نقوم بالإبلاغ عن مجموعة هجينة ومقايسة أحادية الجزيء لتصوير وقياس حركة اللولب Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) المسمى بالفلورسنت والمعاد تشكيله بالكامل على جزيئات الحمض النووي الخطية الموجودة في مكانها في فخ بصري.
تحتوي حقيقيات النوى على لولب واحد متماثل يعرف باسم CMG ، والذي ينظم مركزيا ويقود replisome ، ويقود الطريق في مقدمة شوكات النسخ المتماثل. يعد الحصول على فهم ميكانيكي عميق لديناميكيات CMG أمرا بالغ الأهمية لتوضيح كيفية تحقيق الخلايا للمهمة الهائلة المتمثلة في تكرار الجينوم بالكامل بكفاءة ودقة مرة واحدة في كل دورة خلية. تقنيات الجزيء الواحد مناسبة بشكل فريد لتحديد ديناميكيات CMG نظرا لدقتها الزمنية والمكانية التي لا مثيل لها. ومع ذلك ، فقد اعتمدت دراسات الجزيء الواحد لحركة CMG حتى الآن على CMG المشكل مسبقا المنقى من الخلايا كمركب ، مما يحول دون دراسة الخطوات التي تؤدي إلى تنشيطه. هنا ، نصف مجموعة هجينة ومقايسة أحادية الجزيء سمحت بالتصوير على مستوى الجزيء الواحد لحركة CMG المسمى بالفلورسنت بعد إعادة تكوين تجميعها وتنشيطها بالكامل من 36 عديد ببتيد S. cerevisiae منقى مختلف. يعتمد هذا الفحص على الوظيفة المزدوجة لنهايات ركيزة الحمض النووي الخطية مع شقوقين متعامدين من التعلق ، ويمكن تكييفه لدراسة آليات معالجة الحمض النووي المعقدة المماثلة على مستوى الجزيء الواحد.
يتم إجراء تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى بواسطة مركب بروتيني ديناميكي يعرف باسم replisome1. أحد المكونات الرئيسية لهذا المجمع هو اللولب المتماثل حقيقي النواة Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) ، الذي يقود وينظم الرد مركزيا ، مما يؤدي إلى الطريق في مقدمة شوكات النسخ المتماثل 1,2. لذلك فإن الحصول على فهم كمي عميق لديناميات CMG أمر بالغ الأهمية لفهم ديناميكيات الرد. يمكن الحصول على مثل هذا الفهم من خلال تقنيات الجزيء الواحد ، والتي تناسب بشكل فريد دراسة المحركات الجزيئية ، مثل CMG ، نظرا لدقتها المكانية والزمانية التي لا مثيل لها ، ويمكن أن توفر لنا فهما كميا لا مثيل له لوظيفتها ، وعشوائية ، وديناميكياتها2،3،4،5،6،7،8،9.
في الجسم الحي ، يتم تحميل CMG وتنشيطه بطريقة منفصلة مؤقتا لضمان حدوث النسخ المتماثل مرة واحدة فقط لكل دورة خلية1،10،11. أولا ، في المرحلة G1 من دورة الخلية ، تقوم مجموعة من البروتينات المعروفة باسم عوامل التحميل بتحميل المكون الأول من CMG ، المركب السداسي Mcm2-7 ، على dsDNA12،13،14،15،16 في شكل سداسيمرات مزدوجة مع تكوين وجها لوجه15،17،18. في حالة الخميرة المحددة ، تحدث هذه العملية الأولية في تسلسلات DNA محددة تعرف باسم أصول النسخالمتماثل 1. على الرغم من أن Mcm2-7 هو النواة الحركية لطائرة اللولب المتماثلة ، إلا أنه في حد ذاته غير قادر على فك الحمض النووي19 بدون عاملي تنشيط اللولب Cdc45 و GINS ، اللذين يجب تجنيدهما في Mcm2-7 المحمل ليؤدي إلى CMGنشط بالكامل 11،19،20،21. تتم عملية تنشيط اللولب في المرحلة S من دورة الخلية وتبدأ بالفسفرة الانتقائية للسداسيات المزدوجة Mcm2-7 بواسطة كيناز DDK22،23،24 المنظم لدورة الخلية. تسهل أحداث الفسفرة هذه تجنيد Cdc45 و GINS إلى السداسيمرات المزدوجة Mcm2-710،22،23،24،25،26 بواسطة مجموعة ثانية من البروتينات تعرف باسم عوامل إطلاق10،11،26. يؤدي ارتباط Cdc45 و GINS إلى ظهور طائرتين شقيقتين من طائرات الهليكوبتر CMG ، والتي تحيط في البداية بكلا خيطي الحمض النووي للوالدين ولا تزال موجودة في تكوين وجها لوجه11,27. في خطوة التنشيط النهائية ، يحفز عامل الإطلاق Mcm10 البثق المعتمد على التحلل المائي ATP لشريط DNA واحد من كل شقيق CMG11. بعد قذف الشريط ، تتجاوز طائرات الهليكوبتر CMG الشقيقة وتنفصل عن بعضها البعض عن طريق الانتقال على طول ssDNA بطريقة تعتمد على التحلل المائي ATP11،20،21،28 ، وفك الحمض النووي عن طريق استبعاد الشريط29 غير الإزفاء بشكل معقم. تمت إعادة تشكيل هذه العملية برمتها بالكامل في المختبر من مجموعة صغيرة من 36 عديد ببتيدات S. cerevisiae المنقاة10,11.
على الرغم من التنظيم الرائع في الجسم الحي لتجميع CMG وتنشيطه الموصوف أعلاه ، فقد اعتمدت دراسات الحركة أحادية الجزيء المعاد تشكيلها في المختبر ل CMG2،30،31،32،33،34 حتى الآن على CMG المنشط مسبقا المنقى كمركب من الخلايا20,21، في عداد المفقودين جميع الخطوات قبل تفعيلها والطبيعة ثنائية الاتجاه لحركتها. كان نهج CMG المنشط مسبقا هو المعيار الذهبي في مجال الجزيء الواحد جزئيا بسبب التعقيد الكيميائي الحيوي لتفاعل تجميع CMG المعاد تشكيله بالكامل10,11. كان هذا التفاعل الكيميائي الحيوي يمثل تحديا للترجمة من المستوى الكيميائي الحيوي السائب إلى مستوى الجزيء الواحد لعدة أسباب. أولا ، لزيادة كفاءة التفاعل إلى أقصى حد ، فإن عوامل التحميل والإطلاق اللازمة لتجميع وتنشيط CMG مطلوبة بتركيزات في حدود 10-200 نانومتر10،11،27. تتوافق نطاقات التركيز هذه مع النهاية العليا لما يمكن أن تتحمله معظم تقنيات الجزيء الواحد ، خاصة عند استخدام المكونات ذات العلامات الفلورية35. أخيرا ، تطورت CMG لتبحر عبر آلاف أزواج القواعد في خلية36،37،38،39. لذلك ، لدراسة حركته على نطاق مكاني ذي صلة بيولوجيا ، يحتاج المرء إلى ركائز الحمض النووي الطويلة (عادة بأطوال بترتيب عشرات الكيلوقواعد)30،31،34،40،41،42. يشكل استخدام ركائز الحمض النووي الطويلة هذه تحديا إضافيا يتمثل في أنه كلما طالت ركيزة الحمض النووي ، زادت مواقع الارتباط غير المحددة المحتملة للبروتينات ومجاميع البروتين. في حالة CMG ، فإن النقطة الأخيرة مهمة بشكل خاص ، حيث أن العديد من عوامل التحميل والإطلاق المشاركة في تجميع وتنشيط CMG تحتوي على مناطق مضطربة جوهريا43 وهي عرضة للتجميع.
هنا ، نبلغ عن مجموعة هجينة ومقايسة أحادية الجزيء سمحت بمراقبة وقياس حركة CMG بعد إعادة تشكيل تجميعها وتنشيطها بالكامل من 36 عديد الببتيد S. cerevisiae المنقى28. يعتمد هذا الفحص على الوظيفة المزدوجة لكلا طرفي ركيزة الحمض النووي مع شقوقين متعامدين للتعلق: ديسثيوبيوتين وديجوكسيجينين2 (الشكل 1 أ). يستخدم الجزء الأول ، desthiobiotin ، لربط ركيزة الحمض النووي بشكل عكسي بالخرز المغناطيسي المطلي بالستربتافيدين44 (الشكل 1 ب). بعد ذلك ، يتم تجميع CMG المسمى بالفلورسنت وتنشيطه على الحمض النووي المرتبط بالخرز ، ويتم استخدام رف مغناطيسي لتنقية وغسل مجمعات الحمض النووي المرتبطة بالخرز المغناطيسي: CMG (الشكل 1C). عند القيام بذلك ، تتم إزالة البروتين الزائد الذي من شأنه أن يتجمع على ركيزة الحمض النووي ؛ يوفر هذا مجمعات DNA: CMG خالية من التجميع تقريبا. ثم يتم استخلاص المجمعات السليمة من الخرز المغناطيسي عن طريق إضافة فائض مولي من البيوتين الحر ، والذي يمكن أن يتفوق على تفاعل ديسثيوبيوتين - ستربتافيدين (الشكل 1 د). الحمض النووي الفردي: ثم يتم ربط مجمعات CMG بين حبتين من البوليسترين محاصرتين بصريا مغلفتين بجسم مضاد للديجوكسيجينين (مضاد للحفر) ؛ في هذه الخطوة ، يتم استخدام الجزء الثاني على الحمض النووي ، digoxigenin ، لأنه يمكن أن يرتبط بمضاد الحفر حتى في محلول عازل يحتوي على فائض من البيوتين الحر (الشكل 1E). بمجرد تثبيت مركب DNA: CMG في مكانه في المصيدة الضوئية ، يتم تصوير حركة CMG المسمى بالفلورسنت باستخدام ليزر مسح متحد البؤر (الشكل 1F). نتوقع أن هذا الاختبار يمكن تكييفه بسهولة للدراسة على مستوى الجزيء الواحد لتفاعلات الحمض النووي المعقدة المماثلة: البروتين.
1. تخليق ركيزة الحمض النووي الخطية ذات الوظائف المزدوجة والارتباط بالخرز المغناطيسي
2. مجموعة هجينة ومقايسة أحادية الجزيء لتصوير وقياس حركة CMG المعاد تشكيلها بالكامل باستخدام ملاقط بصرية مزدوجة الحزمة مترابطة ومجهر متحد البؤر
عند تنفيذه بشكل صحيح ، يجب أن ينتج البروتوكول الموصوف هنا مجمعات DNA: CMG خالية من المجموع تقريبا. يجب ألا يؤدي التفاعل الخالي من التجميع إلى انسداد أي من القنوات في خلية تدفق الموائع الدقيقة ، ويجب أن يكون من الممكن تمديد جزيئات الحمض النووي المحاصرة إلى امتداد من طرف إلى طرف في حدود 10٪ من طول كفافها دون كسر الحمض النووي. على العكس من ذلك ، إذا كان هناك تجمع في التفاعل ، فقد تصبح جزيئات الحمض النووي مضغوطة في بعض الأحيان بواسطة الركام ، وغالبا ما تسبب تكسر الحمض النووي إذا تمددت. طريقة جيدة للتعرف على مجاميع البروتين هي من خلال النظر في مسح 2D للحمض النووي. في تفاعل خال من التجميع، يظهر CMG كبقع منفصلة ومتماثلة محدودة الحيود تزدحم قليلا بالحمض النووي، مثل تلك الموجودة في عمليات المسح الموضحة في الشكل 2 أ. على العكس من ذلك ، فإن المجاميع أقل تميزا ، وأحيانا تكون النقط غير المتماثلة تزدحم بطول أكبر من الحمض النووي ، مثل تلك الموجودة في عمليات المسح الموضحة في الشكل 2 ب. علاوة على ذلك ، إذا تم تنفيذ الفحص بنجاح ، وتم تحقيق نقاء عال للبروتينات المنقاة ، فستظهر حركة طويلة المدى ل CMG في وجود ATP ، كما لوحظ في الكيموغراف الموضح في الشكل 2C.
الشكل 1: وصف تصويري للمجموعة الهجينة ومقايسة الجزيء الواحد لتصوير وتحديد حركة CMG المعاد تكوينها بالكامل. (أ) الحمض النووي الخطي 23.6 kb الذي يحتوي على أصل ARS1 للتكرار يحدث بشكل طبيعي يعمل بشكل مضاعف في كلا الطرفين مع شقوق desthiobiotin و digoxigenin. (ب) يرتبط الحمض النووي (DNA) الذي يعمل بوظيفة مضاعفة بالحبيبات المغناطيسية المغلفة بالستربتافيدين من خلال شقوق ديسثيوبيوتين. (ج) يتم تجميع CMG وتنشيطه تدريجيا على الحمض النووي المرتبط بالخرز المغناطيسي مع تضمين خطوات غسيل مختلفة لإزالة البروتين الزائد غير المرتبط وركام البروتين. (د) الحمض النووي السليم: ثم يتم استخلاص معقدات CMG من الخرز المغناطيسي عن طريق إضافة فائض من البيوتين الحر ، والذي يتفوق على تفاعل ديسثيوبيوتين والستربتافيدين. (ه) الحمض النووي الفردي: ترتبط معقدات CMG بين حبتين من البوليسترين المغلفة بالديجوكسيجينين المحاصرة بصريا بمساعدة خلية تدفق الموائع الدقيقة. لاحظ أن تفاعل Dig-anti-Dig متعامد مع تفاعلات البيوتين وأفيدين ، لذلك لا يتأثر بوجود البيوتين الحر. (F) بمجرد تثبيتها في مكانها بواسطة الملقط البصري ، يتم نقل معقدات DNA: CMG إلى ظروف عازلة مختلفة ، حيث يتم بعد ذلك مسح مستوى الحمض النووي باستخدام ليزر مسح متحد البؤر لتصوير حركة CMG على طول الحمض النووي بمرور الوقت. (G) تظهر اللوحة العلوية رسما تخطيطيا لمركب DNA: CMG مثبت في مكانه بين حبتين من البوليسترين المحاصرتين بصريا مضادتين للحفر يتم مسحهما ضوئيا بواسطة ليزر مسح متحد البؤر. تظهر اللوحة السفلية مثالا على مسح 2D ل CMG مرتبطا بالحمض النووي الموجود في مكانه باستخدام مصيدة بصرية. الحمض النووي غير مسمى في هذه التجارب ، ولكن يمكن اعتباره خطا أفقيا يمر عبر منتصف الصورة. وقد عدل هذا الرقم من28. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أمثلة على بيانات من تجربة ناجحة وغير ناجحة. (أ) مثال المسح الضوئي 2D لحمض نووي يحتوي على CMG في عينة خالية من التجميع. في كلا المسحين ، يظهر CMG بقعا متناظرة ومنفصلة محدودة الحيود موزعة بشكل ضئيل على طول الحمض النووي. (ب) مثال المسح الضوئي 2D لحمض نووي يحتوي على CMG في عينة تحتوي على مجاميع. في كلا المسحين ، يشكل CMG نقاطا أقل تناسقا تزدحم بالحمض النووي. (ج) الكيموغراف يوضح موضع بقع حيود CMG المحدودة على الحمض النووي (DNA) بمرور الزمن في وجود الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP)، ويوضح الحركة بعيدة المدى لمعقدات CMG. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
خطوات حاسمة وفحوصات جودة الكاشف المهمة
يتم تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة وفحوصات جودة الكواشف البيولوجية في الفحص هنا. أولا ، نقاء البروتينات المستخدمة مهم لأن تدهور الحمض النووي الناجم حتى عن ملوثات النيوكلياز الصغيرة في عينات البروتين سيؤثر سلبا على البيانات. وذلك لأن جزيئات الحمض النووي السليمة (أو المشقوقة جزئيا) فقط هي التي يمكن أن تكون محاصرة في الملقط البصري ثنائي الحزمة. والأهم من ذلك ، أن الشقوق الموجودة على الحمض النووي ستؤدي إلى فصل CMGعن 41 ، مما يعقد مراقبة حركة CMG بعيدة المدى. نوصي بشدة باختبار كل بروتين منقى لنشاط النيوكلياز ، بالإضافة إلى المراقبة المستمرة لسلامة ركيزة البلازميد الأولية لضمان تقليل النك إلى الحد الأدنى. الخطوة الثانية المهمة هي الإزالة الدقيقة للخرز المغناطيسي بعد شطف مجمعات DNA: CMG. يجب إجراء إزالة الطافات في هذه الخطوة ببطء حتى لا تزعج الخرز الذي تم جمعه. إذا تركت حبات مغناطيسية في العينة المنقولة إلى الملقط البصري ، فغالبا ما تصطدم بخرز البوليسترين المحبوس بصريا ، مما يتسبب في هروبها من المصيدة الضوئية وتعقيد عملية الحصول على البيانات. أخيرا ، يجب التعامل مع مجمعات DNA: CMG بعناية في الملقط البصري. تحقيقا لهذه الغاية ، نوصي بعدم زيادة توتر الحمض النووي فوق 10 pN ، لأن تطبيق القوة قد يفصل CMG عن الحمض النووي. علاوة على ذلك ، يجب أن يتم التنقل بين القنوات في خلية تدفق الموائع الدقيقة ببطء قدر الإمكان (~ 0.2 مم / ثانية) لمنع قوى السحب الناتجة من فصل CMG عن الحمض النووي.
تعديلات على الطريقة
هناك عدة خطوات للفحص يمكن تعديلها. على سبيل المثال ، أظهرنا أنه يمكن تقليل وقت الشطف من 60 دقيقة إلى 30 دقيقة دون التأثير بشكل كبير على عائد الشطف. بالإضافة إلى ذلك ، نوصي باستكمال المخزن المؤقت للشطف بتركيز منخفض (أقل من 1 مللي مول) من ATP أو ATPγS لمنع CMG من الانتشار خارج نهايات الحمض النووي وكذلك لتثبيت CMG28 بشكل عام. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن التركيبات العازلة وتركيزات البروتين التي نبلغها هنا تستند إلى تلك المستخدمة في العمل الكيميائي الحيوي وأحادي الجزيء السابق11,18 ، فإن الفحص الذي نصفه متوافق تماما مع البروتوكولات الأخرى لتجميع CMG 26,27. لذلك ، فإن أي تقدم كيميائي حيوي تم الإبلاغ عنه لزيادة كفاءة تجميع CMG أو تنشيطه يمكن ويجب تنفيذه في الجزء الأكبر من الفحص لزيادة المحصول. أخيرا ، تؤدي زيادة الوقت بين الإطارات إلى زيادة الوقت الإجمالي الذي يمكن فيه تصوير CMG ، مما يسهل مراقبة حركة CMG بعيدة المدى قبل تبييض الفلوروفور.
حدود الطريقة
الطريقة الهجينة التي نصفها محدودة حيث يمكن للمرء فقط تصوير CMG بعد تنشيطه بكميات كبيرة. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من العمل لمراقبة تنشيط CMG في الوقت الفعلي. هناك قيد مهم آخر وهو أنه بينما نتوقع تجميع CMG في أزواج17،26،27 ، فإن العدد الإجمالي لمجمعات CMG لكل حمض نووي نلاحظه هو في الغالبواحد 28 ، مما يشير إلى أن CMG ، أو على الأقل Cdc45 ينفصل عن الحمض النووي أثناء التعامل مع مجمعات الحمض النووي الحساسة: CMG. إن تقليل عدد خطوات المناولة قبل التصوير أحادي الجزيء ، بالإضافة إلى تطوير استراتيجيات تخميل أفضل للأنابيب البلاستيكية وزجاج خلية تدفق الموائع الدقيقة مهيأة لزيادة هذا العائد.
أهمية الطريقة
استخدمت دراسات الحركة أحادية الجزيء ل CMG حتى الآن CMG المنشط مسبقا المنقى كمركب من الخلايا. على الرغم من أنه أبسط نسبيا ، إلا أن نهج CMG الذي تم تنشيطه مسبقا محدود من حيث أنه يفتقد أيا من الخطوات التي تؤدي إلى تنشيط CMG ، بالإضافة إلى الطبيعة ثنائية الاتجاه ل CMG والحركة الاستجابية. من ناحية أخرى ، فإن إعادة التكوين الكامل لتجميع وتنشيط CMG لديه القدرة على دراسة أي خطوات ما قبل التنشيط ، وكذلك دراسة حركة CMG بطريقة ثنائية الاتجاه. ومع ذلك ، يصعب ترجمة هذا النهج من المستوى الكيميائي الحيوي السائب إلى مستوى الجزيء الواحد ، لأنه ينطوي على الكثير من عوامل وخطوات البروتين النقي. ساعد الفحص الذي نصفه هنا في التغلب على هذه التحديات من خلال السماح لنا بتصوير حركة CMG المعاد تشكيلها بالكامل على مستوى الجزيء الواحد ، مما يسمح لنا بالوصول إلى بعض ديناميكيات ما قبل التنشيط المفقودةسابقا 28. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أننا نرى في الغالب CMG واحدا لكل حمض نووي ، فقد تمكنا من ملاحظة عدة حالات لمركبين CMG يتحركان في اتجاهين متعاكسين ، ويمكننا حتى التقاط الفصل الأولي ل CMGs الشقيقة عن بعضهاالبعض 28 ، مما يوفر بعض الأفكار حول إنشاء النسخ المتماثل ثنائي الاتجاه.
ميزة أخرى لهذا الفحص مقارنة بحركة CMG السابقة تكمن في الطبيعة المزدوجة تماما لركيزة الحمض النووي التي نستخدمها (الشكل 1 أ). في أعمال CMG السابقة التي تم تنشيطها مسبقا ، كانت الطريقة الأكثر شيوعا لربط CMG بركيزة الحمض النووي هي من خلال رفرف ssDNA مقاس 3 بوصات. ينتج عن هذا بناء الحمض النووي الذي لا يمكن تقييده بسهولة من الناحية الالتوائية وبالتالي يحظر دراسة دور اللف الفائق في التقدم الاستجابي. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن يكون للطريقة الجديدة التي نصفها هنا إمكانية التكيف لدراسة دور عزم الدوران في هذه العملية؛ لأن ركيزة الحمض النووي المستخدمة مزدوجة الشريط تماما.
تطبيقات أوسع للطريقة
سيمهد الفحص الهجين الموصوف الطريق نحو إعادة التكوين الكامل ل repplisome حقيقي النواة الكامل ، مما يسمح لنا وللآخرين بمراقبة وتحديد الديناميكيات المهمة التي تسمح للرد بالنجاح في جميع مهامه المختلفة. بغض النظر عن تكرار الحمض النووي ، يمثل الفحص الذي نبلغه تقدما مهما في ترجمة تفاعل كيميائي حيوي معقد من الكيمياء الحيوية السائبة إلى مستوى الجزيء الواحد. نتوقع أن هذا الاختبار يمكن تعديله بسهولة لدراسة تفاعلات الحمض النووي المعقدة المماثلة: البروتين المشاركة في آليات معالجة الحمض النووي المختلفة.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
يشكر المؤلفون آن إيرلي ولوسي دروري وماكس دوغلاس على توفير سلالات الخميرة للإفراط في التعبير عن البروتينات غير المسماة ، بالإضافة إلى أعضاء مختبر N.D. أنوج كومار وكاتينكا ليجثارت وجوليان جروس لمساعدتهم في تنقية عوامل التحميل و DDK. يشكر المؤلفون أيضا كالي مكلوسكي ، ودوريان ميكولاجزاك ، وجوزيف ييليس ، وجاكوب لويس ، وأليساندرو كوستا ، وحسن يارديمسي ، وتايكجيب ها على المناقشات العلمية المفيدة. تعترف D.R.M. بالتمويل المقدم من زمالة بوهرنجر إنجلهايم فوندز للدكتوراه. تقر N.D. بالتمويل من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO) من خلال منحة Top 714.017.002 ومن مجلس البحوث الأوروبي من خلال منحة متقدمة (REPLICHROMA ؛ رقم المنحة 789267).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AflII | NEB | R0520L | |
Anti-digoxigenin coated polystyrene beads | Spheroteck | DIGP-20-2 | |
ATP solution | Thermo Fisher | R0441 | |
ATPγS | Roche | 11162306001 | |
BSA | NEB | B9000S | |
C-Trap | Lumicks | ||
CutSmart Buffer | NEB | B6004S | Provided with AflII |
dCTP | Promega | U122B | |
D-Desthiobiotin-7-dATP | Jena Bioscience | NU-835-Desthiobio | |
dGTP | Thermo Fisher | 10218014 | |
Digoxigenin-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-DIGXL | |
Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads | Invitrogen | 11205D | |
Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
Microspin S-400 HR spin columns | GE Healthcare | GE27-5140-01 | |
NEBuffer2 | NEB | B7002S | Provided with Klenow Fragment |
Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385 | |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved