Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا التقرير الطرق الأساسية المستخدمة لزراعة الطحالب العقدية أحادية الخلية والتلاعب بها تجريبيا. كما يوفر بروتوكولات أساسية للتصوير القائم على الفحص المجهري ، بما في ذلك وضع العلامات على الخلايا الحية بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة ومجسات الفلورسنت الأخرى والفحص المجهري الإلكتروني الماسح.

Abstract

جدار الخلية هو المكون الأول لاستقبال / نقل الإشارة للخلية النباتية أثناء التطور وعند الاستجابة للضغوط البيئية اللاأحيائية والحيوية. تراقب الخلية باستمرار سلامة جدار الخلية وتعدله استجابة للإجهاد. يعد توضيح التعديلات الهيكلية والكيميائية الحيوية المحددة التي تحدث في جدار الخلية مهمة صعبة خاصة عند استخدام النباتات متعددة الخلايا وأعضائها / أنسجتها. ويرجع ذلك إلى القيود المفروضة على ما يمكن حله في خلية فردية تشكل جزءا من شبكة معقدة متعددة الخلايا. تم استخدام الطحالب العقدية أحادية الخلية ، Penium margaritaceum ، مؤخرا في التحقيقات في ديناميكيات البكتين ، واللدونة المظهرية القائمة على جدار الخلية والجوانب المتعددة لبيولوجيا خلايا الطحالب. نمطها الظاهري البسيط ، وجدار الخلية المميز الذي يحتوي على العديد من المكونات المشابهة بشكل ملحوظ لجدران الخلايا النباتية الأرضية ، وسهولة الدراسات الكيميائية المناعية والتجريبية تجعله كائنا نموذجيا قويا في بيولوجيا جدار الخلية النباتية. الهدف من هذه الدراسة هو توفير التقنيات الأساسية للزراعة والتلاعب التجريبي وفحص الضغوطات التطبيقية. بروتوكولات الفحص للكيمياء المناعية ، والتصوير المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر والتصوير المجهري الإلكتروني للمسح الضوئي لبنية جدار الخلية. وبالمثل ، يمكن تعديل العديد من التقنيات الموصوفة لمجموعة واسعة من الدراسات الخلوية والجزيئية الأخرى.

Introduction

جدار الخلية للنبات عبارة عن شبكة بوليمرية معقدة لها أدوار متعددة في حياة الخليةالنباتية 1. تتم مراقبة سلامة جدار الخلية باستمرار من قبل الخلية أثناء التطور واستجابة للإجهاد البيئي ، وتعدل في الكيمياء والهيكل وفقا لذلك. Penium margaritaceum هي طحالب خضراء أحادية الخلية تم استخدامها مؤخرا في دراسات الطحالب العقدية (Streptophyta ، مجموعة الطحالب الخضراء الأكثر ارتباطا وأسلاف النباتاتالبرية 2).

على مدى العقدين الماضيين ، P. margaritaceum كان كائنا مهما في التحقيقات في جدار الخلية وديناميكيات المصفوفة خارج الخلية ، وأنشطة نظام الغشاء الداخلي ، ومظاهر شكل الخلية ، وتطور النبات3،4،5،6،7،8،9،10،11. الهدف من هذا العمل هو تزويد الباحثين في جدار الخلايا النباتية بالطرق الأساسية لزراعة P. margaritaceum ، والتلاعب بها تجريبيا باستخدام التقنيات القائمة على الصفيحة الدقيقة ، ومراقبة بنية جدار الخلية باستخدام وضع العلامات الكيميائية المناعية للخلايا الحية والتصوير باستخدام تقنيات المجهر الضوئي والإلكترون. P. margaritaceum له العديد من أوجه التشابه في الكيمياء الحيوية لجدار الخلية مع جدران الخلايا الأولية للنباتات البرية. لقد ابتكرنا بروتوكولات متعددة تستفيد من النمط الظاهري أحادي الخلية الفريد لهذه الطحالب وتوفر وسيلة سريعة لدراسة ديناميكيات جدار الخلية التي يصعب مراقبتها في النباتات متعددة الخلايا. ستساعد هذه التقنيات علماء الأحياء النباتية في جدار الخلية الذين يرغبون في توضيح ديناميكيات جدار الخلية التفصيلية ، خاصة تلك التي تتعامل مع البكتين ، وتكون بمثابة نقطة انطلاق للدراسات التي تتعامل مع بيولوجيا الخلايا الطحالبية النباتية والعقدية.

Protocol

ملاحظة: يتم الحصول على Penium margaritaceum في Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - مجموعة ثقافة الطحالب في جامعة غوتنغن ، SAG. سلالة # 2640.

1. الحفاظ على الثقافات

  1. حافظ على الطحالب في وسط Woods Hole السائل (WH12) الذي يمكن استكماله أيضا بمستخلص ماء التربة (أي 40 مل لكل لتر من المتوسط). حافظ على الثقافات عند 20-25 درجة مئوية مع ضوء 16 ساعة: 8 ساعات: دورة مظلمة مع 3.5 كيلوكس (74 ميكرومول فوتونات / م2 / ثانية) من ضوء الفلورسنت الأبيض البارد.
  2. قم بإعداد الثقافات الفرعية أسبوعيا واستخدم مزارع الخلايا عندما يبلغ عمرها 10-14 يوما. ستكون مزارع القضيب قابلة للحياة لمدة 6 أشهر ويمكن استخدامها لبدء الثقافات الفرعية خلال هذا الوقت. ستنمو الطحالب أيضا على 1٪ -2٪ أجار WHM المتصلب.
  3. لمزامنة دورة الخلية الروتينية ، ضع الخلايا من الثقافات التي يبلغ عمرها 10-14 يوما في الظلام لمدة 2-6 أسابيع عند 20-25 درجة مئوية. بعد هذا الوقت ، اغسل الخلايا باستخدام WHM الطازج (انظر أدناه) والمزرعة كما هو موضح أعلاه.

2. وضع العلامات على جدار الخلية بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة

ملاحظة: P. margaritaceum مغطى بجدار خلوي أولي يحتوي على العديد من المكونات نفسها الموجودة في جدران الخلايا الأولية للنباتاتالأرضية 11. تتعرف العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) التي يتم رفعها ضد حواتم جدار الخلية النباتية الأرضية على مكونات P. margaritaceum جدار الخلية. تشمل مصادر هذه الأجسام المضادة مركز أبحاث الكربوهيدرات المعقدة بجامعة جورجيا (ccrc@uga.edu) أو كيرافاست (kerafast.com). بعد وضع العلامات على جدار الخلية للخلايا الحية ذات mAbs الأولية الخاصة بحواتم جدار الخلية والأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور (على سبيل المثال ، FITC ، TRITC) ، يمكن إعادة الخلايا إلى الثقافة دون التأثير على صحة ترسب الخلية أو جدار الخلية. يظل وضع العلامات الفلورية لجدار الخلية إلى أجل غير مسمى ، ويظهر جدار الخلية المفرز حديثا كمناطق مظلمة (أي غير مصنفة) يمكن قياسها لتحديد معدلات تمدد الخلية و / أو تصنيفها مرة أخرى باستخدام mAbs أو مجسات أخرى.

  1. قم بإزالة 5 مل من زراعة الخلايا السائلة التي تنمو بنشاط (10-14 يوما) وضعها في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي على جهاز طرد مركزي منضدي عند 1,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
  2. اسكب وتخلص من المادة الطافية أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من WHM الطازج. ضع الغطاء بإحكام وقم بهز الأنبوب بقوة لمدة 10 ثوان لإعادة تعليق الحبيبات وإزالة أي مادة بوليمرية خارج الخلية أو EPS من سطح جدار الخلية.
  3. جهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم لمدة 1 دقيقة. كرر الخطوة 2.2 وجهاز الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من WHM الطازج وانقل 200 ميكرولتر من أجزاء معلق الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل.
  4. قم بتغطية الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق عند 1,000 × جم. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من WHM الطازج.
  5. إلى التعليق ، أضف 20 ميكرولتر من mAb (على سبيل المثال ، JIM5 ، وهو فأر mAb مع خصوصية homogalacturonan منخفض الأستير الميثيل ؛ التخفيف النهائي هو 1/20 مع WHM). قم بتدوير الأنبوب ولفه بورق الألمنيوم وضعه على دوار المختبر لمدة 90 دقيقة. للحصول على أفضل النتائج ، قم بتدوير الأنبوب 2x خلال خطوة الحضانة لمدة 90 دقيقة.
  6. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 1,000 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من WHM الطازج. قم بتغطية الأنبوب ودوامة تعليق الخلية لمدة 10 ثوان.
  7. كرر الخطوة 2.6 2x. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات في 400 ميكرولتر من WHM و 8 ميكرولتر من TRITC أو FITC مضاد للفئران للماعز (مخفف 1/75 مع WHM). دوامة ، لف الأنبوب بورق الألمنيوم ، وضعه على دوار المختبر لمدة 90 دقيقة.
  8. كرر الخطوتين 2.6 و 2.7. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسط النمو, قم بتغطية الأنبوب, ولفه بورق الألمنيوم حتى يصبح جاهزا للتصوير.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام احتضان الخلايا في WHM الذي يحتوي على عامل مانع مثل حليب قرنفل سريع التحضير (1٪) أو ألبومين مصل بقري (1٪) قبل الحضانة في mAbs ولكن في تجربتنا لا يفعل شيئا لتسمية الجودة أو الكثافة. لا يوسع البنيوم جدار الخلية أو ينتج كميات كبيرة من EPS في الظلام. يظل الجسم المضاد المسمى سليما لمدة 3-4 أيام على الأقل. لذلك ، لا يجب إجراء التصوير على الفور. يمكن تطبيق mAbs أخرى هنا ، ولكن يجب اختبار التركيزات. بالنسبة لدراسات الفحص الكيميائي والفيزيائي ، يمكن للمرء تسمية عدة مل من تعليق الخلايا ، المحفوظ في الظلام لعدة أيام واستخدامه في دراسات الصفيحة الدقيقة. يمكن أيضا تصنيف الخلايا بالجسم المضاد الأساسي فقط قبل العلاج ، متبوعا بالجسم المضاد الثانوي لاحقا.

3. قياس جدار الخلية ومعدلات تمدد الخلية بمرور الوقت

  1. خذ 1 مل من الخلايا المسماة ب JIM5-TRITC وضع 1 مل من WHM في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم لمدة 1 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من WHM والدوامة لخلط الخلايا.
  2. أضف إلى كل بئر من طبق بتري المكون من 12 بئرا 1 مل من WHM. في هذا الوقت ، يمكن إضافة مثبطات محددة ومنظمات نمو إلى كل بئر. في هذه الورقة ، نوضح آثار زيادة مستويات الكالسيوم أثناء الحضانة.
  3. خذ 30 ميكرولتر من تعليق الخلية المسمى (الخطوة 1) وأضفه إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة. حرك الطبق برفق للخلط. ختم بفيلم شفاف.
  4. الثقافة على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.1) لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة أو 72 ساعة. في أوقات محددة ، قم بإزالة 250 مل من تعليق الخلية من كل بئر وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ميكرولتر.
  5. جهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من وسط النمو والدوامة.
  6. ضع قطرة 15 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة زجاجية وقم بتغطيتها بغطاء 22 × 22 (سمك 1.5). راقب الخلايا بالمجهر الفلوري باستخدام مرشح TRITC عند 10x -20x.
  7. التقط صورا لما لا يقل عن 50-100 خلية. لكل خلية ، قم بقياس وتسجيل الطول الكلي للخلية وطول المنطقة المظلمة (أي الجدار الجديد الناتج أثناء الحضانة بعد وضع العلامات).
  8. تحديد متوسط النسبة المئوية لجدران الخلايا الجديدة في المزرعة. كرر ذلك للخلايا التي تم جمعها بعد 48 ساعة و 72 ساعة للحصول على معلومات حول تمدد جدار الخلية بمرور الوقت.
    ملاحظة: تنتج الخطوات 3.5-3.8 تعليقا كثيفا للخلايا يسمح بتصوير العديد من الخلايا في مجال رؤية واحد. هذا يجعل القياس اليدوي أكثر ملاءمة. توفر العديد من برامج الكاميرا قياسا مريحا و / أو تلقائيا لأبعاد الخلية التي يمكن استخدامها مع هذه الطحالب. يمكن للمرء أيضا جمع الخلايا وتسميتها على النحو الوارد أعلاه باستخدام JIM5 ولكن استبدال FITC المضاد للفئران باعتباره الجسم المضاد الثانوي. باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (CLSM) ، يمكن للمرء تصوير الخلايا باستخدام كل من مرشحات FITC و TRITC. يمكن بعد ذلك تعيين إشارات الفلورسنت إلى ألوان زائفة مختلفة. يسمح هذا أيضا بوسيلة للتمييز بين بنية جدار الخلية الجديد الذي يتم إنتاجه أثناء العلاجات المختلفة (المسمى ب JIM5-FITC) مقارنة بجدران الخلايا المسبقة (المسمى ب JIM5-TRITC).

4. تصوير الفاصل الزمني لتمدد جدار الخلية

  1. قم بتسمية جدار الخلية ب JIM5-TRITC كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.1-2.8). قم بتخفيف الخلايا 10x في WHM وأضف قطرة 50 ميكرولتر من الخلايا إما إلى طبق بتري ذو غطاء أو طبق بتري زجاجي.
  2. اسمح للخلايا بالالتصاق بالزجاج لمدة دقيقتين في الظلام. اشطف الخلايا التي لم تلتصق بالزجاج برفق ب 1 مل من WHM. استخدم ماصة دقيقة وأضف WHM بعناية إلى الزجاج.
  3. أضف 30 ميكرولتر من WHM فوق الخلايا المتصلة بالزجاج. أضف 30 ميكرولتر من 4٪ agarose / WHM الدافئ فوق قطرة WHM / الخلايا. دع الاغاروز يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ويتصمد.
  4. بالنسبة للعينات الموجودة في طبق بتري ، أضف ما يكفي من WHM لتغطية الخلايا المضمنة في الاغاروز بالكامل. بالنسبة للخلايا الموجودة على قسيمة الغطاء ، اقلب الغطاء وضعه برفق فوق شريحة اكتئاب مملوءة ب WHM.
  5. قم بتركيب الخلايا على مجهر الفلورسنت. يمكن إعداد الإضاءة الخارجية (المصباح) ، أو يمكن استخدام الضوء من المجهر نفسه لتوفير الطاقة لنمو الخلايا وحركتها. على مجهر أوليمبوس Ix83 أو Ix63 ، تعمل قوة 5-6 فولت للمصباح العابر بشكل جيد. قد يتطلب ذلك التجربة والخطأ لنظامك.
  6. صور كل 10-30 دقيقة باستخدام مجموعة مرشح TRITC لتتبع تمدد جدار الخلية. أضف المواد الكيميائية / الإنزيمات إلى WHM المستخدمة في الخطوة 3.8 ، إن وجدت.

5. مراقبة إنتاج المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)

  1. تحضير الخلايا: احصل على 5 مل من الخلايا من المزارع التي يبلغ عمرها 10-14 يوما واغسلها كما في الخطوات 1-4 أعلاه.
  2. تحضير حبات الفلورسنت: إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، أضف قطرة واحدة (حوالي 100 ميكرولتر) من حبات الفلورسنت 0.75 ميكرومتر (متعدد الكريات). أضف 1 مل من WHM إلى الأنبوب ورجها بقوة لإعادة تعليق الخرز. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية. أضف 1 مل من WHM إلى الحبيبات ورجها. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من WHM.
  3. تحضير الآبار: أضف 1 مل من وسط WHM إلى آبار صفيحة 12 بئرا. أضف مثبطات أو منظمات النمو إلى التركيز المطلوب وقم بتحريكه برفق. أضف 10 ميكرولتر من محلول الخرزة وقم بتدوير الطبق برفق لخلط الخرز. أضف 10 ميكرولتر من الخلايا المغسولة إلى كل بئر وقم بتدوير الطبق برفق.
  4. استزراع صفيحة الخلايا على النحو الوارد أعلاه (1.1). بعد 24 ساعة ، ضع اللوحة برفق (احرص على عدم الخلط) على مجهر مضان مقلوب مزود بمرشح FITC. تلتصق الخرزات ب EPS وتكشف عن أنماط إصدار EPS. قم بتصوير الخلايا بمعدل 4x أو 10x أو 20x.

6. تصوير الفاصل الزمني لتشكيل مسار EPS

  1. قم بإجراء تصوير بفاصل زمني في صفيحة مكونة من 12 بئرا (الخطوة 3.2) ، كما هو موضح أعلاه ، أو في طبق بتري فردي. اتبع الخطوات من 1 إلى 4. بدلا من زراعة الخلايا تحت إضاءة الفلورسنت ، يمكن زراعة الخلايا أثناء تركيبها على مجهر فلوري مقلوب.
  2. صور الخلايا كل 5-10 دقائق لالتقاط حركة الخلية بشكل أفضل. يمكن رؤية حبات الفلورسنت باستخدام مجموعة مرشحات FITC ، ولكن بالنسبة للخرز المركز ، استخدم قناة brightfield. يمكن إعداد الإضاءة الخارجية (المصباح) ، أو يمكن استخدام الضوء من المجهر نفسه لتوفير الطاقة لنمو الخلايا وحركتها. على مجهر أوليمبوس Ix83 ، تعمل قوة 5-6 فولت للمصباح العابر بشكل جيد. قد يتطلب ذلك التجربة والخطأ لنظامك.

7. التحليل الهيكلي المترابط لجدار الخلية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)

ملاحظة: يمكن تصوير السمات المتغيرة لجدار الخلية التي لوحظت في الخلايا الحية المصنفة بأجسام مضادة خاصة بالخلية للحصول على ميزات مفصلة باستخدام SEM. يسمح هذا النهج المرتبط بالحصول على بيانات البنية التحتية التي يمكن مقارنتها ببيانات الفلورة.

  1. احصل على 1 مل من معلق الخلية (التحكم أو المعالج تجريبيا) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 4,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
  2. تخلص من المادة الطافية. اغمر الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات في النيتروجين السائل, أو إذا لم يكن متوفرا, ضعه في فريزر -80 درجة مئوية. يمكن تخزين الخلايا المجمدة عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
  3. في وقت معالجة جدار الخلية ، قم بإزالة الأنبوب من الفريزر واتركه يذوب لمدة 15 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من WHM وضع قطرة من تعليق الخلية الكثيفة على غطاء 45 مم × 50 مم.
  4. ضع غطاء ثان فوق القطرة لعمل شطيرة. ضعه على طاولة المختبر واضغط باستمرار على الساندويتش لتمزيق الخلايا (على سبيل المثال 30 ثانية).
  5. افصل الغطاء الزجاجي بعناية واغسل الخلايا الممزقة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 1 دقيقة.
  6. اسكب المادة الطافية. يجب أن تكون الحبيبات بيضاء أو خضراء قليلا. إذا أظهر التصوير اللاحق أن عددا كافيا من الخلايا لم يتمزق ، كرر الخطوة 3 مع الحبيبات هنا.
  7. أعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على جدران الخلايا فيD-H 2O وكرر الخطوتين 7.4 و 7.5. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر منD-H 2O وضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
  8. احصل على كعب كامبريدج (نصف قطر 6 مم أو 8 مم) وقم بلصق شريط الكربون (EMS) على سطحه. بعد ذلك ، ضع 5 قطرات من تعليق جدار الخلية المعلق (الخطوة 7) على شريط الكربون. لاحظ عدد جدران الخلايا باستخدام مجهر تشريح. إذا كان التعليق كثيفا جدا ، فقم بتخفيفه باستخدام D-H2O.
  9. ضع كعب الروتين في وعاء مغطى واتركه حتى يجف (2 ساعة إلى ليلة كاملة). قم بتغطية كعب الروتين لمدة 50 ثانية باستخدام هدف البلاديوم (يمكن استخدام أهداف أخرى أيضا). راقب الخلايا عند 5 كيلو فولت ، حجم البقعة ، على بعد 10 سم من كاشف الإلكترون الثانوي.
    ملاحظة: سيؤدي تخفيف تعليق جدار الخلية قبل ترسيب القطرات على شريط الكربون إلى الحد من ترسيب جدران الخلايا على بعضها البعض.

النتائج

يكشف وضع العلامات على جدار الخلية ل P. margaritaceum باستخدام mAbs المضادة للبكتين (على سبيل المثال ، JIM5) عن شبكة من الألياف والإسقاطات المعقدة بالكالسيوم التي تشكل نمطا منتظما أو شبكة (الشكل 1). يترسب البكتين في مركز الخلية أو البرزخ ، حيث يزيح البكتين القديم ?...

Discussion

P. margaritaceum هو كائن حي فعال لتوضيح ديناميكيات تطور جدار الخلية وإفراز ECM في النباتات والطحالب العقدية. تشمل السمات الرئيسية عادة أحادية الخلية وسهولة في صيانة الثقافة والتلاعب التجريبي ، وجدار خلوي أولي مع شبكة بكتين خارجية مميزة وبوليمرات أخرى ، وسهولة في وضع العلام...

Disclosures

لم يتم الإبلاغ عن تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) (رقم منحة MCB 2129443 إلى DD).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcent. TubesFisher Scientific01-549-740
12 welled microplateFisher Scientific50-233-6077
22 x 22 mm coverslipsFisher Scientific12-541-016
45x 50 cm coverslipsBrain Research4550-1.5D
AgarSigma AldrichA9414
anti-rat FITCSigma AldrichF6258
anti-rat TRITCSigma AldrichT4280
calcium chlorideSigma AldrichC4981
Cambbridge stubsEMS75183-65
Fluoview CLSMEvidentFluoview 1200
JIM5KerafastELD004
JIM7KerafastELD005
MicrocentrifugeFisher Scientific13-100-675
MicropipetorsBioRad1660499EDU
Penium margaritaceum Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae at Göttingen University2640
Polysphere kitPolysciences18336
SEMThermoFisherQuattro SEM
sputter coaterEMSQ150V
Vortex mixerFisher Scientific02-215-414

References

  1. Delmer, D., Dixon, R. A., Keegstra, K., Mohnen, D. The plant cell wall-dynamic, strong, and adaptable-is a natural shapeshifter. Plant Cell. 36 (5), 1257-1311 (2024).
  2. Bierenbroodspot, M. J. et al. Phylogeny and evolution of streptophyte algae. Ann Bot. 134 (3), 385-400 (2024).
  3. Domozych, D. S. et al. Endomembrane architecture and dynamics during secretion of the extracellular matrix of the unicellular charophyte, Penium margaritaceum. J Exp Bot. 71 (11), 3323-3339 (2020).
  4. Feng, X. et al. Genomes of multicellular algal sisters to land plants illuminate signaling network evolution. Nat Genet. 56 (5), 1018-1031 (2024).
  5. Jiao, C. et al. The Penium margaritaceum genome: Hallmarks of the origins of land plants. Cell. 181, 1097-1111 (2020).
  6. LoRicco, J. G. et al. The multifunctional roles of the extracellular matrix in the sessile life of the zygnematophyte Penium margaritaceum: stick, glide and cluster. Physiologie Plantarum., 176(5), e14520 (2024).
  7. LoRicco, J. G. et al. Aberrant growth and expansion in Penium margaritaceum triggered by disruption of microtubules and the cell wall. J Exp Bot. erae387 (2024).
  8. LoRicco, J. G. et al. Chemically induced phenotype plasticity in the unicellular zygnematophyte, Penium margaritaceum. Protoplasma. . 261 (6), 1233-1249 (2024).
  9. Davis, D. J. et al. Callose deposition is essential for the completion of cytokinesis in the unicellular alga, Penium margaritaceum. J Cell Sci. 133 (19), jcs.249599 (2020).
  10. Rydahl, M. G. et al. Penium margaritaceum as a model organism for cell wall analysis of expanding plant cells. Methods Mol Biol. 1242, 1-22 (2015).
  11. Carrillo-Carrasco, V. P., Hernández-García J., Weijers D. Electroporation-based delivery of proteins in Penium margaritaceum and other zygnematophycean algae. Physiol Plant. 175 (6), e14121 (2023).
  12. Nichols, H. W. Growth media-freshwater. Handbook Phycol Methods. 16-17 (1973).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 217

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved