür düzenlenmiş hücre ölümüne yol açan merkezi bir olay olarak kabul etti. Ferroptozun en önemli özelliği, (1) işlevsiz antioksidan savunma ve/veya (2) hücrede serbest kararsız demir içeriğinin artmasıyla çakışan ezici oksidatif strese bağlı lipid hidroperoksitlerin birikmesidir. Bu normalde sistin taşıyıcı xCT, glutatyon (GSH) ve GSH peroksidaz 4'ü (GPx4) içeren kanonik anti-ferroptotik eksen tarafından önlenir. Ferroptoz, programlanmış bir hücre ölümü türü olmadığından, apoptozun karakteristik sinyal yollarını içermez. Bu tip hücre ölümünü kanıtlamanın en yaygın yolu, bunu önlemek için lipofilik antioksidanlar (E vitamini, ferrostatin-1 vb.) kullanmaktır. Bu moleküller plazma zarındaki oksidatif hasara yaklaşabilir ve detoksifiye edebilir. Ferroptotik fenotipin ortaya çıkarılmasında bir diğer önemli husus, spesifik BODIPY C11 boyasının kullanıldığı önceki lipid hidroperoksit birikimini tespit etmektir. Bu el yazması, vahşi tip medulloblastom hücrelerinde farklı indükleyiciler kullanılarak ferroptozun nasıl indüklenebileceğini gösterecektir: erastin, RSL3 ve demir verici. Benzer şekilde, NAC varlığında büyüyen ve NAC çıkarıldıktan sonra ferroptoza uğrayan xCT-KO hücreleri kullanılacaktır. Karakteristik "köpüren" fenotip, ferroptozun tetiklendiği andan itibaren 12-16 saat içinde ışık mikroskobu altında görülebilir. Ayrıca, BODIPY C11 boyaması ve ardından PI boyama yöntemi kullanılarak lipid hidroperoksit birikimini ve bunun sonucunda hücre ölümünü göstermek için FACS analizi kullanılacaktır. Hücre ölümünün ferroptotik doğasını kanıtlamak için, ferrostatin-1 spesifik bir ferroptoz önleyici ajan olarak kullanılacaktır.

Giriş

Ferroptoz, yeni bağlamsallaştırılmış, reaktif oksijen türüne (ROS) bağımlı bir hücre ölümü türüdür¹. ROS'un yanı sıra, demir bu tip hücre ölümünde çok önemli bir rol oynar, bu nedenle² adı verilir. Ferroptozun son ve yürütücü adımı, plazma zarındaki lipitlerin oksidatif hasarının demir katalizli birikimidir ve bu da sonunda zar bütünlüğünün ve seçici geçirgenliğin bozulmasına ve son olarak köpürme yoluyla hücre ölümüne yol açar. Lipid hidroperoksidasyon olayı doğal olarak meydana gelen bir olgudur; Bununla birlikte, hücre zarı boyunca yayılması, hücrenin antioksidan savunması tarafından engellenir. Bu bağlamdaki ana oyuncu, zara yaklaşabilen ve lipid hidroperoksitleri daha az toksik alkol türevlerine^{dönüştürebilen Se-protein} glutatyon peroksidaz 4'tür (GPx4). GPx4 için indirgeme gücü, esas olarak, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, esansiyel olmayan amino asitlerden oluşan bir tripeptit olan glutatyon (GSH) tarafından sağlanır: glisin, glutamat ve sistein. GSH'nin biyosentezi için hız sınırlayıcı amino asit sistein^4'tür. Sistein, esansiyel olmayan bir amino asit olarak sınıflandırılmasına rağmen, gereksinimleri, yüksek oranda proliferatif hücrelerde (kanser hücreleri gibi) iç üretimini kolayca aşabilir. Bu nedenle yarı esansiyel amino asitler grubunda yeniden sınıflandırılmıştır. Gerekli sistein ithalatı, esas olarak, glutamat ihracatı pahasına oksitlenmiş (baskın) sistein (diğer adıyla sistin) formunun ithalatına izin veren Xc- sistemi yoluyla gerçekleşir⁵. Xc- sistemi, xCT olarak bilinen Na+'dan bağımsız, Cl'ye bağımlı bir taşıma alt biriminden ve CD98 olarak bilinen bir şaperon alt biriminden oluşur. Yakın zamana kadar, xCT-GSH-GPx4 ekseninin anti-ferroptotik özellikleri benzersiz ve kopyalanamaz olarak görülüyordu⁶. Bununla birlikte, 2019 yılında, ubikinol (Koenzim Q10) ve rejeneratif enzimi - ferroptoz baskılayıcı protein 1'den (FSP1) oluşan alternatif bir anti-ferroptotik yol tanımlanmıştır ^7,8. Kısa bir süre sonra, GTP siklohidrolaz-1 / tetrahidrobiopterin (GCH1 / BH4) içeren başka bir lipid hidroperoksit detoksifiye edici sistem bildirilmiştir⁹. Bununla birlikte, xCT-GSH-GPx4 ekseninin ferroptozun önlenmesindeki merkezi rolü sorgulanmamış gibi görünmektedir.

Son on yılda, ferroptoz, çeşitli tümör tiplerinde kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve bir anti-kanser stratejisi olarak büyük potansiyel göstermiştir (Lei ve ^ark.10 tarafından gözden geçirilmiştir). Ayrıca, konvansiyonel kemoterapötiklere karşı yüksek direnç sergileyen ve/veya metastaz yapma eğilimi gösteren kanser hücrelerinin, GPx4 ^11,12,13 inhibitörleri gibi ferroptoz indükleyicilerine şaşırtıcı derecede duyarlı olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, beyin tümörleri bağlamında, ferroptotik indükleyicilerin potansiyeli büyük ölçüde yeterince çalışılmamıştır. Bu tip hücre ölümü serebral iskemi-reperfüzyon hasarı¹⁴ve nörodejeneratif hastalıklar¹⁵ ile yakından ilişkili olsa da, beyin tümörleri bağlamındaki potansiyeli esas olarak en sık görülen malign kraniyoserebral tümör olan glioblastoma ile sınırlıdır (Zhuo ve ^ark.16 tarafından gözden geçirilmiştir). Öte yandan, en sık görülen malign pediatrik beyin tümörü ve çocukluk çağı mortalitesinin önde gelen nedenlerinden biri olan medulloblastomun ferroptoz indükleyicilerine duyarlılığı büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Bildiğimiz kadarıyla, ferroptoz ve medulloblastomu birbirine bağlayan hakemli literatür azdır. Bununla birlikte, bazı çalışmalar, demirin hem medulloblastoma hem de glioblastoma kanseri kök hücrelerinin (CSC'ler) hayatta kalmasında, çoğalmasında ve tümörjenik potansiyelinde çok önemli bir rol oynadığını ortaya ^{koymuştur17,18} ve potansiyel olarak onları ferroptoz indüksiyonuna karşı daha savunmasız hale getirir. Bu özellikle önemlidir, çünkü medulloblastom, tümör kemorezistansı, yayılması ve nüksünden büyük ölçüde sorumlu gibi görünen CSC'lerin alt popülasyonu veya tümör başlatan/yayılan hücreler ile ünlüdür¹⁹.

Ferroptoz indüksiyonuna duyarlılık tipik olarak hücre ölümüne yol açabilecek veya yol açmayacak lipid hidroperoksit içeriği/birikimi ölçülerek araştırılır. En yaygın olarak kullanılan ferroptoz indükleyicileri (1) xCT taşıyıcı^20'nin bir inhibitörü olan erastin, (2) GPx4 enzimi^2'nin bir inhibitörü olan RSL3 ve/veya (3) ferro-amonyum sitrat (FAC) gibi demir donörleridir.21. Lipid hidroperoksit içeriği, indirgenmiş durumda 581/591 nm'de uyarma ve emisyon maksimumlarına sahip seçici prob BODIPY 581/591 C11²² kullanılarak değerlendirilir. Lipid hidroperoksitlerle etkileşim ve oksidasyon üzerine, prob uyarma ve emisyon maksimumlarını 488/510 nm'ye kaydırır. Tipik olarak, lipid hidroperoksit içeriğinde önemli bir artış ferroptotik hücre ölümünden önce gelir. Ferroptoz programlanmış bir hücre ölümü olmadığından, yürütülmesine yol açan moleküler bir sinyal kaskadı yoktur. Bu nedenle, bunu doğrulamanın tek yolu, lipid hidroperoksit içeriğini izlemek ve bu tip hücre ölümü için ferrostatin 1²³ gibi spesifik inhibitörler kullanmaktır. Ferrostatin 1, hücrenin lipit bölmesine nüfuz edebilen ve lipit hidroperoksitleri detoksifiye edebilen ve böylece ferroptotik olayları önleyen lipofilik bir antioksidandır.

Protokol

Bu çalışma, %8 FBS ile desteklenmiş DMEM ortamında %5 CO₂ ile 37 °C'de kültürlenen DAOY vahşi tip (WT) medulloblastom hücre hatları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. xCT ile silinen hücre hattı, 1 mM N-asetilsistein (NAC) ile desteklenmiş ortamda gerçekleştirilen deneylerle aynı koşullar altında tutuldu. Hücreler, ticari olarak temin edilebilen bir Mikoplazma Tespit Kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak mikoplazma için düzenli olarak tarandı ve 10.^pasaja kadar kültürlendi.

1. Hücrelerin hasat edilmesi ve tohumlanması

NOT: Tüm adımlar, bir doku kültürü laminer akış başlığında steril aseptik teknikler kullanılarak gerçekleştirilir. DAOY medulloblastoma hücreleri yapışıktır, yani tüm bağlanmamış hücreler, Ca^{2 +} ve Mg^{2 +} olmadan fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanarak atılabilir.

1. Hücrelerle birlikte stok kabını (Petri kabı, 100 mm çapında) alın ve yüzen hücreleri ve ortamı bir aspiratör kullanarak plakadan çıkarın.
2. Tabağa 5-10 mL PBS ekleyin, tabağın dairesel hareketleriyle altını yıkayın ve ardından bir aspiratör kullanarak PBS'yi plakadan çıkarın.
3. Yemeğe 1 mL tripsin (10x seyreltme) ekleyin. Plakaya hafifçe vurulduğunda hücreler yerinden çıkana kadar plakayı inkübe edin. % 8 FBS ile takviye edilmiş 10 mL DMEM kültür ortamı alın ve hücreleri tabaktan mekanik olarak hasat edin.
4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
5. Hücre süspansiyonunun 500 μL'sini alın ve saymak için bir küvete koyun. Hücre süspansiyonunun mL başına hücre sayısını sayın. Bu çalışma için otomatik bir hücre sayacı kullanılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu).
6. 1,00,000 hücreye sahip olmak için hücre süspansiyonundan alınması gereken hacmi hesaplayın.
7. 6 oyuklu bir plaka alın ve hücre süspansiyonunun hesaplanan hacmini her bir oyuğa ekleyin, ardından her oyukta 2 mL'ye %8 FBS ile takviye edilmiş DMEM kültür ortamını ekleyin.

2. Hücrelerin tedavisi

NOT: Kontrol ve tedaviler üç nüsha halinde yapılmaktadır. Gruplar şu şekildedir: Kontrol (DMSO), 1 μM erastin, 0.3 μM RSL3, 250 μM FAC, 2 μM Ferrostatin 1, 1 μM erastin + 2 μM Ferrostatin 1, 0.3 μM RSL3 + 2 μM Ferrostatin 1, 250 μM FAC + 2 μM Ferrostatin 1. Deney için Tablo 1'de belirtildiği gibi dört adet 6 oyuklu plakaya ihtiyaç vardır). Gerekli tüm reaktiflerin ticari detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Tohumlamadan 24 saat sonra, ilgili tedaviyi hücrelerle birlikte kuyuya ekleyin.
2. Bulaşıkları 37 °C ve %5_CO2'de inkübatörde bırakın.

3. BODIPY 581/591 C11 probu ile muamele edilen hücrelerin lipid hidroperoksitlerin boyanması

NOT: Lipid hidroperoksit spesifik probun stok çözeltisi, DMSO'da 1 mM'lik bir konsantrasyonda hazırlanır. Stok çözeltisinin alikotları -20 °C'de şeffaf olmayan tüplerde saklanır. Boyama için,% 8 FBS ile desteklenmiş DMEM ortamında probun 2 μM'lik bir çalışma solüsyonunu hazırlayın.

1. Tedaviden 6 saat sonra, hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin (hücre yuvarlaklaşması görünür olmalıdır).
2. Bulaşıkları inkübatörden çıkarın ve bir doku kültürü laminer akış başlığına yerleştirin.
   Bir aspiratör kullanarak, ortamı ve yüzen (ölü) hücreleri çıkarın.
3. Her bir oyuğa nazikçe 2 mL PBS ekleyin, tabanı 6 oyuklu plakaların dairesel hareketleriyle yıkayın ve ardından bir aspiratör kullanarak PBS'yi kuyulardan çıkarın.
4. Probun çalışma çözeltisinden 2 mL ekleyin (FBS ile desteklenmiş DMEM'de 2 μM nihai konsantrasyon).
5. Çanağı inkübatörde 37 °C ve %5 CO_2'de karanlıkta 30 dakika bekletin (plakalar alüminyum folyoya sarılabilir).

4. Tedavi edilen hücrelerdeki lipid hidroperoksit içeriğinin akış sitometrisi analizi

NOT: Aşağıdaki adımların tümü karanlıkta gerçekleştirilir (laminer akış başlığında ışık yok).

1. Bulaşıkları inkübatörden çıkarın ve bir doku kültürü laminer akış başlığına yerleştirin.
   Bir aspiratör kullanarak lekelenme solüsyonunu çıkarın.
2. Her bir oyuğa nazikçe 2 mL PBS ekleyin, tabanı 6 oyuklu plakaların dairesel hareketleriyle yıkayın ve ardından bir aspiratör kullanarak PBS'yi kuyulardan çıkarın.
3. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın ve bir aspiratör kullanarak kuyudan kalan PBS'yi aspire edin.
4. Her bir oyuğun dibine 150 μL ticari olarak temin edilebilen bir hücre ayrışma reaktifi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve plakaya hafifçe vurulduğunda hücreleri yerinden çıkarana kadar plakayı inkübe edin. 250 μL FACS tamponu (PBS, 2 mM EDTA,% 0.5 BSA) alın ve hücreleri kuyulardan mekanik olarak hasat edin.
5. Hücreleri, filtre kapağı ile ilgili (önceden işaretlenmiş) FACS tüpüne aktarın. Analiz yapılana kadar hücrelerin bulunduğu tüpü karanlıkta buzun üzerine yerleştirin (analiz, boyamadan sonraki bir saat içinde yapılmalıdır).
   NOT: FACS makine kurulumu ve kalibrasyonu kullanılan makineye bağlıdır (bkz. Malzeme Tablosu).
6. Yeni bir deney oluşturun ve ona bir isim verin (DAOY'da Ferroptoz - lipid hidroperoksitler).
7. Deney tasarımında lazeri (488 nm) ve filtreyi (FITC) seçin.
8. Verileri görüntüle'de, uygun hücre boyutunu (>12 μm) seçin, PMT voltajlarını ayarlayın (hücre popülasyonu SSC-H/FSC-H nokta grafiğinin ilk çeyreğinde görünmelidir) ve nokta grafiğini geçitleyin.
9. Yeni bir çizim ekleyin - y ekseninde ve logaritmik ölçekte FITC-A ile histogram.
10. Numuneleri FACS tüpüne vorteksleyin, FACS makinesine yerleştirin ve numuneyi yükleyin. 10.000 FSC singlet olayını kaydedin ve dosyayı adlandırın (örneğin, DAOY WT CTL 6h). Dosyayı .fcs olarak dışa aktarın.

5. Tedavi sırasında ölü hücrelerin propidyum iyodür (PI) boyaması

NOT: Deney tasarımı, lipid hidroperoksit ölçümü ile tamamen aynıdır (bkz. adım 1 ve adım 2).

1. Tohumlamadan 24 saat sonra, bulaşıkları inkübatörden çıkarın ve laminer akış başlığına yerleştirin.
2. Ortamı (ölü hücrelerle birlikte) 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
3. Her bir oyuklu alana 1 mL PBS ekleyin, tabanı 6 oyuklu plakaların dairesel hareketleriyle yıkayın ve ardından PBS'yi ilgili ortamla birlikte tüpe toplayın.
4. Her oyuğun dibine 200 μL tripsin (10x seyreltme) ekleyin ve plakaya hafifçe vurulduğunda hücreler yerinden çıkana kadar plakayı inkübe edin. Hücreleri kuyulardan hasat etmek için ilgili ortamı + PBS'yi kullanın.
5. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 180 x g'da santrifüjleyin. Bir aspiratör kullanarak süpernatanı çıkarın.
6. Hücre peletini 300 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve analize kadar buzun üzerine yerleştirin.
7. Analizden hemen önce, 2 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona PI çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.

6. Tedaviden 24 saat sonra ölü hücrelerin akış sitometrisi analizi

NOT: FACS makine ayarları ve kalibrasyonu daha önce belirtildiği gibi yapılır (bkz. adım 4).

1. Yeni bir deney oluşturun ve ona bir isim verin (DAOY'da Ferroptoz - hücre ölümü).
2. Deney tasarımında lazeri (488 nm) ve filtreyi (PE) seçin.
3. Verileri görüntüle'de, uygun hücre boyutunu (>12 μm) seçin, PMT voltajlarını ayarlayın (hücre popülasyonu SSC-H/FSC-H nokta grafiğinin ilk çeyreğinde görünmelidir) ve nokta grafiğini geçitleyin.
4. Yeni bir çizim ekleyin - y ekseninde ve logaritmik ölçekte PE-A ile histogram.
5. Numuneleri FACS tüpüne vorteksleyin, FACS makinesine yerleştirin ve numuneyi yükleyin.
6. 10.000 FSC singlet olayını kaydedin ve dosyayı adlandırın (örneğin, DAOY WT CTL 6h). Dosyayı .fcs olarak dışa aktarın.

7. DAOY xCT-/- hücrelerindeki lipid hidroperoksit içeriğinin akış sitometrisi analizi

NOT: xCT^-/- hücreleri daha önce açıklandığı gibi oluşturulmuştur²⁴.

1. Bu deney için, hücreleri 2. adımda belirtildiği gibi tohumlayın, ancak tedavi yerine, ortamı gece boyunca 1 mM NAC ile takviye edin.
2. Ertesi gün, NAC'ı bir grupta tutun ve diğerinden çıkarın.
3. Lipid hidroperoksit içeriğinin akış sitometrisi analizini, 6. adımda anlatıldığı gibi tam olarak gerçekleştirin.

8. Akış sitometresi sonuçlarının analizi

1. FlowJo yazılımında .fcs belgesini açın (Malzeme Tablosuna bakın).
2. Bireysel örnekte (SSC-A/FSC-A nokta grafiği) kaydedilen tüm olayları (yalnızca FCS singlet'leri değil) açmak için tek tek dosyaya çift tıklayın. Ayarlar, makinede yapılan kapılamanın korunmayacağı şekilde olduğundan, kapıyı bir kez daha yapmak ve popülasyonu adlandırmak gerekir (örneğin, DAOY WT).
3. Histogramlı başka bir pencere açmak için geçitli popülasyona çift tıklayın.
4. Y eksenini kullanılan floresan filtreye (Comp-FITC/PE-A) değiştirin.
5. X eksenini kalıcı olarak değiştirin (her bir tepe noktasını kendi moduna, yani belirli bir bölmede bulunan maksimum hücre sayısının% 'sine normalleştirin).
6. Histogramı mizanpaj düzenleyicisine kopyalayın. Bunu tüm örnekler için tekrarlayın ve mizanpaj düzenleyicisine her yeni histogram yapıştırıldığında, histogramların üst üste bindirilmesi (yarım uzaklık) için bir öncekinin üzerine sürükleyin.

Sonuçlar

Medulloblastoma hücre hattı DAOY, yaklaşık% 60 birleşmeye ulaşana kadar% 8 FBS ile desteklenmiş standart bir DMEM ortamında kültürlendi. Deney günü, hücreler hasat edildi ve Tablo 1'e göre oyuk başına 1.00.000 hücre 6 oyuklu plakalara kaplandı. Ertesi gün, hücreler (üç katlı) 1 μM erastin, 0.3 μM RSL3 veya 250 μM FAC ile muamele edildi. Plakalar daha sonra 37 °C ve% 5 CO_2'de inkübatöre yerleştirildi. 6 saat sonra, Şekil 1'deki oklarl...

Tartışmalar

Ferroptotik hücre ölümünün birincil ayırt edici özelliği, plazma zarında kontrolsüz lipid hidroperoksit birikimidir. Bu oksidatif hasar, enzimatik veya enzimatik olmayan bir şekilde ortaya çıkabilir, ancak her iki durumda da reaksiyon demire bağımlı / katalizlidir, bu da bu tip hücre ölümünün adını açıklar. Lipid hidroperoksidasyonu genellikle 4-hidroksi-2,3-trans-nonenal (4-HNE) veya malonaldehit (MDA) gibi lipid hidroperoksidasyonunun bozunma ürünlerinin ölçülmesiyle dolaylı olarak tahmin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100