تحسين عزل وتنقية الخلايا المتوسطة الكبيبية الفئرانية

Xinyu Zhai; Xiaoke Huang; Jingcao Huang; Yuhuan Zheng

doi:10.3791/68144

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

طورت هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لعزل الخلايا المتوسطة الفئران (MCs) وزراعة الخلايا خارج الجسم الحي . يمكن تمرير هذه الخلايا عدة مرات وتجميدها وإحيائها وزراعتها دون المساس بنمو الخلايا أو التعبير عن البروتين.

Abstract

الخلايا المتوسطة (MCs) هي خلايا لحمية تقع في الفضاء الأوسط من الكبيبة ، مع وظائف محورية في التوازن الكبيبي. تم تطوير طرق عزل وتنقية واستزراع MCs الكبيبية وتحسينها منذ الثمانينيات لاستخدامها في البحوث الطبية الحيوية ، لا سيما في مجال أمراض الكلى. الفئران هي النماذج الحيوانية التجريبية الأكثر استخداما في الأبحاث حول أمراض الكلى. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول محسن لعزل MCs الفئران وزراعة الخلايا خارج الجسم الحي . يمكن تمرير هذه الخلايا عدة مرات وتجميدها وإحيائها وزراعتها دون المساس بنمو الخلايا أو التعبير عن البروتين. يقلل هذا النهج الأمثل بشكل كبير من مدة الدراسة للباحثين ويتيح الحفاظ على الخلايا على المدى الطويل. يمكن الوصول بسهولة إلى المعدات اللازمة للإجراءات في مختبر الطب الحيوي الأساسي ، والخطوات الإجرائية واضحة. يتطلب اكتساب الخلايا المستهدفة 2-3 أسابيع فقط ، أي انخفاض لمدة أسبوع واحد على الأقل مقارنة بالطرق الحالية.

Introduction

الكبيبة هي شبكة من الشعيرات الدموية تؤدي المهمة الأساسية المتمثلة في تصفية الدم لتكوين البول¹. الخلايا المتوسطة (MCs) مضمنة في المصفوفة المتوسطة ، وتقع بين الشعيرات الدموية الكبيبية ، وهي في وضع فريد للتأثير على ديناميكيات الكبيبات من خلال وظائفها المتنوعة². تلعب MCs أدوارا حاسمة في الكبيبة ، بما في ذلك التطور الكبيبي ، والدعم الهيكلي للشعيرات الدموية الكبيبية ، والبلعمة ، وإنتاج مصفوفة الغشاء القاعدي الكبيبي³. تعتبر دراسة الخلايا المتوسطة محورية لتعزيز فهمنا لفسيولوجيا الكلى وعلم الأمراض.

من الجدير بالملاحظة أيضا أن مشاركة الخلايا المتوسطة في الحالات المرضية. استجابة لإصابة أو مرض الكبيبات ، مثل اعتلال الكلية السكري أو التهاب كبيبات الكلى ، يمكن للخلايا المتوسطة أن تتكاثر وتفرز مكونات مصفوفة زائدة خارج الخلية ، مما يؤدي إلى تصلب الكبيبات وضعف وظائف الكلى⁴^،⁵. لذلك ، فإن فهم وظائف الخلايا المتوسطة وآلياتها التنظيمية أمر ضروري لتطوير استراتيجيات علاجية لأمراض الكلى.

تمكن الخلايا المتوسطة الفئران الباحثين من نمذجة واستكشاف العمليات الجزيئية والخلوية التي تنطوي عليها حالات مثل اعتلال الكلية^{IgA 6} ، واعتلال الكلية السكري⁷ ، وتصلب الكبيبات القطعي البؤري (FSGS) ⁸^،⁹. نظرا لدورها في التليف الكلوي والالتهابات ، كثيرا ما تستخدم MCs الكبيبية الفئران في الدراسات السريرية لتقييم فعالية المركبات العلاجية⁹^،¹⁰. بالإضافة إلى ذلك ، تعد الخلايا المتوسطة للفئران أداة مهمة لدراسة تأثيرات مسارات الإشارات المختلفة على وظائف الكلى ، بما في ذلك مسار RhoA / ROCK¹¹ ومسار عامل النمو المحول بيتا (TGF-β)¹². تساعد هذه الدراسات في توضيح كيف تساهم جزيئات الإشارات هذه في تطور أمراض الكلى. سواء تم استخدامها لنمذجة الأمراض أو التطوير العلاجي أو أبحاث نقل الإشارات ، تستمر MCs في الفئران في العمل كمورد حاسم لتعزيز فهمنا لصحة الكلى وأمراضها.

ماكاي وآخرون أنشأ طريقة لاكتساب خطوط الخلايا خارج الجسم الحي من الخلايا الظهارية الكبيبية والمتوسطة والبطانية من الفئران المعدلة وراثيا في عام 1988¹³. طور ويلسون وستيوارت طريقة لعزل وتنقية MCs الأولية من أنسجة الكلى للمريض ، والتي تتضمن ثلاث جولات من الغربلة والغسيل المكثف بالوسائط¹⁴. اقترح Menè و Stoppacciaro أيضا طريقة لعزل MCs الأولية عن أنسجة الكلى للمريض أو الفئران. تتضمن هذه التقنية جولتين من الغربلة ، ودفعتين بإبرة ، وهضم الكولاجيناز. يتم طلاء الخلايا التي تم الحصول عليها من 4-8 كلى فئران على صفيحة من ستة آبار ، على الرغم من أن العائد منخفض^{نسبيا 15}. تتطلب هذه الطرق تشريح الكلى إلى قطع صغيرة قبل المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، تستغرق هذه الأساليب حوالي 3-4 أسابيع لإنتاج MCs منقاة.

الفئران هي النماذج الحيوانية التجريبية الأكثر استخداما في الأبحاث حول أمراض الكلى. ومع ذلك ، لا تزال هناك طريقة منهجية لعزل MCs في الفئران. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول محسن لعزل MCs الفئران وزراعة الخلايا خارج الجسم الحي . يمكن استخدام هذه الطريقة عند استخدام MCs الأولية في كلى الفئران للبحث التجريبي. بالمقارنة مع الطرق السابقة ، فإن هذا النهج يلغي الحاجة إلى قطع الأنسجة والغربلة قبل الهضم. بدلا من ذلك ، يتم طحن كلية الفأر بأكملها باستخدام مطحنة خلوية وهضمها مباشرة باستخدام الكولاجيناز. ثم يتم غربلة محلول الهضم مرتين ، مع جمع جميع الخلايا على المنخل الثاني وإعادة تعليقها. تسمح هذه الطريقة لكليتين من الفأر بإنتاج خلايا كافية لزرع أطباق إلى ثلاثة أطباق استزراع 100 مم في غضون 10 أيام. يتم الحصول على MCs المنقاة لاحقا من خلال الاستزراع والتنقية باستخدام وسائط متخصصة تحتوي على D-valine. يمكن تمرير هذه الخلايا عدة مرات وتجميدها وإحيائها وزراعتها دون المساس بنمو الخلايا أو التعبير عن البروتين. المعدات المطلوبة لهذه الإجراءات متاحة بسهولة للمختبرات الطبية الحيوية الأساسية ، وتستغرق العملية برمتها 2-3 أسابيع فقط للحصول على الخلايا المستهدفة. هذه الطريقة مناسبة للدراسات التي تشمل MCs الفئران للتحقيق في الأمراض أو الآليات المتعلقة بالكلى ، لأنها فعالة وموفرة للوقت.

Protocol

امتثلت التجارب على لإرشادات ARRIVE ، وتم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للتشريعات الوطنية وتوجيه المفوضية الأوروبية (2010/63 / EU). تم إيواء الفئران وصيانتها في ظروف خالية من مسببات الأمراض ، وفقا لمتطلبات لجان رعاية واستخدامه في مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان. تمت الموافقة على جميع الدراسات التجريبية التي أجريت على من قبل لجان رعاية واستخدامه في مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6JGpt البالغة من العمر ثمانية أسابيع لعزل الخلايا المتوسطة في هذا الفحص. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد. يوضح الشكل 1 إجراءات عزل وتنقية الخلايا المتوسطة الكبيبية في الفئران.

1. تحضير الكواشف لعزل MCs في الفئران

ملاحظة: تأكد من أن جميع الكواشف والمعدات معقمة.

النوع الأول من الكولاجيناز (750 وحدة / مل): قم بوزن المسحوق وإذابته قبل وقت قصير من الاستخدام في RPMI 1640.
وسائط زراعة الخلايا المتوسطة 1: امزج RPMI 1640 مع 2 ملي مولار من الجلوتامين ، و 17٪ FBS ، والمضادات الحيوية (100 وحدة / مل البنسلين بالإضافة إلى 10,000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) ، و 0.1 وحدة / مل الأنسولين.
وسائط زراعة الخلايا المتوسطة 2: امزج RPMI 1640 (D-valine) مع 2 ملي مولار من الجلوتامين ، و 10٪ FBS ، والمضادات الحيوية (100 وحدة / مل من البنسلين بالإضافة إلى 10,000 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) ، و ITS-G (الأنسولين ، الترانسفيرين ، محلول السيلينيوم 100x) ، و 0.1 U / مل الأنسولين. قم بتخزين وسائط زراعة الخلايا المتوسطة في درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدمها في غضون شهر واحد بعد التحضير.
وسائط حفظ الخلية بالتبريد: قم بإعداد خليط من وسط RPMI 1640 والمصل و DMSO بنسبة 7: 2: 1.

2. عزل MCs الفئران

التضحية الإنسانية بالفئران عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). اغمر الجثث في دورق يحتوي على 75٪ كحول للتعقيم ، ثم انقل إلى سطح عمل معقم.
قم بإزالة كليتي الفأر بشكل معقم باستخدام المقص والملاقط ، وضعها في طبق بتري ، واشطفها باستخدام EBSS (محلول إيرل المتوازن للملح) ، ثم قم بإزالة النسيج الضام وكبسولة الكلى بعناية باستخدام الملقط.
قم بتقطيع الكلى إلى نصفين عموديا ، وأضف 3-4 مل من محلول الكولاجيناز الأول ، وطحنها بمدقة خلية بلاستيكية.
ماصة جميع الأنسجة والمحلول من طبق بتري إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اشطف طبق بتري ب 1-2 مل من محلول الكولاجيناز I لضمان نقل جميع الأنسجة. ضع المحلول في الخلاط عند 37 درجة مئوية ، مع رجه عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. ثم أضف حجما متساويا من محلول التوقف (وسائط الثقافة 1).
ماصة المحلول من أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل ، وقم بتمريره عبر مصفاة خلية 100 ميكرومتر ، وجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
مرر السائل من الخطوة 2.5 عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر ، مع الاحتفاظ فقط بالخلايا الموجودة على مصفاة الخلية 40 ميكرومتر. اشطف المصفاة بشكل متكرر باستخدام وسائط الثقافة 1 لضمان جمع أكبر عدد ممكن من الخلايا على المصفاة. انقل الخلايا المجمعة من المصفاة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.
قم بالطرد المركزي للتعليق عند 600 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) ، ثم أعد تعليق الخلايا في طبق زراعة الخلايا وفقا لكثافة الخلية. بشكل عام ، قم بإعادة تعليق الخلايا من كليتين في طبقين أو ثلاثة أطباق مزرعة 100 مم (10 مل من وسائط الثقافة 1/100 مم). ضع الأطباق في حاضنة خلية 37 درجة مئوية مع 95٪ هواء / 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
افحص مورفولوجيا الخلية والتصاقها تحت المجهر (40×) في اليوم التالي. في حالة وجود خلايا ميتة عائمة في وسط الاستزراع ، استخدم ماصة لإزالة الوسائط من قاع طبق المزرعة ، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا المرفقة.
أضف 1-2 مل PBS على طول الحافة الداخلية لطبق الثقافة لشطف الخلايا. استخدم ماصة لإزالة كل PBS من قاع طبق الاستزراع، وأخيرا أضف 10 مل من وسائط الثقافة 1 على طول الحافة الداخلية لطبق الاستزراع.

3. تنقية MCs الفئران

بعد يوم واحد من الانفصال، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق غسل وسائط المزرعة برفق واستبدالها بوسائط مزرعة جديدة 1 كما هو موضح في الخطوة 2.8. راقب خلايا الكبيبة تحت مجهر تباين الطور (40×).
ملاحظة: تمثل الأشكال الكروية الساطعة الكبيبة ، بينما تظهر الخلايا المحيطة سمات تشبه الحصى ، وهي سمة من سمات الخلايا الظهارية (الشكل 2 أ).
راقب مورفولوجيا الخلية بعد 1-3 أيام (الشكل 2B-C). ستظهر خلايا على شكل نجمي وعلى شكل مغزل حول الخلايا المرصوفة بالحصى ، كما هو موضح في الشكل 2 د.
عندما تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء (عادة في غضون 7-10 أيام) ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS معقم ، ثم قم بتربسين الخلايا بمحلول التربسين 0.25٪ (2 مل من محلول التربسين 0.25٪ لكل طبق 100 مم).
قد تستغرق عملية التربسين الخلوية الأولية حوالي 20 دقيقة. عند إضافة التربسين ، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية. راقب العملية في الوقت الفعلي تحت مجهر تباين الطور (40×) لتقييم التربسين في الخلايا.
قم بإنهاء عملية التربسين عن طريق إضافة حجم متساو من الوسائط 2 عندما تظهر معظم الخلايا مورفولوجيا مستديرا وتنفصل عن سطح الطبق.
الطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) ، ثم أعد تعليقها في الوسائط 2. بشكل عام ، قم بإعادة تعليق الخلايا من طبق واحد مقاس 100 مم في طبقين للزراعة مقاس 100 مم (10 مل من الوسائط المزروعة 2/100 مم).
قم بتغيير الوسائط الثقافية 2 في اليوم التالي. لاحظ العديد من الخلايا العالقة وشظايا الخلايا تحت المجهر (40×) ، حيث يمكن ل MCs فقط البقاء على قيد الحياة والتكاثر في وسائط D-valine¹⁶. قم بتغيير الوسائط كل 1-2 أيام لإزالة الخلايا الميتة. الخلايا الملتصقة في الثقافة هي MCs (الشكل 3A-D). تحديد معدل نمو MCs المعزولة (الشكل 3E).
بمجرد أن تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء ، قم بالتربسين ومرورها. عادة ما تستغرق MCs حوالي 5-10 دقائق للتربسين.

4. الحفاظ على MCs الفئران على المدى الطويل

ملاحظة: نظرا لأن الخلايا الأولية قد تتمايز وتتحور بمرور الوقت والممرات المتعددة ، فقم بتجميد وتخزين MCs بعد تنقية الخلايا للحفاظ عليها على المدى الطويل.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية على طول الحافة السفلية للطبق باستخدام ماصة ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS معقم ، ثم قم بالتربسين بمحلول التربسين 0.25٪ (2 مل من محلول التربسين 0.25٪ لكل طبق 100 مم). اتبع خطوات التربسينية كما هو موضح في الخطوات 3.3-3.8.
بعد التربسين ، أضف حجما متساويا من الوسائط 2 لإنهاء العملية ، وانقل السائل بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل PBS لحساب الخلايا.
استخدم عداد الخلايا التلقائي لحساب الخلايا. خذ 20 ميكرولتر من 1 مل من محلول الخلية المعلق وأضفه إلى لوحة عد الخلايا المخصصة لتحديد العدد الإجمالي للخلايا. بناء على عدد الخلايا ، أعد تعليقها في وسائط الحفظ بالتبريد الخلوية (1 مل من وسائط الحفظ بالتبريد لكل 10^{6 خلايا} ).
انقل محلول الخلية إلى أنابيب الحفظ بالتبريد (1 مل من وسائط الحفظ بالتبريد لكل 2 مل أنبوب الحفظ بالتبريد) وقم بإجراء التجميد البطيء إلى -80 درجة مئوية قبل نقله إلى النيتروجين السائل للحفظ.
ملاحظة: قم بتعليق الخلايا وبذرها في أطباق زراعة الخلايا لتضخيمها حسب الحاجة. يجب استخدام الخلايا بين الممرات 3 و 8 بعد أن يتم تمييزها^{بالكامل 17}.

5. تحديد MCs الفئران

ملاحظة: بعد مرور الخلايا مرتين ، حدد MCs الفئران باستخدام التقنيات التالية.

لطخة غربية من MCs الفئران
ملاحظة: الكواشف اللازمة لهذا الإجراء موصوفة في الجدول التكميلي 1.
1. قم بتربسين الخلايا باتباع نفس الخطوات كما في 3.3-3.8 والخطوة 4.1.
2. بعد جمع الخلايا ، قم بتحلل الخلايا لاستخراج البروتينات وقياس تركيز البروتين.
3. خذ كمية مناسبة من العينة (عادة 20 نانوغرام) ، وأضف عازلة التحميل ، وقم بتغيير طبيعتها عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. قم بحل البروتين (20 نانوغرام) باستخدام جل SDS-PAGE بنسبة 10٪ أو جل SDS-PAGE بنسبة 7.5٪ ، ثم انقله إلى غشاء السليلوز بجهد ثابت.
5. قم بسد الغشاء بحليب خالي من الدسم بنسبة 5٪ ، ثم احتضن الجسم المضاد الأساسي عند 4 درجات مئوية على شاكر طوال الليل.
6. احتضان الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بعد الغسيل باستخدام TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) ثلاث مرات.
7. كشف الإشارات باستخدام نظام التصوير.
  ملاحظة: تضمنت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة الفأر المضاد ل αSMA (1: 500) ، والأرانب المضادة للفيمنتين (1: 2000) ، والأرانب المضادة للفيبرونيكتين (1: 2000) ، والفأر المضاد ل GAPDH (1: 50000). تضمنت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذه الدراسة الماعز المترافق بالبيروكسيداز IgG (H + L) (1: 5000) والماعز المترافق بالبيروكسيداز المضاد للفأر IgG (H + L) (1: 5000).
صبغة التألق المناعي ل MCs الفئران
ملاحظة: الكواشف اللازمة لهذا الإجراء موصوفة في الجدول التكميلي 2.
1. قم بتربسين الخلايا باتباع نفس الخطوات كما في الخطوات 3.3-3.8 والخطوة 4.1.
2. أعد تعليق الخلايا وعدادها. خذ 1 × 10⁵ خلايا وأضفها إلى طبق زراعة الخلية السفلي الزجاجي مقاس 15 مم (1 مل ، وسائط زراعة 2 لكل قاع زجاجي 15 مم).
3. قم بإصلاح MCs بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة (1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لكل قاع زجاجي 15 مم) ، ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS.
4. عالج MCs باستخدام 0.1٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق لاختراق أغشية الخلايا.
5. بعد ثلاث غسلات أخرى باستخدام PBS ، قم بسد الخلايا في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول BSA PBS بنسبة 3٪ لمدة 30 دقيقة.
6. اغسل الخلايا واحتضانها بالأجسام المضادة الأولية المضادة للفأر αSMA والأجسام المضادة للأرانب عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
7. احتضن لمدة ساعة واحدة مع الحمار الثانوي المضاد للفأر IgG المقترن باللون الأحمر Alexa 594 والحمار المضاد للأرانب IgG المقترن ب FITC الأخضر في درجة حرارة الغرفة.
8. استخدم DAPI للتلطيخ النووي لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. أضف وسائط الفلورو وقم بتغطيتها بشريحة زجاجية. تحليل الخلايا باستخدام مجهر متحد البؤر.
  ملاحظة: تضمنت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة الفأر المضاد ل αSMA (1: 200) والأرانب المضادة للفيمنتين (1: 200). تضمنت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذه الدراسة الحمار IgG المضاد للفأر المترافق مع Alexa 594 الأحمر (1: 400) ، والحمار المضاد للأرانب IgG المترافق مع FITC الأخضر (1: 400) ، و DAPI (1: 1000).
قياس التدفق الخلوي ل MCs الفئران
1. قم بتربسين الخلايا باتباع نفس الخطوات كما في الخطوات 3.3-3.8 والخطوة 4.1.
2. أعد تعليق الخلايا وعدادها. خذ 5 × 10⁵ خلايا واغسلها مرة واحدة باستخدام 3 مل PBS.
3. أعد تعليق الخلايا ب 100 ميكرولتر من PBS في أنبوب التدفق ، ثم أضف 1-2 ميكرولتر من الجسم المضاد PDGFRB المضاد للفأر (CD140b).
4. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام ، ثم قم بتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

النتائج

طورت هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لعزل MCs في الفئران وزراعة الخلايا خارج الجسم الحي . على حد علمنا ، لا توجد طريقة قياسية للتحقق من صحة MCs الأولية خارج الجسم الحي. وفقا للمنشورات السابقة ، تتميز MCs بالتعبير عن αSMA و Vimentin و Fibronectin³^،¹⁴

Discussion

تنتشر الأمراض المرتبطة بالكلى بشكل كبير ، وتستخدم الفئران على نطاق واسع كنموذج حيواني أساسي لدراسة هذه الحالات نظرا لتشابهها الجيني مع البشر وتوافر نماذج مرضية راسخة. تلعب الخلايا المتوسطة دورا مهما في الحفاظ على الهيكل الطبيعي ووظيفة الكبيبة من خلال توفير الدعم الهيك...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح ، مالية أو غير ذلك.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح ل Y.Z. من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82470196 ورقم 82070219 ورقم 81870157) ، وصندوق بدء أعضاء هيئة التدريس بجامعة سيتشوان.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µm Cell Strainer	Biosharp	BS-100-CS
100 mm Petri Dish	Sorfa	230301
15 mL Centrifuge Tube	Sorfa	411000
15 mm glass bottom cell culture dish	Sorfa	201200
180 kDa Plus Prestained Protein Marker	Vazyme	MP201-01
2 mM L-glutamine	BasalMedia	S210JV
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
40 µm Cell Strainer	Biosharp	BS-40-XBS
50 mL Centrifuge Tube	Sorfa	41000
60 mm Petri Dish	Sorfa	230201
75% Alcohol	Knowles	64-17-5
96 Well Cell Culture Plates, TC-treated	Servicebio	CCP-96H
Antibiotics (10 μg/mL ceftriaxone plus 100 μg/mL gentamicin)	NCM	C100C5
BCA (Bicinchoninic acid) Protein Assay kit	CWBIO	CW0014S
Cell Counting Kit-8	Oriscience	CB101
Confocal Microscope	FV-3000	Olympus
DMSO	Sigma	D2650
DMSO	Sigma	D2650
Earle's Balanced Salt Solution (1x EBSS)	Beyotime	C0213
Fetal Bovine Serum (FBS)	Excell	FSP500
Fluorescence Cell Analyzer	Mira FL	Countstar
Fluoromount media	Southern Biotech	0100-01
Insulin, Transferrin, Selenium Solution 100x (ITS -G)	Gibco	41400045
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX83
Lysis Buffer	Adilab	PP1101
One-Step PAGE Preparation Kit (10%)	Oriscience	PB102
One-Step PAGE Preparation Kit (7.5%)	Oriscience	PB101
PE anti-mouse CD140b Antibody	Biolegend	323605
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Servicebio	G4202
Plastic Cell Pestle	Biofil	CC-4090
Proteinase Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001
PVDF Membrane	Vazyme	E802-01
Recombinant Human Insulin	Solarbio	11061-68-0
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Corning	10-040-CV
SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5x)	Servicebio	G2013
Specially customized Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (D-valine instead of L-valine)	Procell	WH3923U222
TBS (Tris Buffered Saline)	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Biosharp	BS084
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200072
Tween 20	Biosharp	BS100
Type I collagenase	Solarbio	CB140

References

Pollak, M. R., Quaggin, S. E., Hoenig, M. P., Dworkin, L. D. The glomerulus: The sphere of influence. Clin J Am Soc Nephrol. 9 (8), 1461-1469 (2014).
Mené, P., Simonson, M. S., Dunn, M. J. Physiology of the mesangial cell. Physiol Rev. 69 (4), 1347-1424 (1989).
Avraham, S., Korin, B., Chung, J. J., Oxburgh, L., Shaw, A. S. The mesangial cell - the glomerular stromal cell. Nat Rev Nephrol. 17 (12), 855-864 (2021).
Chadban, S. J. Atkins, R. C. Glomerulonephritis. Lancet. 365 (9473), 1797-1806 (2005).
Qian, Y., Feldman, E., Pennathur, S., Kretzler, M., Brosius, F. C., 3rd. From fibrosis to sclerosis: Mechanisms of glomerulosclerosis in diabetic nephropathy. Diabetes. 57 (6), 1439-1445 (2008).
Zhu, Y. et al. Iga nephropathy: Gut microbiome regulates the production of hypoglycosilated iga1 via the tlr4 signaling pathway. Nephrol Dial Transplant. 39 (10), 1624-1641 (2024).
Kong, L.-L. et al. Advances in murine models of diabetic nephropathy. J Diabetes Res. 2013, 797548 (2013).
Schiffer, M. et al. Inhibitory smads and tgf-beta signaling in glomerular cells. J Am Soc Nephrol. 13 (11), 2657-2666 (2002).
Gyarmati, G. et al. Sparsentan improves glomerular hemodynamics, cell functions, and tissue repair in a mouse model of FSGS. JCI Insight. 9 (19), e177775 (2024).
Chafin, C. B., Regna, N. L., Hammond, S. E., Reilly, C. M. Cellular and urinary microRNA alterations in NZB/W mice with hydroxychloroquine or prednisone treatment. Int Immunopharmacol. 17 (3), 894-906 (2013).
Lucero, C. M. et al. Tnf-α plus il-1β induces opposite regulation of cx43 hemichannels and gap junctions in mesangial cells through a rhoa/rock-dependent pathway. Int J Mol Sci. 23 (17) (2022).
Schnaper, H. W., Hayashida, T., Hubchak, S. C., Poncelet, A.C. Tgf-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol. 284 (2), F243-252 (2003).
Mackay, K. et al. Glomerular epithelial, mesangial, and endothelial cell lines from transgenic mice. Kidney Int. 33 (3), 677-684 (1988).
Wilson, H. M. Stewart, K. N. Glomerular epithelial and mesangial cell culture and characterization. Methods Mol Med. 107 269-282 (2005).
Menè, P. Stoppacciaro, A. Isolation and propagation of glomerular mesangial cells. Methods Mol Biol. 466 3-17 (2009).
Gilbert, S. F. Migeon, B. R. D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture. Cell. 5 (1), 11-17 (1975).
Kreisberg, J. I., Venkatachalam, M., Troyer, D. Contractile properties of cultured glomerular mesangial cells. Am J Physiol. 249 (4 Pt 2), F457-463 (1985).
Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell rna-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
Sadovnic, M. J., Brand-Elnaggar, J., Bolton, W. K. Isolation and characterization of chicken mesangial cells. Nephron. 58 (1), 75-84 (1991).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article