Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה פיתח פרוטוקול אופטימלי לבידוד תאים מזנגיאלים של עכברים (MCs) ותרבית תאי ex vivo שלהם. ניתן להעביר תאים אלה מספר פעמים, להקפיא, להחיות ולתרבית מבלי לפגוע בצמיחת התאים או בביטוי החלבון.

Abstract

תאים מזנגיים (MCs) הם תאים סטרומליים הממוקמים בחלל האמצעי של הגלומרולוס, עם פונקציות מרכזיות בהומאוסטזיס גלומרולרי. שיטות לבידוד, טיהור וטיפוח MCs גלומרולרים פותחו ועברו אופטימיזציה מאז שנות ה-80 לשימוש במחקר ביו-רפואי, במיוחד בתחום הנפרולוגיה. עכברים הם המודלים הנפוצים ביותר של חיות ניסוי במחקר על מחלות כליות. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול אופטימלי לבידוד MCs של עכברים ותרבית תאים ex vivo . ניתן להעביר תאים אלה מספר פעמים, להקפיא, להחיות ולתרבית מבלי לפגוע בצמיחת התאים או בביטוי החלבון. גישה אופטימלית זו מפחיתה משמעותית את משך המחקר עבור החוקרים ומאפשרת שימור תאים לטווח ארוך. הציוד הדרוש להליכים נגיש בקלות במעבדה ביו-רפואית בסיסית, והשלבים הפרוצדורליים פשוטים. רכישת תאי מטרה דורשת 2-3 שבועות בלבד, הפחתה של שבוע לפחות בהשוואה לשיטות הקיימות.

Introduction

הגלומרולוס היא רשת של נימים המבצעת את המשימה החיונית של סינון דם ליצירת שתן1. תאים מזנגיים (MCs) משובצים בתוך המטריצה המזנגיאלית, הממוקמים בין הנימים הגלומרולריים, וממוקמים באופן ייחודי להשפיע על הדינמיקה הגלומרולרית באמצעות תפקידיהם המגוונים2. MCs ממלאים תפקידים מכריעים בגלומרולוס, כולל התפתחות גלומרולרי, תמיכה מבנית בנימים גלומרולריים, פגוציטוזיס וייצור מטריצת קרום הבסיס הגלומרולרית3. חקר תאים מזנגיאלים הוא חיוני לקידום הבנתנו את הפיזיולוגיה והפתולוגיה של הכליות.

ראויה לציון גם מעורבותם של תאים מזנגיאלים במצבים פתולוגיים. בתגובה לפגיעה או מחלה גלומרולרית, כגון נפרופתיה סוכרתית או גלומרולונפריטיס, תאים מזנגיאלים יכולים להתרבות ולהפריש רכיבי מטריצה חוץ-תאיים עודפים, מה שמוביל לגלומרולוסקלרוזיס ולפגיעה בתפקוד הכליות 4,5. הבנת הפונקציות ומנגנוני הבקרה של תאים מזנגיאלים חיונית, אם כן, לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למחלות כליות.

תאים מזנגיאלים של עכברים מאפשרים לחוקרים למדל ולחקור את התהליכים המולקולריים והתאיים המעורבים במצבים כגון נפרופתיה IgA6, נפרופתיה סוכרתית7 וגלומרולוסקלרוזיס מוקדית (FSGS)8,9. בהתחשב בתפקידם בפיברוזיס כלייתי ודלקת, MCs גלומרולרים של עכברים משמשים לעתים קרובות במחקרים קליניים כדי להעריך את היעילות של תרכובות טיפוליות 9,10. בנוסף, תאים מזנגיאלים של עכברים הם כלי חשוב לחקר ההשפעות של מסלולי איתות שונים על תפקוד הכליות, כולל מסלול RhoA/ROCK11 ומסלול Transforming Growth Factor-beta (TGF-β)12. מחקרים אלה עוזרים להבהיר כיצד מולקולות איתות אלו תורמות להתקדמות מחלת כליות. בין אם הם משמשים למודלים של מחלות, פיתוח טיפולי או מחקר העברת אותות, MCs של עכברים ממשיכים לשמש כמשאב מכריע לקידום ההבנה שלנו לגבי בריאות ומחלות כליות.

מקיי ועמיתיו הקימו שיטה לרכישת קווי תאים ex vivo של תאי אפיתל גלומרולרי, מזנגיל ואנדותל מעכברים טרנסגניים בשנת 198813. וילסון וסטיוארט פיתחו שיטה לבידוד וטיהור MCs ראשוניים מרקמת הכליה של המטופל, הכוללת שלושה סבבים של סינון ושטיפה נרחבת עם מדיה14. מאנה וסטופפצ'ארו הציעו גם שיטה לבידוד MCs ראשוניים מרקמת כליה של מטופל או חולדה. טכניקה זו כוללת שני סבבי סינון, שתי לחיצות מחט ועיכול קולגנאז. תאים המתקבלים מ-4-8 כליות של חולדות מצופים על צלחת של שש בארות, אם כי התשואה נמוכה יחסית15. שיטות אלו מחייבות חיתוך הכליות לחתיכות קטנות לפני העיבוד. בנוסף, לגישות אלו לוקח כ-3-4 שבועות להניב MCs מטוהרים.

עכברים הם המודלים הנפוצים ביותר של חיות ניסוי במחקר על מחלות כליות. עם זאת, עדיין חסרה שיטה שיטתית לבידוד MCs של עכברים. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול אופטימלי לבידוד MCs של עכברים ותרבית תאים ex vivo . ניתן להשתמש בשיטה זו בעת שימוש ב-MCs ראשוניים של כליות עכברים למחקר ניסיוני. בהשוואה לשיטות קודמות, גישה זו מבטלת את הצורך בחיתוך רקמות וסינון לפני העיכול. במקום זאת, כל כליית העכבר נטחנת באמצעות מטחנת תאים ומתעכלת ישירות עם קולגנאז. לאחר מכן מסננים את תמיסת העיכול פעמיים, כאשר כל התאים נאספים על המסננת השנייה ומושעה מחדש. שיטה זו מאפשרת לשתי כליות עכבר לייצר מספיק תאים כדי לזרוע שתיים עד שלוש מנות תרבית של 100 מ"מ תוך 10 ימים. MCs מטוהרים מתקבלים לאחר מכן באמצעות תרבית וטיהור באמצעות מדיה מיוחדת המכילה D-valine. ניתן להעביר תאים אלה מספר פעמים, להקפיא, להחיות ולתרבית מבלי לפגוע בצמיחת התאים או בביטוי החלבון. הציוד הנדרש להליכים אלה זמין בקלות למעבדות ביו-רפואיות בסיסיות, והתהליך כולו לוקח רק 2-3 שבועות כדי להשיג את תאי המטרה. שיטה זו מתאימה למחקרים הכוללים MCs של עכברים כדי לחקור מחלות או מנגנונים הקשורים לכליות, מכיוון שהיא יעילה וחוסכת זמן.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים עמדו בהנחיות ARRIVE, וכל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם לחקיקה הלאומית ולהנחיית הנציבות האירופית (2010/63/EU). העכברים שוכנו והוחזקו בתנאים נטולי פתוגנים, בהתאם לדרישות הוועדות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן. כל המחקרים הניסיוניים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן. עכברים זכרים בני שמונה שבועות C57BL/6JGpt שימשו לבידוד תאים מזנגיאלים בבדיקה זו. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים. איור 1 ממחיש את ההליכים לבידוד וטיהור תאים מזנגיים גלומרולרים של עכברים.

1. הכנת ריאגנטים לבידוד MCs של עכברים

הערה: ודא שכל הריאגנטים והציוד סטריליים.

  1. קולגנאז סוג I (750 יח'/מ"ל): יש לשקול את האבקה ולהמיס זמן קצר לפני השימוש ב-RPMI 1640.
  2. מדיה 1 של תרבית תאים מזנגיאלית: מערבבים RPMI 1640 עם 2 מ"מ גלוטמין, 17% FBS, אנטיביוטיקה (100 יחידות/מ"ל פניצילין בתוספת 10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) ו-0.1 U/mL אינסולין.
  3. מדיה של תרבית תאים מזנגיאלית 2: שלב RPMI 1640 (D-valine) עם 2 מ"מ גלוטמין, 10% FBS, אנטיביוטיקה (100 יחידות/מ"ל פניצילין בתוספת 10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין), ITS-G (אינסולין, טרנספרין, תמיסת סלניום 100x) ו-0.1 U/mL אינסולין. יש לאחסן מדיה של תרבית תאים מזנגיאלית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש תוך חודש לאחר ההכנה.
  4. אמצעי שימור הקפאה של תאים: הכינו תערובת של מדיום RPMI 1640, סרום ו-DMSO ביחס של 7:2:1.

2. בידוד MCs עכברים

  1. הקרבה אנושית של עכברים באמצעות חנקCO2 ואחריו פריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). טבלו את הפגרים בכוס המכילה 75% אלכוהול לעיקור, ואז העבירו את החיה למשטח עבודה אספטי.
  2. הסר באופן אספטי את כליות העכבר באמצעות מספריים ופינצטה, הנח אותן בצלחת פטרי, שטוף עם EBSS (תמיסת המלח המאוזנת של ארל), ולאחר מכן הסר בזהירות את רקמת החיבור ואת קפסולת הכליות באמצעות פינצטה.
  3. חוצים את הכליה אנכית, מוסיפים 3-4 מ"ל תמיסת קולגנאז I וטוחנים בעזרת עלי תאים מפלסטיק.
  4. פיפטה את כל הרקמות והתמיסה מצלחת הפטרי לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שטפו את צלחת הפטרי עם 1-2 מ"ל תמיסת קולגנאז I כדי להבטיח שכל הרקמות מועברות. מניחים את התמיסה בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מנערים ב-120 סל"ד למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף נפח שווה של פתרון עצירה (מדיית תרבות 1).
  5. פיפטו את התמיסה מצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל, העבירו אותה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר, ואספו את המסנן בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
  6. העבירו את הנוזל משלב 2.5 דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר, תוך שמירה רק על התאים במסננת התאים של 40 מיקרומטר. שטפו את המסננת שוב ושוב עם אמצעי תרבית 1 כדי להבטיח איסוף של כמה שיותר תאים על המסננת. העבירו את התאים שנאספו מהמסננת לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל.
  7. צנטריפוגה את התרחיף ב-600 x גרם למשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר), ואז השהה מחדש את התאים בצלחת תרבית תאים בהתאם לצפיפות התאים. בדרך כלל, השעו מחדש את התאים משתי כליות בשתיים או שלוש צלחות תרבית של 100 מ"מ (צלחת תרבית 10 מ"ל 1/100 מ"מ). מניחים את הכלים באינקובטור תאים של 37 מעלות צלזיוס עם 95% אוויר/5% CO2.
  8. יש לבחון את המורפולוגיה וההידבקות של התא במיקרוסקופ (40×) למחרת. אם קיימים תאים מתים צפים באמצעי התרבית, השתמש בפיפטה כדי להסיר את המדיה מתחתית צלחת התרבית, והקפיד לא להפריע לתאים המחוברים.
  9. הוסף 1-2 מ"ל PBS לאורך הקצה הפנימי של צלחת התרבות כדי לשטוף את התאים. השתמש בפיפטה כדי להסיר את כל ה-PBS מתחתית צלחת התרבות, ולבסוף הוסף 10 מ"ל מדיית תרבית 1 לאורך הקצה הפנימי של צלחת התרבות.

3. טיהור MCs של עכברים

  1. יום אחד לאחר ההפרדה, הסר את התאים הלא נדבקים על ידי שטיפה עדינה והחלפת אמצעי התרבית במצע תרבית טרי 1 כמתואר בשלב 2.8. התבונן בתאי הגלומרולוס תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (40×).
    הערה: הצורות הכדוריות הבהירות מייצגות את הגלומרולוס, בעוד שהתאים שמסביב מציגים מאפיינים דמויי אבן, האופייניים לתאי אפיתל (איור 2A).
  2. התבוננו במורפולוגיה של התא אחרי 1-3 ימים (איור 2B-C). תאים בצורת כוכב וציר יופיעו סביב התאים המרוצפים, כפי שמוצג באיור 2D.
  3. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80% (בדרך כלל תוך 7-10 ימים), יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי, ואז לנסות את התאים בתמיסת טריפסין של 0.25% (2 מ"ל של תמיסת טריפסין של 0.25% למנה של 100 מ"מ).
  4. תהליך הטריפסיניזציה הראשוני של התאים עשוי להימשך כ-20 דקות. לאחר הוספת טריפסין, מניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. התבונן בתהליך בזמן אמת תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (40×) כדי להעריך את הטריפסיניזציה של תאים.
  5. סיים את תהליך הטריפסיניזציה על ידי הוספת נפח שווה של מדיה 2 כאשר רוב התאים מציגים מורפולוגיה מעוגלת ומתנתקים משטח הצלחת.
  6. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 600 × גרם למשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר), ואז השעו אותם מחדש במדיה 2. בדרך כלל, השעו מחדש את התאים מכלי אחד של 100 מ"מ בשתי צלחות תרבית של 100 מ"מ (צלחת תרבית של 10 מ"ל 2/100 מ"מ).
  7. שנה את המדיה התרבותית 2 למחרת. התבונן בתאים תלויים רבים ובשברי תאים תחת המיקרוסקופ (40×), מכיוון שרק MCs יכולים לשרוד ולהתרבות במדיה של D-valine16. החלף את המדיה כל 1-2 ימים כדי להסיר תאים מתים. התאים הדבקים בתרבית הם MCs (איור 3A-D). קבע את קצב הגדילה של MCs מבודדים (איור 3E).
  8. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%, יש לנסוע ולעבור אותם. MCs בדרך כלל לוקחים בערך 5-10 דקות לטריפסיניזציה.

4. שימור ארוך טווח של MCs עכברים

הערה: מכיוון שתאים ראשוניים עשויים להתמיין ולעבור מוטציות עם הזמן ומעברים מרובים, הקפיאו ואחסנו MCs לאחר טיהור התאים לשימור ארוך טווח.

  1. הסר בזהירות את הסופרנטנט לאורך הקצה התחתון של המנה בעזרת פיפטה, שטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי, ואז נסה עם תמיסת טריפסין של 0.25% (2 מ"ל של תמיסת טריפסין של 0.25% למנה של 100 מ"מ). בצע את שלבי הטריפסיניזציה כמתואר בשלבים 3.3-3.8.
  2. לאחר הניסיון, הוסף נפח שווה של מדיה 2 כדי לסיים את התהליך, והעביר את הנוזל כולו לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה של התאים ב-600 × גרם למשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר), השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל PBS כדי לספור את התאים.
  3. השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים. קח 20 מיקרוליטר מ-1 מ"ל של תמיסת תאים מושעה והוסף אותו לצלחת ספירת תאים ייעודית כדי לקבוע את מספר התאים הכולל. בהתבסס על ספירת התאים, השעו אותם מחדש באמצעי שימור הקפאה של תאים (1 מ"ל מדיה לשימור הקפאה של תאים לכל 106 תאים).
  4. העבירו את תמיסת התא לצינורות שימור בהקפאה (אמצעי שימור בהקפאה של תאים 1 מ"ל לכל צינור שימור בהקפאה של 2 מ"ל) ובצעו הקפאה איטית ל-80 מעלות צלזיוס לפני העברתם לחנקן נוזלי לשימור.
    הערה: השעו וזרעו את התאים בכלי תרבית תאים להגברה לפי הצורך. יש להשתמש בתאים בין מעברים 3 ו-8 לאחר אפיון מלא17.

5. זיהוי MCs של עכברים

הערה: לאחר מעבר התאים פעמיים, זהה את ה-MCs של העכברים באמצעות הטכניקות הבאות.

  1. כתם מערבי של MCs עכברים
    הערה: הריאגנטים הדרושים להליך מסופקים בטבלה משלימה 1.
    1. נסה את התאים לפי אותם שלבים כמו ב-3.3-3.8 ובשלב 4.1.
    2. לאחר איסוף התאים, יש לבז את התאים כדי לחלץ חלבונים ולמדוד את ריכוז החלבון.
    3. קח כמות מתאימה של דגימה (בדרך כלל 20 ננוגרם), הוסף מאגר טעינה ונטורל ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. פותרים את החלבון (20 ננוגרם) עם ג'ל SDS-PAGE 10% או ג'ל SDS-PAGE 7.5%, ואז מעבירים אותו לקרום תאית במתח קבוע.
    5. חסמו את הממברנה עם חלב נטול שומן 5%, ולאחר מכן דגרו עם הנוגדן העיקרי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר למשך הלילה.
    6. דגירה עם הנוגדן המשני בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לאחר שטיפה עם TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) שלוש פעמים.
    7. זיהוי אותות באמצעות מערכת ההדמיה.
      הערה: הנוגדנים העיקריים ששימשו במחקר זה כללו אנטי-αSMA בעכבר (1:500), אנטי-וימנטין ארנב (1:2000), אנטי-פיברונקטין ארנב (1:2000) ואנטי-GAPDH בעכבר (1:50000). הנוגדנים המשניים ששימשו במחקר זה כללו IgG נגד ארנב מצומד פרוקסידאז (H + L) (1:5000) ו-IgG נגד עכבר עז מצומד פרוקסידאז (H + L) (1:5000).
  2. כתם אימונופלואורסצנטי של MCs עכברים
    הערה: הריאגנטים הדרושים להליך מסופקים בטבלה משלימה 2.
    1. נסה את התאים לפי אותם שלבים כמו בשלבים 3.3-3.8 ושלב 4.1.
    2. השעו מחדש את התאים וספרו אותם. קח 1 x 105 תאים והוסף אותם לצלחת תרבית תאים תחתונה מזכוכית 15 מ"מ (1 מ"ל אמצעי תרבית 2 לכל תחתית זכוכית 15 מ"מ).
    3. תקן את ה-MCs עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות (1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד לכל תחתית זכוכית של 15 מ"מ), ולאחר מכן שטוף שלוש פעמים עם PBS.
    4. טפל ב-MCs עם 0.1% Triton X-100 למשך 10 דקות כדי לחלחל את קרומי התאים.
    5. לאחר שלוש כביסות נוספות עם PBS, חסום את התאים בטמפרטורת החדר עם תמיסת 3% BSA PBS למשך 30 דקות.
    6. שטפו את התאים ודגרו אותם עם נוגדנים ראשוניים נגד עכבר αSMA ונוגדני וימנטין נגד ארנב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    7. דגירה למשך שעה אחת עם IgG נגד עכבר חמור משני מצומד לאדום Alexa 594 וחמור נגד ארנב IgG מצומד ל-FITC ירוק בטמפרטורת החדר.
    8. השתמש ב-DAPI לצביעה גרעינית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
    9. הוסף מדיה פלואורו-הר וכסה בשקופית זכוכית. נתח את התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
      הערה: הנוגדנים העיקריים ששימשו במחקר זה כללו אנטי-αSMA של עכברים (1:200) ואנטי-וימנטין של ארנב (1:200). הנוגדנים המשניים ששימשו במחקר זה כללו IgG נגד עכבר חמור מצומד לאדום Alexa 594 (1:400), IgG נגד ארנב חמור מצומד ל-FITC ירוק (1:400) ו-DAPI (1:1000).
  3. ציטומטריית זרימה של MCs עכברים
    1. נסה את התאים לפי אותם שלבים כמו בשלבים 3.3-3.8 ושלב 4.1.
    2. השעו מחדש את התאים וספרו אותם. קח 5 x 105 תאים ושטוף אותם פעם אחת עם 3 מ"ל PBS.
    3. השעו מחדש את התאים עם 100 מיקרוליטר PBS בצינור זרימה, ולאחר מכן הוסיפו 1-2 מיקרוליטר של נוגדן PDGFRB נגד עכבר (CD140b).
    4. דגרו את התאים על הקרח למשך 30 דקות בחושך, ולאחר מכן נתחו על ידי ציטומטריית זרימה.

תוצאות

מחקר זה פיתח פרוטוקול אופטימלי לבידוד MCs של עכברים ותרבית תאים ex vivo. למיטב ידיעתנו, לא קיימת שיטה סטנדרטית לאימות MCs ראשוניים ex vivo. על פי פרסומים קודמים, MCs מאופיינים בביטוי של αSMA, וימנטין ופיברונקטין 3,14,15. ניתוח ...

Discussion

מחלות הקשורות לכליות נפוצות מאוד, ועכברים נמצאים בשימוש נרחב כמודל החי העיקרי לחקר מצבים אלה בשל הדמיון הגנטי שלהם לבני אדם וזמינותם של מודלים מבוססים של מחלות. תאים מזנגיים ממלאים תפקיד מכריע בשמירה על המבנה והתפקוד התקינים של הגלומרולוס על ידי מתן תמיכה מבנית, ויסות ס...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים, כספיים או אחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל-Y.Z. מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82470196, מס' 82070219 ומס' 81870157), וקרן ההתחלה של הפקולטה של אוניברסיטת סצ'ואן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 µm Cell StrainerBiosharpBS-100-CS
100 mm Petri DishSorfa230301
15 mL Centrifuge TubeSorfa411000
15 mm glass bottom cell culture dishSorfa201200
180 kDa Plus Prestained Protein MarkerVazymeMP201-01
2 mM L-glutamineBasalMediaS210JV
4% ParaformaldehydeBiosharpBL539A
40 µm Cell StrainerBiosharpBS-40-XBS
50 mL Centrifuge TubeSorfa41000
60 mm Petri DishSorfa230201
75% AlcoholKnowles64-17-5
96 Well Cell Culture Plates, TC-treatedServicebioCCP-96H
Antibiotics (10 μg/mL ceftriaxone plus 100 μg/mL gentamicin)NCMC100C5
BCA (Bicinchoninic acid) Protein Assay kitCWBIOCW0014S
Cell Counting Kit-8OriscienceCB101
Confocal MicroscopeFV-3000Olympus
DMSOSigmaD2650
DMSOSigmaD2650
Earle's Balanced Salt Solution (1x EBSS) Beyotime C0213
Fetal Bovine Serum (FBS)ExcellFSP500
Fluorescence Cell AnalyzerMira FL Countstar
Fluoromount mediaSouthern Biotech0100-01
Insulin, Transferrin, Selenium Solution 100x (ITS -G)Gibco41400045
Inverted Fluorescence MicroscopeOlympusIX83
Lysis BufferAdilabPP1101
One-Step PAGE Preparation Kit (10%)OrisciencePB102
One-Step PAGE Preparation Kit (7.5%)OrisciencePB101
PE anti-mouse CD140b AntibodyBiolegend323605
Phosphate Buffered Saline (PBS)ServicebioG4202
Plastic Cell PestleBiofil CC-4090
Proteinase Inhibitor CocktailRoche4693159001
PVDF MembraneVazymeE802-01
Recombinant Human InsulinSolarbio11061-68-0
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumCorning10-040-CV
SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5x)ServicebioG2013
Specially customized Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (D-valine instead of L-valine)ProcellWH3923U222
TBS (Tris Buffered Saline) ServicebioG0001-2L
Triton X-100BiosharpBS084
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200072
Tween 20BiosharpBS100
Type I collagenaseSolarbio CB140

References

  1. Pollak, M. R., Quaggin, S. E., Hoenig, M. P., Dworkin, L. D. The glomerulus: The sphere of influence. Clin J Am Soc Nephrol. 9 (8), 1461-1469 (2014).
  2. Mené, P., Simonson, M. S., Dunn, M. J. Physiology of the mesangial cell. Physiol Rev. 69 (4), 1347-1424 (1989).
  3. Avraham, S., Korin, B., Chung, J. J., Oxburgh, L., Shaw, A. S. The mesangial cell - the glomerular stromal cell. Nat Rev Nephrol. 17 (12), 855-864 (2021).
  4. Chadban, S. J. Atkins, R. C. Glomerulonephritis. Lancet. 365 (9473), 1797-1806 (2005).
  5. Qian, Y., Feldman, E., Pennathur, S., Kretzler, M., Brosius, F. C., 3rd. From fibrosis to sclerosis: Mechanisms of glomerulosclerosis in diabetic nephropathy. Diabetes. 57 (6), 1439-1445 (2008).
  6. Zhu, Y. et al. Iga nephropathy: Gut microbiome regulates the production of hypoglycosilated iga1 via the tlr4 signaling pathway. Nephrol Dial Transplant. 39 (10), 1624-1641 (2024).
  7. Kong, L.-L. et al. Advances in murine models of diabetic nephropathy. J Diabetes Res. 2013, 797548 (2013).
  8. Schiffer, M. et al. Inhibitory smads and tgf-beta signaling in glomerular cells. J Am Soc Nephrol. 13 (11), 2657-2666 (2002).
  9. Gyarmati, G. et al. Sparsentan improves glomerular hemodynamics, cell functions, and tissue repair in a mouse model of FSGS. JCI Insight. 9 (19), e177775 (2024).
  10. Chafin, C. B., Regna, N. L., Hammond, S. E., Reilly, C. M. Cellular and urinary microRNA alterations in NZB/W mice with hydroxychloroquine or prednisone treatment. Int Immunopharmacol. 17 (3), 894-906 (2013).
  11. Lucero, C. M. et al. Tnf-α plus il-1β induces opposite regulation of cx43 hemichannels and gap junctions in mesangial cells through a rhoa/rock-dependent pathway. Int J Mol Sci. 23 (17) (2022).
  12. Schnaper, H. W., Hayashida, T., Hubchak, S. C., Poncelet, A.C. Tgf-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol. 284 (2), F243-252 (2003).
  13. Mackay, K. et al. Glomerular epithelial, mesangial, and endothelial cell lines from transgenic mice. Kidney Int. 33 (3), 677-684 (1988).
  14. Wilson, H. M. Stewart, K. N. Glomerular epithelial and mesangial cell culture and characterization. Methods Mol Med. 107 269-282 (2005).
  15. Menè, P. Stoppacciaro, A. Isolation and propagation of glomerular mesangial cells. Methods Mol Biol. 466 3-17 (2009).
  16. Gilbert, S. F. Migeon, B. R. D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture. Cell. 5 (1), 11-17 (1975).
  17. Kreisberg, J. I., Venkatachalam, M., Troyer, D. Contractile properties of cultured glomerular mesangial cells. Am J Physiol. 249 (4 Pt 2), F457-463 (1985).
  18. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell rna-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  19. Sadovnic, M. J., Brand-Elnaggar, J., Bolton, W. K. Isolation and characterization of chicken mesangial cells. Nephron. 58 (1), 75-84 (1991).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ex vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved