Protocoles de dépistage expérimental, immunocytochimie et techniques d’imagerie basées sur la microscopie pour Penium margaritaceum

Résumé

Ce rapport décrit les méthodes fondamentales utilisées pour cultiver et manipuler expérimentalement l’algue streptophyte unicellulaire, Penium margaritaceum. Il fournit également des protocoles fondamentaux de l’imagerie basée sur la microscopie, y compris le marquage de cellules vivantes avec des anticorps monoclonaux et d’autres sondes fluorescentes et la microscopie électronique à balayage.

Résumé

La paroi cellulaire est le premier composant de la réception/transduction du signal d’une cellule végétale au cours du développement et lors de la réponse aux facteurs de stress environnementaux abiotiques et biotiques. La cellule surveille en permanence l’intégrité de sa paroi cellulaire et la module en réponse au stress. Élucider les modulations structurelles et biochimiques spécifiques qui se produisent dans la paroi cellulaire est une tâche difficile, en particulier lorsqu’on utilise des plantes multicellulaires et leurs organes/tissus. Cela est dû aux limites de ce qui peut être résolu dans une cellule individuelle faisant partie d’un réseau multicellulaire complexe. L’algue streptophyte unicellulaire, Penium margaritaceum, a récemment été utilisée dans l’étude de la dynamique de la pectine, de la plasticité phénotypique de la paroi cellulaire et de multiples aspects de la biologie des cellules d’algues. Son phénotype simple, sa paroi cellulaire distincte qui comporte de nombreux composants notamment similaires aux parois cellulaires des plantes terrestres, et sa facilité dans les études immunocytochimiques et expérimentales en font un organisme modèle puissant en biologie de la paroi cellulaire végétale. L’objectif de cette étude est de fournir les techniques de base pour la culture, la manipulation expérimentale et le dépistage des facteurs de stress appliqués. Protocoles de dépistage pour l’immunocytochimie, l’imagerie confocale par microscopie à balayage laser et l’imagerie par microscopie électronique à balayage de la structure de la paroi cellulaire. De même, bon nombre des techniques décrites peuvent être modifiées pour un large éventail d’autres études cellulaires et moléculaires.

Introduction

La paroi cellulaire d’une plante est un réseau polymère complexe qui a de multiples rôles dans la vie d’une cellule végétale¹. L’intégrité de la paroi cellulaire est constamment surveillée par la cellule pendant le développement et en réponse au stress environnemental et se module en chimie et structure en conséquence. Penium margaritaceum est une algue verte unicellulaire qui a récemment été utilisée dans des études sur les algues streptophytes (Streptophyta, le groupe d’algues vertes les plus étroitement apparentées et ancestrales aux plantes terrestres²).

Au cours des deux dernières décennies, P. margaritaceum a joué un rôle important dans l’étude de la dynamique de la paroi cellulaire et de la matrice extracellulaire, des activités du système endomembranaire, de la manifestation de la forme cellulaire et de l’évolution de la plante. 3,4,5,6,7,8,9,10,11 . L’objectif de ce travail est de fournir aux chercheurs sur la paroi cellulaire végétale les méthodes fondamentales de culture de P. margaritaceum, de sa manipulation expérimentale à l’aide de techniques basées sur des microplaques et de surveillance de la structure de sa paroi cellulaire à l’aide du marquage immunocytochimique de cellules vivantes et de l’imagerie avec des techniques de microscopie optique et électronique. P. margaritaceum présente de nombreuses similitudes dans la biochimie de la paroi cellulaire avec les parois cellulaires primaires des plantes terrestres. Nous avons mis au point plusieurs protocoles qui tirent parti du phénotype unicellulaire unique de cette algue et fournissent un moyen rapide d’étudier la dynamique de la paroi cellulaire qui est souvent difficile à surveiller chez les plantes multicellulaires. Ces techniques seront utiles aux biologistes de la paroi cellulaire végétale qui souhaitent élucider la dynamique détaillée de la paroi cellulaire, en particulier ceux qui traitent de la pectine, et serviront de point de départ pour des études portant sur la biologie des cellules d’algues végétales et streptophytes.

Protocole

REMARQUE : Penium margaritaceum est obtenu à la Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Collection de culture d’algues à l’Université de Göttingen, SAG ; souche #2640.

1. Maintenir les cultures

1. Conserver l’algue dans un milieu liquide Woods Hole (WH¹²) qui peut également être complété par un extrait d’eau du sol (c.-à-d. 40 mL par L de milieu). Maintenir les cultures à 20-25 °C avec un cycle lumière/obscurité de 16 h : 8 h avec 3,5 klux (74 photons μmol/m²/s) de lumière fluorescente blanche froide.
2. Préparez des sous-cultures chaque semaine et utilisez des cultures cellulaires lorsqu’elles ont entre 10 et 14 jours. Les cultures de penium seront viables pendant 6 mois et peuvent être utilisées pour démarrer des sous-cultures pendant cette période. L’algue se développera également sur 1 à 2 % de gélose WHM solidifiée.
3. Pour la synchronisation régulière du cycle cellulaire, placez les cellules de cultures âgées de 10 à 14 jours dans l’obscurité pendant 2 à 6 semaines à 20-25 °C. Après ce temps, lavez les cellules avec du WHM frais (voir ci-dessous) et cultivez comme décrit ci-dessus.

2. Marquage de la paroi cellulaire avec des anticorps monoclonaux

REMARQUE : P. margaritaceum est recouvert d’une paroi cellulaire primaire qui a bon nombre des mêmes constituants que ceux trouvés dans les parois cellulaires primaires des plantes terrestres¹¹. De nombreux anticorps monoclonaux (mAbs) élevés contre les épitopes de la paroi cellulaire des plantes terrestres reconnaissent des composants de la paroi cellulaire de P. margaritaceum . Les sources de ces anticorps comprennent le Centre de recherche sur les glucides complexes de l’Université de Géorgie (ccrc@uga.edu) ou Kerafast (kerafast.com). Après le marquage de la paroi cellulaire de cellules vivantes avec des anticorps monoclonaux primaires spécifiques des épitopes de la paroi cellulaire et des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores (par exemple, FITC, TRITC), les cellules peuvent être remises en culture sans affecter la santé de la cellule ou le dépôt de la paroi cellulaire. Le marquage fluorescent de la paroi cellulaire reste indéfiniment, et la paroi cellulaire nouvellement sécrétée se présente sous la forme de zones sombres (c’est-à-dire non marquées) qui peuvent être mesurées pour déterminer les taux d’expansion cellulaire et/ou marquées à nouveau avec des anticorps monoclonaux ou d’autres sondes.

1. Prélever 5 ml de culture cellulaire liquide en croissance active (âgée de 10 à 14 jours) et la placer dans un tube à centrifuger en plastique de 15 ml. Centrifugeuse sur une centrifugeuse de table à 1 000 x g pendant 1 min.
2. Videz et jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de MHO frais. Placez le capuchon fermement et secouez vigoureusement le tube pendant 10 secondes pour remettre la pastille en suspension et éliminer toute substance polymère extracellulaire ou EPS de la surface de la paroi cellulaire.
3. Centrifugeuse à 1 000 x g pendant 1 min. Répétez l’étape 2.2 et centrifugez. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de WHM frais et transférer 200 μL d’aliquotes de la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
4. Boucher les tubes et la centrifugeuse dans une microcentrifugeuse à 1 000 x g. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 400 μL de MHO frais.
5. À la suspension, ajouter 20 μL d’AcM (p. ex., JIM5, un AcM pour rat avec une spécificité à l’homogalacturonane faiblement estérifié au méthyle ; la dilution finale est de 1/20 avec WHM). Faites tourbillonner le tube, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et placez-le sur un rotateur de laboratoire pendant 90 min. Pour de meilleurs résultats, faites tourbillonner le tube 2 fois pendant l’étape d’incubation de 90 minutes.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 1 000 x g pendant 1 min. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de MHO frais. Boucher le tube et vortex la suspension de la cellule pendant 10 s.
7. Répétez l’étape 2.6 2 fois. Après centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 400 μL de WHM et 8 μL d’anti-rat de chèvre TRITC ou FITC (dilué 1/75 avec WHM). Vortex, enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et placez-le sur un rotateur de laboratoire pendant 90 min.
8. Répétez les étapes 2.6 et 2.7. Remettez la pastille en suspension dans 100 μL de milieu de croissance, bouchez le tube et enveloppez-le dans du papier d’aluminium jusqu’au moment de l’image.
   REMARQUE : L’incubation des cellules dans le WHM contenant un agent bloquant comme le lait instantané No Fat Carnation (1 %) ou l’albumine sérique bovine (1 %) avant l’incubation dans les mAbs peut également être utilisée, mais d’après notre expérience, cela ne fait rien pour étiqueter la qualité ou l’intensité. Le pénium n’étend pas sa paroi cellulaire et ne produit pas de grandes quantités d’EPS dans l’obscurité. L’anticorps marqué reste intact pendant au moins 3 à 4 jours. Ainsi, l’imagerie n’a pas besoin d’être effectuée immédiatement. D’autres anticorps monoclonaux peuvent être appliqués ici, mais les concentrations devront être testées. Pour les études de dépistage chimique et physique, on peut étiqueter plusieurs mL de suspension cellulaire, conservés à l’obscurité pendant plusieurs jours et utilisés dans les études sur microplaques. Les cellules peuvent également être marquées avec l’anticorps primaire uniquement avant le traitement, suivi de l’anticorps secondaire plus tard.

3. Mesure de la paroi cellulaire et des taux d’expansion cellulaire au fil du temps

1. Prendre 1 mL de cellules marquées avec JIM5-TRITC et placer 1 mL de WHM dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifugez à 1 000 x g pendant 1 min et jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 250 μL de WHM et de vortex pour mélanger les cellules.
2. Dans chaque puits d’une boîte de Pétri à 12 compartiments, ajoutez 1 mL de MHO. À ce moment, des inhibiteurs et des régulateurs de croissance spécifiques peuvent être ajoutés à chaque puits. Dans cet article, nous démontrons les effets de l’augmentation des niveaux de calcium pendant l’incubation.
3. Prélever 30 μL de suspension cellulaire marquée (étape 1) et les ajouter à chaque puits de la microplaque. Agitez doucement l’assiette pour mélanger. Sceller avec un film transparent.
4. Cultivez comme ci-dessus (étape 1.1) pendant 24 h, 48 h ou 72 h. À des moments précis, retirer 250 mL de suspension cellulaire de chaque puits et la placer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 μL.
5. Centrifugeuse à 1 000 x g pendant 1 min. Retirez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 50 μL de milieu de croissance et vortex.
6. Placez une goutte de 15 μL de la suspension cellulaire sur une lame de verre et recouvrez d’une lamelle de recouvrement 22 x 22 (épaisseur 1,5). Observez les cellules avec un microscope à fluorescence à l’aide d’un filtre TRITC à 10x -20x.
7. Capturez des images d’au moins 50 à 100 cellules. Pour chaque cellule, mesurez et enregistrez la longueur totale de la cellule et la longueur de la zone sombre (c’est-à-dire la nouvelle paroi produite pendant l’incubation après l’étiquetage).
8. Déterminez le pourcentage moyen de nouvelles parois cellulaires dans la culture. Répéter l’opération pour les cellules prélevées après 48 h et 72 h afin d’obtenir des informations sur l’expansion de la paroi cellulaire au fil du temps.
   REMARQUE : Les étapes 3.5 à 3.8 produisent une suspension cellulaire dense qui permet d’imager de nombreuses cellules dans un seul champ de vision. Cela rend la mesure manuelle beaucoup plus pratique. De nombreux logiciels de caméra permettent une mesure pratique et/ou automatique des dimensions des cellules qui peuvent être utilisées avec cette algue. On peut également collecter les cellules et les marquer comme ci-dessus avec JIM5, mais en les remplaçant par FITC anti-rat comme anticorps secondaire. À l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (CLSM), on peut imager des cellules avec les filtres FITC et TRITC. Les signaux fluorescents peuvent ensuite être attribués à différentes pseudo-couleurs. Cela permet également de distinguer la structure de la nouvelle paroi cellulaire produite lors de différents traitements (marquée avec JIM5-FITC) par rapport aux parois cellulaires pré-marquées (marquées avec JIM5-TRITC).

4. Imagerie en accéléré de l’expansion de la paroi cellulaire

1. Étiquetez la paroi cellulaire avec JIM5-TRITC comme décrit ci-dessus (étapes 2.1-2.8). Diluez les cellules 10x dans WHM et ajoutez une goutte de 50 μL de cellules sur une lamelle ou une boîte de Pétri à fond de verre.
2. Laissez les cellules adhérer au verre pendant 2 minutes dans l’obscurité. Rincez délicatement les cellules qui n’ont pas collé au verre avec 1 mL de WHM. À l’aide d’une micropipette, ajoutez délicatement le WHM goutte à goutte dans le verre.
3. Ajoutez 30 μL de WHM sur les cellules fixées au verre. Ajouter 30 μL d’agarose chaude à 4 % sur la gouttelette de l’agarose/cellules. Laissez l’agarose refroidir à température ambiante et se solidifier.
4. Pour les échantillons dans une boîte de Pétri, ajoutez suffisamment de WHM pour couvrir complètement les cellules incluses dans l’agarose. Pour les cellules sur une lamelle, inversez la lamelle et placez-la doucement sur une lame de dépression remplie de WHM.
5. Montez les cellules sur un microscope fluorescent. Un éclairage externe (lampe) peut être installé, ou la lumière du microscope lui-même peut être utilisée pour fournir de l’énergie pour la croissance et le mouvement des cellules. Sur un microscope Olympus Ix83 ou Ix63, une puissance de 5-6 V pour la lampe trans fonctionne bien. Cela peut nécessiter des essais et des erreurs pour votre système.
6. Image toutes les 10 à 30 minutes à l’aide du jeu de filtres TRITC pour le suivi de l’expansion de la paroi cellulaire. Ajouter des produits chimiques/enzymes au MHO utilisé à l’étape 3.8, le cas échéant.

5. Observation de la production de substances polymères extracellulaires (EPS)

1. Préparation des cellules : Obtenez 5 mL de cellules à partir de cultures âgées de 10 à 14 jours et lavez-les comme aux étapes 1 à 4 ci-dessus.
2. Préparation des billes fluorescentes : Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, ajouter 1 goutte (environ 100 μL) de billes fluorescentes de 0,75 μm (Polysphere). Ajouter 1 mL de WHM dans le tube et agiter vigoureusement pour remettre les billes en suspension. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant. Ajouter 1 mL de WHM à la pastille et agiter. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 3 min. Remettre la pastille en suspension dans 500 μL de WHM.
3. Préparation des puits : Ajouter 1 mL de milieu WHM dans les puits d’une plaque de 12 puits. Ajoutez des inhibiteurs ou des régulateurs de croissance à la concentration souhaitée et remuez doucement. Ajouter 10 μL de solution de billes et agiter doucement la plaque pour mélanger les billes. Ajoutez 10 μL de cellules lavées dans chaque puits et faites tourner doucement la plaque.
4. Cultivez la plaque de cellules comme ci-dessus (1.1). Après 24 h, placez délicatement la plaque (attention à ne pas mélanger) sur un microscope à fluorescence inversée équipé d’un filtre FITC. Les billes adhèrent à l’EPS et révèlent les motifs de libération de l’EPS. Photographiez les cellules à 4x, 10x ou 20x.

6. Imagerie en accéléré de la formation de la traînée EPS

1. Effectuez une imagerie time-lapse dans une plaque à 12 puits (étape 3.2), comme préparé ci-dessus, ou dans une boîte de Pétri individuelle. Suivez les étapes 1 à 4. Plutôt que de cultiver les cellules sous un éclairage fluorescent, les cellules peuvent être cultivées en étant montées sur un microscope à fluorescence inversée.
2. Imagez les cellules toutes les 5 à 10 minutes pour mieux capturer le mouvement des cellules. Les billes fluorescentes sont visibles à l’aide d’un ensemble de filtres FITC, mais pour les billes concentrées, utilisez le canal à fond clair. Un éclairage externe (lampe) peut être installé, ou la lumière du microscope lui-même peut être utilisée pour fournir de l’énergie pour la croissance et le mouvement des cellules. Sur un microscope Olympus Ix83, une puissance de 5-6 V pour la lampe trans fonctionne bien. Cela peut nécessiter des essais et des erreurs pour votre système.

7. Analyse structurale corrélative de la paroi cellulaire avec microscopie électronique à balayage (MEB)

REMARQUE : Les caractéristiques modifiées de la paroi cellulaire observées dans des cellules vivantes marquées avec des anticorps spécifiques aux cellules peuvent être imagées pour des caractéristiques détaillées à l’aide du MEB. Cette approche corrélative permet d’obtenir des données ultrastructurales qui peuvent être comparées aux données de fluorescence.

1. Obtenir 1 mL d’une suspension cellulaire (témoin ou traitée expérimentalement) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifugeuse à 4 000 x g pendant 1 min.
2. Jetez le surnageant. Plongez le tube contenant la pastille dans de l’azote liquide ou, s’il n’est pas disponible, placez-le dans un congélateur à -80 °C. Les cellules congelées peuvent être conservées à -80 °C pendant plusieurs mois.
3. Au moment du traitement de la paroi cellulaire, sortez le tube du congélateur et laissez-le décongeler pendant 15 min. Remettre la pastille en suspension dans 20 μL de WHM et déposer une goutte de suspension à cellules denses sur une lamelle de 45 mm x 50 mm.
4. Placez une deuxième lamelle sur le dessus de la goutte pour créer un sandwich. Placez-le sur une table de laboratoire et appuyez continuellement sur le sandwich pour rompre les cellules (par exemple 30 s).
5. Séparez soigneusement les lamelles en verre et lavez les cellules rompues dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifugeuse à 500 x g pendant 1 min.
6. Videz le surnageant. La pastille doit être blanche ou légèrement verte. Si l’imagerie ultérieure montre qu’un nombre suffisant de cellules n’ont pas été rompues, répétez l’étape 3 avec la pastille ici.
7. Remettez en suspension la pastille qui contient les parois cellulaires en D-H₂O et répétez les étapes 7.4 et 7.5. Remettre la pastille en suspension dans 100 μL de D-H₂O et la placer dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
8. Munissez-vous d’un talon Cambridge (rayon de 6 mm ou 8 mm) et collez du ruban de carbone (EMS) à sa surface. Ensuite, placez des gouttes de 5 μL de la suspension de la paroi cellulaire en suspension (étape 7) sur le ruban de carbone. Observez le nombre de parois cellulaires à l’aide d’un microscope à dissection. Si la suspension est trop dense, diluez-la avec du D-H2O.
9. Placez le talon dans un récipient couvert et laissez-le sécher (2 h à toute la nuit). Vaporisez le talon pendant 50 s à l’aide d’une cible en palladium (d’autres cibles peuvent également être utilisées). Observez les cellules à 5 kV, taille spot, à 10 cm du détecteur d’électrons secondaire.
   REMARQUE : Diluer la suspension de la paroi cellulaire avant de déposer les gouttes sur le ruban de carbone limitera le dépôt des parois cellulaires les unes sur les autres.

Résultats

Le marquage de la paroi cellulaire de P. margaritaceum avec des anticorps monoluminaires anti-pectine (par exemple, JIM5) révèle un réseau de fibres et de projections complexes de calcium qui forment un motif régulier ou un réseau (Figure 1). La pectine se dépose au centre de la cellule ou isthme, où elle déplace la pectine plus ancienne vers les pôles (Figure 2). Le marquage avec un anticorps JIM7 différent d...

Discussion

P. margaritaceum est un organisme efficace pour élucider la dynamique du développement de la paroi cellulaire et de la sécrétion de MEC chez les plantes et les algues streptophytes. Les principales caractéristiques comprennent une habitude unicellulaire et une facilité d’entretien de la culture et de manipulation expérimentale, une paroi cellulaire primaire avec un réseau externe distinct de pectine et d’autres polymères, une facilité de marquage des cellules vivan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcent. Tubes	Fisher Scientific	01-549-740
12 welled microplate	Fisher Scientific	50-233-6077
22 x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	12-541-016
45x 50 cm coverslips	Brain Research	4550-1.5D
Agar	Sigma Aldrich	A9414
anti-rat FITC	Sigma Aldrich	F6258
anti-rat TRITC	Sigma Aldrich	T4280
calcium chloride	Sigma Aldrich	C4981
Cambbridge stubs	EMS	75183-65
Fluoview CLSM	Evident	Fluoview 1200
JIM5	Kerafast	ELD004
JIM7	Kerafast	ELD005
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-675
Micropipetors	BioRad	1660499EDU
Penium margaritaceum	Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae at Göttingen University	2640
Polysphere kit	Polysciences	18336
SEM	ThermoFisher	Quattro SEM
sputter coater	EMS	Q150V
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-414