Otimizando o isolamento e a purificação de células mesangiais glomerulares murinas

Resumo

Este estudo desenvolveu um protocolo otimizado para o isolamento de células mesangiais murinas (MCs) e sua cultura de células ex vivo . Essas células podem ser passadas várias vezes, congeladas, revividas e cultivadas sem comprometer o crescimento celular ou a expressão de proteínas.

Resumo

As células mesangiais (MCs) são células estromais localizadas no espaço médio do glomérulo, com funções fundamentais na homeostase glomerular. Métodos para isolar, purificar e cultivar MCs glomerulares foram desenvolvidos e otimizados desde a década de 1980 para uso em pesquisas biomédicas, particularmente no campo da nefrologia. Os camundongos são os modelos animais experimentais mais utilizados na pesquisa de doenças renais. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo otimizado para isolamento de MCs murinos e cultura de células ex vivo . Essas células podem ser passadas várias vezes, congeladas, revividas e cultivadas sem comprometer o crescimento celular ou a expressão de proteínas. Essa abordagem otimizada reduz significativamente a duração do estudo para os pesquisadores e permite a preservação celular a longo prazo. O equipamento necessário para os procedimentos é facilmente acessível em um laboratório biomédico básico, e as etapas do procedimento são simples. A aquisição de células-alvo requer apenas 2-3 semanas, uma redução de pelo menos 1 semana em comparação com os métodos existentes.

Introdução

O glomérulo é uma rede de capilares que realiza a tarefa essencial de filtrar o sangue para formar a urina¹. As células mesangiais (MCs) estão inseridas na matriz mesangial, situadas entre os capilares glomerulares, e estão posicionadas de forma única para influenciar a dinâmica glomerular por meio de suas diversas funções². Os MCs desempenham papéis cruciais no glomérulo, incluindo desenvolvimento glomerular, suporte estrutural para capilares glomerulares, fagocitose e produção da matriz da membrana basal glomerular³. O estudo das células mesangiais é fundamental para o avanço da nossa compreensão da fisiologia e patologia renal.

O envolvimento de células mesangiais em condições patológicas também é digno de nota. Em resposta à lesão ou doença glomerular, como nefropatia diabética ou glomerulonefrite, as células mesangiais podem proliferar e secretar componentes da matriz extracelular em excesso, levando à glomeruloesclerose e comprometimento da função renal ^4,5. Compreender as funções e os mecanismos regulatórios das células mesangiais é, portanto, essencial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças renais.

As células mesangiais murinas permitem que os pesquisadores modelem e explorem os processos moleculares e celulares envolvidos em condições como nefropatia por IgA⁶, nefropatia diabética⁷ e glomeruloesclerose segmentar focal (GESF) ^{8 , 9} . Devido ao seu papel na fibrose e inflamação renal, os MCs glomerulares murinos são frequentemente usados em estudos clínicos para avaliar a eficácia de compostos terapêuticos ^9,10. Além disso, as células mesangiais murinas são uma ferramenta importante para estudar os efeitos de várias vias de sinalização na função renal, incluindo a via RhoA/ROCK¹¹ e a via do Fator de Crescimento Transformador-beta (TGF-β)¹². Esses estudos ajudam a elucidar como essas moléculas sinalizadoras contribuem para a progressão da doença renal. Quer sejam usados para modelagem de doenças, desenvolvimento terapêutico ou pesquisa de transdução de sinal, os MCs murinos continuam a servir como um recurso crucial para o avanço de nossa compreensão da saúde e doenças renais.

Mackay et al. estabeleceram um método para adquirir linhagens celulares ex vivo de células epiteliais glomerulares, mesangiais e endoteliais de camundongos transgênicos em 1988¹³. Wilson e Stewart desenvolveram um método para isolar e purificar MCs primários do tecido renal do paciente, que envolve três rodadas de peneiramento e lavagem extensiva com meio¹⁴. Menè e Stoppacciaro também propuseram um método para isolar MCs primários do tecido renal do paciente ou do rato. Esta técnica envolve duas rodadas de peneiramento, duas agulhas e digestão da colagenase. As células obtidas de 4-8 rins de ratos são semeadas em uma placa de seis poços, embora o rendimento seja relativamente baixo¹⁵. Esses métodos exigem a dissecção dos rins em pequenos pedaços antes do processamento. Além disso, essas abordagens levam aproximadamente 3-4 semanas para produzir MCs purificadas.

Os camundongos são os modelos animais experimentais mais frequentemente empregados na pesquisa de doenças renais. No entanto, ainda falta um método sistemático para isolar MCs murinos. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo otimizado para isolamento de MCs murinos e cultura de células ex vivo . Este método pode ser empregado ao usar MCs renais murinos primários para pesquisa experimental. Em comparação com os métodos anteriores, essa abordagem elimina a necessidade de corte e peneiramento do tecido antes da digestão. Em vez disso, todo o rim do camundongo é moído usando um triturador de células e digerido diretamente com colagenase. A solução de digestão é então peneirada duas vezes, com todas as células coletadas na segunda peneira e ressuspensas. Este método permite que dois rins de camundongos produzam células suficientes para semear duas a três placas de cultura de 100 mm em 10 dias. Os MCs purificados são posteriormente obtidos por meio de cultura e purificação usando um meio especializado contendo D-valina. Essas células podem ser passadas várias vezes, congeladas, revividas e cultivadas sem comprometer o crescimento celular ou a expressão de proteínas. O equipamento necessário para esses procedimentos está facilmente disponível para laboratórios biomédicos básicos, e todo o processo leva apenas 2-3 semanas para obter as células-alvo. Este método é adequado para estudos envolvendo MCs murinos para investigar doenças ou mecanismos relacionados aos rins, pois é eficiente e economiza tempo.

Protocolo

As experiências com animais cumpriram as diretrizes ARRIVE e todos os procedimentos em animais foram conduzidos de acordo com a legislação nacional e a Diretiva da Comissão Europeia (2010/63/UE). Os camundongos foram alojados e mantidos em condições livres de patógenos, em conformidade com os requisitos dos Comitês de Cuidados e Uso de Animais do Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan. Todos os estudos experimentais em animais foram aprovados pelos Comitês de Cuidados e Uso de Animais do Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan. Camundongos machos C57BL / 6JGpt de oito semanas de idade foram usados para isolamento de células mesangiais neste ensaio. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais. A Figura 1 ilustra os procedimentos para isolar e purificar as células mesangiais glomerulares murinas.

1. Preparação de reagentes para isolamento de MCs murinos

NOTA: Certifique-se de que todos os reagentes e equipamentos sejam estéreis.

1. Colagenase tipo I (750 U/mL): Pesar o pó e dissolver pouco antes de usar em RPMI 1640.
2. Meios de cultura de células mesangiais 1: Misture RPMI 1640 com 2 mM de glutamina, 17% de FBS, antibióticos (100 unidades/mL de penicilina mais 10.000 μg/mL de estreptomicina) e 0,1 U/mL de insulina.
3. Meios de cultura de células mesangiais 2: Combine RPMI 1640 (D-valina) com 2 mM de glutamina, 10% de FBS, antibióticos (100 unidades / mL de penicilina mais 10.000 μg / mL de estreptomicina), ITS-G (insulina, transferrina, solução de selênio 100x) e 0,1 U / mL de insulina. Conservar os meios de cultura de células mesangiais a 4 °C e utilizar no prazo de 1 mês após a preparação.
4. Meios de criopreservação celular: Prepare uma mistura de meio RPMI 1640, soro e DMSO na proporção de 7:2:1.

2. Isolamento de MCs murinos

1. Sacrifique camundongos humanamente por meio de asfixia por CO₂ seguida de luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Mergulhe as carcaças em um béquer contendo álcool 75% para esterilização e, em seguida, transfira o animal para uma superfície de trabalho asséptica.
2. Remova assepticamente os rins do camundongo usando uma tesoura e uma pinça, coloque-os em uma placa de Petri, enxágue com EBSS (Earle's Balanced Salt Solution) e, em seguida, remova cuidadosamente o tecido conjuntivo e a cápsula renal usando uma pinça.
3. Corte o rim ao meio verticalmente, adicione 3-4 mL de solução de colagenase I e triture com um pilão de células plásticas.
4. Pipetar todos os tecidos e a solução da placa de Petri para um tubo de centrifugação de 15 ml. Enxágue a placa de Petri com 1-2 mL de solução de colagenase I para garantir que todo o tecido seja transferido. Colocar a solução no agitador a 37 °C, agitando a 120 rpm durante 30 min. Em seguida, adicione um volume igual de solução de parada (meio de cultura 1).
5. Pipetar a solução do tubo de centrifugação de 15 ml, passá-la através de um filtro de células de 100 μm e recolher o filtrado num tubo de centrifugação de 50 ml.
6. Passe o fluido da etapa 2.5 por um filtro de células de 40 μm, retendo apenas as células no filtro de células de 40 μm. Enxágue o filtro repetidamente com o meio de cultura 1 para garantir a coleta do maior número possível de células no filtro. Transfira as células coletadas do filtro para um novo tubo de centrífuga de 50 mL.
7. Centrifugar a suspensão a 600 x g durante 5 minutos (à temperatura ambiente) e, em seguida, ressuspender as células numa placa de cultura de células de acordo com a densidade celular. Geralmente, ressuspenda as células de dois rins em duas ou três placas de cultura de 100 mm (10 mL de meio de cultura 1/100 mm). Colocar a loiça numa estufa a 37 °C com 95% de ar/5% de CO₂.
8. Examinar a morfologia e a adesão celular ao microscópio (40×) no dia seguinte. Se houver células mortas flutuantes nos meios de cultura, use uma pipeta para remover o meio do fundo da placa de cultura, tomando cuidado para não perturbar as células anexadas.
9. Adicione 1-2 mL de PBS ao longo da borda interna da placa de cultura para enxaguar as células. Use uma pipeta para remover todo o PBS do fundo da placa de cultura e, finalmente, adicione 10 mL de meio de cultura 1 ao longo da borda interna da placa de cultura.

3. Purificação de MCs murinos

1. Um dia após a separação, remova as células não aderentes lavando suavemente e substituindo os meios de cultura por meios de cultura frescos 1, conforme descrito na etapa 2.8. Observar as células glomérulas ao microscópio de contraste de fase (40×).
   NOTA: As formas esféricas brilhantes representam o glomérulo, enquanto as células circundantes exibem características semelhantes a paralelepípedos, características das células epiteliais (Figura 2A).
2. Observe a morfologia celular após 1-3 dias (Figura 2B-C). Células em forma de estrelado e fusiforme aparecerão ao redor das células de paralelepípedos, conforme mostrado na Figura 2D.
3. Quando as células atingirem 80% de confluência (geralmente dentro de 7 a 10 dias), lave as células duas vezes com PBS estéril e, em seguida, tripsinize as células com solução de tripsina a 0,25% (2 mL de solução de tripsina a 0,25% por placa de 100 mm).
4. O processo inicial de tripsinização celular pode levar aproximadamente 20 min. Ao adicionar tripsina, coloque o prato em uma incubadora a 37 °C. Observe o processo em tempo real sob um microscópio de contraste de fase (40×) para avaliar a tripsinização das células.
5. Termine o processo de tripsinização adicionando um volume igual de meio 2 quando a maioria das células exibir uma morfologia arredondada e se desprender da superfície do prato.
6. Centrifugar as células a 600 × g durante 5 min (à temperatura ambiente) e ressuspendê-las no meio 2. Geralmente, ressuspenda as células de um prato de 100 mm em dois pratos de cultura de 100 mm (10 mL de meio de cultura 2/100 mm).
7. Mude a mídia de cultura 2 no dia seguinte. Observe numerosas células suspensas e fragmentos de células ao microscópio (40×), pois apenas MCs podem sobreviver e proliferar no meio da D-valina¹⁶. Troque a mídia a cada 1–2 dias para remover as células mortas. As células aderentes na cultura são MCs (Figura 3A-D). Determine a taxa de crescimento de MCs isolados (Figura 3E).
8. Quando as células atingirem 80% de confluência, tripsinize e passe-as. Os MCs normalmente levam aproximadamente 5 a 10 minutos para tripsinização.

4. Preservação a longo prazo de MCs murinos

NOTA: Como as células primárias podem se diferenciar e sofrer mutações com o tempo e várias passagens, congele e armazene MCs após a purificação celular para preservação a longo prazo.

1. Remova cuidadosamente o sobrenadante ao longo da borda inferior do prato usando uma pipeta, lave as células duas vezes com PBS estéril e, em seguida, tripsinize com solução de tripsina a 0,25% (2 mL de solução de tripsina a 0,25% por placa de 100 mm). Siga as etapas de tripsinização descritas nas etapas 3.3-3.8.
2. Após a tripsinização, adicione um volume igual de meio 2 para encerrar o processo e transfira todo o líquido para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue as células a 600 × g por 5 min (à temperatura ambiente), descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de PBS para contar as células.
3. Use um contador automático de células para contar as células. Pegue 20 μL de 1 mL de solução de células ressuspensas e adicione-o a uma placa de contagem de células dedicada para determinar o número total de células. Com base na contagem de células, ressuspenda-as em meios de criopreservação de células (1 mL de meio de criopreservação de células por 10⁶ células).
4. Transfira a solução celular para tubos de criopreservação (1 mL de meio de criopreservação celular por 2 mL de tubo de criopreservação) e execute o congelamento lento a -80 ° C antes de transferir para nitrogênio líquido para preservação.
   NOTA: Ressuspenda e semeie as células em placas de cultura de células para amplificação conforme necessário. As células devem ser usadas entre as passagens 3 e 8 após serem totalmente caracterizadas¹⁷.

5. Identificação de MCs murinos

NOTA: Depois que as células forem passadas duas vezes, identifique os MCs murinos usando as seguintes técnicas.

1. Mancha ocidental de MCs murinos
   NOTA: Os reagentes necessários para o procedimento são fornecidos na Tabela Suplementar 1.
   1. Tripsinize as células seguindo as mesmas etapas de 3.3-3.8 e 4.1.
   2. Depois de coletar as células, lise-as para extrair proteínas e medir a concentração de proteínas.
   3. Pegue uma quantidade adequada de amostra (geralmente 20 ng), adicione tampão de carga e desnature a 100 ° C por 5 min.
   4. Resolva a proteína (20 ng) com um gel SDS-PAGE a 10% ou um gel SDS-PAGE a 7,5% e, em seguida, transfira-a para uma membrana de celulose a uma tensão constante.
   5. Bloqueie a membrana com 5% de leite sem gordura e, em seguida, incube com o anticorpo primário a 4 °C em um shaker durante a noite.
   6. Incubar com o anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 h após a lavagem com TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) três vezes.
   7. Detecte sinais com o sistema de imagem.
      NOTA: Os anticorpos primários usados neste estudo incluíram anti-αSMA de camundongo (1:500), anti-vimentina de coelho (1:2000), antifibronectina de coelho (1:2000) e anti-GAPDH de camundongo (1:50000). Os anticorpos secundários usados neste estudo incluíram IgG anti-coelho de cabra conjugada com peroxidase (H + L) (1:5000) e IgG anti-camundongo de cabra conjugada com peroxidase (H + L) (1:5000).
2. Coloração de imunofluorescência de MCs murinos
   NOTA: Os reagentes necessários para o procedimento são fornecidos na Tabela Suplementar 2.
   1. Tripsinize as células seguindo as mesmas etapas das etapas 3.3-3.8 e 4.1.
   2. Ressuspenda as células e conte-as. Pegue 1 x 10⁵ células e adicione-as ao prato de cultura de células com fundo de vidro de 15 mm (1 mL de meio de cultura 2 por 15 mm de fundo de vidro).
   3. Fixe os MCs com paraformaldeído a 4% por 15 min (1 mL de paraformaldeído a 4% por fundo de vidro de 15 mm) e lave três vezes com PBS.
   4. Trate os MCs com 0,1% de Triton X-100 por 10 min para permeabilizar as membranas celulares.
   5. Após mais três lavagens com PBS, bloqueie as células à temperatura ambiente com solução de BSA PBS a 3% por 30 min.
   6. Lave as células e incube-as com anticorpos primários anti-SMA de camundongo e anti-vimentina de coelho a 4 ° C durante a noite.
   7. Incubar por 1 h com IgG anti-rato de burro secundário conjugado com Alexa 594 vermelho e IgG anti-coelho de burro conjugado com FITC verde à temperatura ambiente.
   8. Use DAPI para contracoloração nuclear por 1 min em temperatura ambiente.
   9. Adicione a mídia de fluoromount e cubra com uma lâmina de vidro. Analise as células usando um microscópio confocal.
      NOTA: Os anticorpos primários usados neste estudo incluíram anti-αSMA de camundongo (1:200) e anti-vimentina de coelho (1:200). Os anticorpos secundários usados neste estudo incluíram IgG anti-camundongo de burro conjugada com Alexa 594 vermelha (1:400), IgG anti-coelho de burro conjugada com FITC verde (1:400) e DAPI (1:1000).
3. Citometria de fluxo de MCs murinos
   1. Tripsinize as células seguindo as mesmas etapas das etapas 3.3-3.8 e 4.1.
   2. Ressuspenda as células e conte-as. Pegue 5 x 10⁵ células e lave-as uma vez com 3 mL de PBS.
   3. Ressuspenda as células com 100 μL de PBS em um tubo de fluxo e, em seguida, adicione 1-2 μL de anticorpo anti-PDGFRB (CD140b) de camundongo.
   4. Incube as células no gelo por 30 minutos no escuro e depois analise por citometria de fluxo.

Resultados

Este estudo desenvolveu um protocolo otimizado para isolamento de MCs murinos e cultura de células ex vivo. Até onde sabemos, não existe um método padrão para validar MCs primários ex vivo. De acordo com publicações anteriores, os MCs são caracterizados pela expressão de αSMA, Vimentina e Fibronectina ^3,14,15. A análise de Western blot foi usada para detectar os ní...

Discussão

As doenças relacionadas aos rins são altamente prevalentes, e os camundongos são amplamente utilizados como modelo animal primário para estudar essas condições devido à sua semelhança genética com os humanos e à disponibilidade de modelos de doenças bem estabelecidos. As células mesangiais desempenham um papel crucial na manutenção da estrutura e função normais do glomérulo, fornecendo suporte estrutural, regulando a filtração glomerular e participando das respostas im...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µm Cell Strainer	Biosharp	BS-100-CS
100 mm Petri Dish	Sorfa	230301
15 mL Centrifuge Tube	Sorfa	411000
15 mm glass bottom cell culture dish	Sorfa	201200
180 kDa Plus Prestained Protein Marker	Vazyme	MP201-01
2 mM L-glutamine	BasalMedia	S210JV
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
40 µm Cell Strainer	Biosharp	BS-40-XBS
50 mL Centrifuge Tube	Sorfa	41000
60 mm Petri Dish	Sorfa	230201
75% Alcohol	Knowles	64-17-5
96 Well Cell Culture Plates, TC-treated	Servicebio	CCP-96H
Antibiotics (10 μg/mL ceftriaxone plus 100 μg/mL gentamicin)	NCM	C100C5
BCA (Bicinchoninic acid) Protein Assay kit	CWBIO	CW0014S
Cell Counting Kit-8	Oriscience	CB101
Confocal Microscope	FV-3000	Olympus
DMSO	Sigma	D2650
DMSO	Sigma	D2650
Earle's Balanced Salt Solution (1x EBSS)	Beyotime	C0213
Fetal Bovine Serum (FBS)	Excell	FSP500
Fluorescence Cell Analyzer	Mira FL	Countstar
Fluoromount media	Southern Biotech	0100-01
Insulin, Transferrin, Selenium Solution 100x (ITS -G)	Gibco	41400045
Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX83
Lysis Buffer	Adilab	PP1101
One-Step PAGE Preparation Kit (10%)	Oriscience	PB102
One-Step PAGE Preparation Kit (7.5%)	Oriscience	PB101
PE anti-mouse CD140b Antibody	Biolegend	323605
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Servicebio	G4202
Plastic Cell Pestle	Biofil	CC-4090
Proteinase Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001
PVDF Membrane	Vazyme	E802-01
Recombinant Human Insulin	Solarbio	11061-68-0
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Corning	10-040-CV
SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5x)	Servicebio	G2013
Specially customized Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (D-valine instead of L-valine)	Procell	WH3923U222
TBS (Tris Buffered Saline)	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Biosharp	BS084
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200072
Tween 20	Biosharp	BS100
Type I collagenase	Solarbio	CB140