페니움 마가리타세움(Penium margaritaceum)에 대한 실험적 스크리닝 프로토콜, 면역세포화학 및 현미경 기반 이미징 기법

요약

이 보고서는 단세포 연쇄상구균 조류인 Penium margaritaceum을 배양하고 실험적으로 조작하는 데 사용되는 기본 방법을 설명합니다. 또한 단클론 항체 및 기타 형광 프로브를 사용한 라이브 셀 라벨링 및 주사 전자 현미경을 포함한 현미경 기반 이미징의 기본 프로토콜을 제공합니다.

초록

세포벽은 식물 세포가 발달하는 동안, 그리고 환경적 비생물적 및 생물학적 스트레스 요인에 반응할 때 신호 수신/전달의 첫 번째 구성 요소입니다. 세포는 세포벽의 무결성을 지속적으로 모니터링하고 스트레스에 대한 반응으로 세포벽을 조절합니다. 세포벽에서 발생하는 특정 구조적 및 생화학적 조절을 밝히는 것은 특히 다세포 식물과 그 기관/조직을 사용할 때 어려운 작업입니다. 이는 복잡한 다세포 네트워크의 일부인 개별 세포에서 분해될 수 있는 것에 대한 한계 때문입니다. 단세포 연쇄상사식물 조류인 Penium margaritaceum은 최근 펙틴 역학, 세포벽 기반 표현형 가소성 및 조류 세포 생물학의 여러 측면에 대한 조사에 사용되었습니다. 단순한 표현형, 육상 식물 세포벽과 현저히 유사한 많은 구성 요소를 가진 뚜렷한 세포벽, 면역세포화학 및 실험 연구의 용이성으로 인해 식물 세포벽 생물학에서 강력한 모델 유기체가 되었습니다. 이 연구의 목표는 적용된 스트레스 요인의 배양, 실험적 조작 및 스크리닝을 위한 기본 기술을 제공하는 것입니다. 면역세포화학, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 이미징 및 세포벽 구조의 주사 전자 현미경 이미징을 위한 스크리닝 프로토콜. 마찬가지로, 설명된 기술의 다수는 광범위한 다른 세포 및 분자 연구를 위해 수정될 수 있습니다.

서문

식물의 세포벽은 식물 세포의 수명에 여러 역할을 하는 복잡한 고분자 네트워크입니다¹. 세포벽의 무결성은 발달 과정과 환경 스트레스에 대한 반응으로 세포에 의해 지속적으로 모니터링되며, 그에 따라 화학적 및 구조를 조절합니다. Penium margaritaceum 은 최근 연쇄상구균 조류(Streptophyta, 육상 식물과 가장 밀접한 관련이 있고 조상이 되는 녹조류 그룹²)에 대한 연구에 사용된 단세포 녹조류입니다.

지난 20년 동안 P. margaritaceum은 세포벽과 세포외 기질 역학, 내막계 활동, 세포 모양 발현 및 식물 진화에 대한 조사에서 중요한 유기체였습니다 3,4,5,6,7,8,9,10,11 . 이 연구의 목표는 식물 세포벽 연구자들에게 P. margaritaceum을 배양하고, 마이크로플레이트 기반 기술을 사용하여 실험적으로 조작하고, 생체 세포 면역세포화학적 표지 및 광 및 전자 현미경 기술을 사용한 이미징을 사용하여 세포벽 구조를 모니터링하는 기본적인 방법을 제공하는 것입니다. P. margaritaceum은 육상 식물의 1차 세포벽과 세포벽 생화학에서 많은 유사점을 가지고 있습니다. 우리는 이 조류의 고유한 단세포 표현형을 활용하고 다세포 식물에서 종종 모니터링하기 어려운 세포벽 역학을 연구하는 빠른 수단을 제공하는 여러 프로토콜을 고안했습니다. 이러한 기술은 상세한 세포벽 역학, 특히 펙틴을 다루는 세포벽 역학을 규명하고자 하는 식물 세포벽 생물학자에게 도움이 될 것이며, 식물 및 연쇄상 식물식물 조류 세포 생물학을 다루는 연구의 출발점 역할을 할 것입니다.

프로토콜

참고 : Penium margaritaceum 은 SAG Göttingen University의 Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae에서 얻습니다. 균주 #2640.

1. 문화 유지

1. 토양 수분 추출물(즉, 배지 L당 40mL)을 보충할 수도 있는 액체 Woods Hole 배지(WH¹²)에서 조류를 유지합니다. 16 시간 : 8 시간 빛으로 20-25 ° C에서 배양을 유지하십시오 : 3.5 klux (74 μmol 광자 / m² / s)의 시원한 백색 형광등으로 어두운 주기.
2. 매주 하위 배양을 준비하고 10-14일이 되었을 때 세포 배양을 사용하십시오. 페늄 배양은 6개월 동안 생존할 수 있으며 이 기간 동안 하위 배양을 시작하는 데 사용할 수 있습니다. 조류는 또한 1 % -2 % 한천 응고 WHM에서 자랄 것입니다.
3. 일상적인 세포 주기 동기화를 위해 10-14일 된 배양의 세포를 20-25°C에서 2-6주 동안 어두운 곳에 두십시오. 이 시간이 지나면 신선한 WHM(아래 참조)으로 세포를 세척하고 위에서 설명한 대로 배양합니다.

2. 세포벽을 단클론 항체로 라벨링

참고: P. margaritaceum 은 육상 식물 1차 세포벽에서 발견되는 것과 동일한 성분을 많이 가진 1차 세포벽으로 덮여 있습니다¹¹. 육상 식물 세포벽 항원결정기에 대해 제기된 많은 단클론 항체(mAb)는 P. margaritaceum 세포벽의 구성 요소를 인식합니다. 이러한 항체의 공급원으로는 조지아 대학의 복합 탄수화물 연구 센터(ccrc@uga.edu) 또는 케라패스트(kerafast.com)가 있습니다. 세포벽 에피토프(cell wall epitope) 및 형광단 접합 2차 항체(예: FITC, TRITC)에 특이적인 1차 mAb로 살아 있는 세포의 세포벽 라벨링에 따라 세포 또는 세포벽 증착의 건강에 영향을 주지 않고 세포를 배양에 다시 배치할 수 있습니다. 세포벽의 형광 표지는 무기한 유지되며, 새로 분비된 세포벽은 세포 팽창 속도를 측정하기 위해 측정하거나 mAbs 또는 기타 프로브로 다시 표지할 수 있는 어둡은(즉, 표지되지 않은) 영역으로 나타납니다.

1. 활발하게 성장하는 액체 세포 배양액(10-14일)의 5mL를 제거하고 15mL 플라스틱 원심분리 튜브에 넣습니다. 탁상용 원심분리기에서 1,000 x g 으로 1분 동안 원심분리기.
2. 상등액을 붓고 버립니다. 펠릿을 5mL의 새 WHM에 재현탁합니다. 캡을 단단히 놓고 튜브를 10초 동안 세게 흔들어 펠릿을 다시 현탁시키고 세포벽 표면에서 세포 외 고분자 물질 또는 EPS를 제거합니다.
3. 1,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기 2.2단계를 반복하고 원심분리를 합니다. 1mL의 새로운 WHM에 펠릿을 재현탁하고 세포 현탁액의 200μL 분취액을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
4. 튜브와 원심분리기를 1,000 x g의 마이크로 원심분리기에 끼웁니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 400μL의 새로운 WHM에 재현탁합니다.
5. 현탁액에 20μL의 mAb를 추가합니다(예: JIM5, 낮은 메틸 에스테르화 호모갈락투로난에 특이성을 가진 랫드 mAb, WHM의 경우 최종 희석액은 1/20임). 튜브를 소용돌이치고 알루미늄 호일로 싸서 90분 동안 실험실 회전기에 놓습니다. 최상의 결과를 얻으려면 90분 배양 단계 동안 튜브를 2회 볼텍스합니다.
6. 1,000 x g 에서 1분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 500μL의 새로운 WHM에 재현탁합니다. 튜브에 뚜껑을 씌우고 10초 동안 세포 현탁액을 소용돌이칩니다.
7. 2.6 2x 단계를 반복합니다. 원심분리 후 펠릿을 400μL의 WHM과 8μL의 염소 anti-rat TRITC 또는 FITC(WHM으로 1/75 희석)에 재현탁합니다. Vortex, 튜브를 알루미늄 호일로 싸서 90분 동안 실험실 회전기에 놓습니다.
8. 2.6단계와 2.7단계를 반복합니다. 펠릿을 100μL의 성장 배지에 재현탁시키고, 튜브를 덮고, 이미징할 준비가 될 때까지 알루미늄 호일로 감쌉니다.
   참고 : mAbs에서 배양하기 전에 No Fat Carnation Instant milk (1 %) 또는 소 혈청 알부민 (1 %)과 같은 차단제를 포함하는 WHM의 세포를 배양하는 것도 사용할 수 있지만 우리의 경험상 품질이나 강도를 표시하는 데 아무런 영향을 미치지 않습니다. 페늄 은 어둠 속에서 세포벽을 확장하거나 많은 양의 EPS를 생성하지 않습니다. 표지된 항체는 최소 3-4일 동안 손상되지 않은 상태로 유지됩니다. 따라서 이미징을 즉시 수행할 필요가 없습니다. 여기에 다른 mAb를 적용할 수 있지만 농도를 테스트해야 합니다. 화학적 및 물리적 스크리닝 연구의 경우, 몇 mL의 세포 현탁액을 라벨링하여 며칠 동안 어두운 곳에 보관하고 마이크로플레이트 연구에 사용할 수 있습니다. 또한 세포는 치료 전에만 1차 항체로 표지할 수 있으며, 나중에 2차 항체로 표지할 수 있습니다.

3. 시간 경과에 따른 세포벽 및 세포 팽창률 측정

1. JIM5-TRITC로 표지된 세포 1mL를 채취하여 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 WHM 1mL를 넣습니다. 1,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 250μL의 WHM과 와류에 재현탁시켜 세포를 혼합합니다.
2. 12웰 페트리 접시의 각 웰에 1mL의 WHM을 추가합니다. 이때, 특정 억제제 및 성장 조절제가 각 웰에 첨가될 수 있다. 이 논문에서는 배양 중 칼슘 수치 증가의 효과를 입증합니다.
3. 표지된 세포 현탁액 30μL를 취하고(1단계) 마이크로플레이트의 각 웰에 추가합니다. 접시를 부드럽게 휘젓어 섞습니다. 투명 필름으로 밀봉하십시오.
4. 위와 같이(1.1단계) 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 배양합니다. 지정된 시간에 각 웰에서 250mL의 세포 현탁액을 제거하고 1.5μL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
5. 1,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기 상층액을 제거합니다. 펠릿을 50μL의 성장 배지 및 와류에 재현탁합니다.
6. 세포 현탁액을 15μL 떨어뜨려 유리 슬라이드에 놓고 22 x 22 커버슬립(두께 1.5)으로 덮습니다. 10x -20x에서 TRITC 필터를 사용하여 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다.
7. 최소 50-100개의 세포에 대한 이미지를 캡처합니다. 각 세포에 대해 전체 세포 길이와 어두운 영역(즉, 라벨링 후 배양 중에 생성된 새로운 벽)의 길이를 측정하고 기록합니다.
8. 배양에서 새로운 세포벽의 평균 %를 측정합니다. 48시간 및 72시간 후에 수집된 세포에 대해 반복하여 시간 경과에 따른 세포벽 확장에 대한 정보를 얻습니다.
   참고: 3.5-3.8단계는 하나의 시야에서 많은 세포를 이미징할 수 있는 조밀한 세포 현탁액을 생성합니다. 따라서 수동 측정이 훨씬 더 편리해집니다. 많은 카메라 소프트웨어 프로그램은 이 조류와 함께 사용할 수 있는 세포 치수의 편리성 및/또는 자동 측정을 제공합니다. 또한 세포를 채취하여 위와 같이 JIM5로 표지할 수 있지만 2차 항체로 anti-rat FITC를 대체할 수 있습니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 FITC 및 TRITC 필터로 세포를 이미지화할 수 있습니다. 그런 다음 형광 신호를 다른 의사 색에 할당할 수 있습니다. 이를 통해 다양한 처리 중에 생성된 새로운 세포벽의 구조(JIM5-FITC 표지)와 사전 표지 세포벽(JIM5-TRITC로 표지)을 구별할 수 있습니다.

4. 세포벽 확장의 타임랩스 이미징

1. 위에서 설명한 대로 세포벽에 JIM5-TRITC를 표시합니다(단계 2.1-2.8). WHM에서 세포를 10배 희석하고 커버슬립 또는 유리 바닥 페트리 접시에 세포 50μL 방울을 추가합니다.
2. 세포가 어둠 속에서 2분 동안 유리에 부착되도록 합니다. 유리에 달라붙지 않은 세포를 1mL의 WHM으로 부드럽게 헹굽니다. 마이크로 피펫을 사용하여 WHM을 유리에 조심스럽게 떨어 뜨립니다.
3. 유리에 부착된 세포 위에 30μL의 WHM을 추가합니다. WHM/세포 방울 위에 따뜻한 4% 아가로스/WHM 30μL를 추가합니다. 아가로스를 실온으로 식히고 응고시킵니다.
4. 페트리 접시에 담긴 샘플의 경우, 아가로스 포집 세포를 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 WHM을 추가합니다. 커버슬립에 있는 세포의 경우 커버슬립을 뒤집어 WHM으로 채워진 함몰 슬라이드 위에 부드럽게 놓습니다.
5. 형광 현미경에 세포를 장착합니다. 외부 조명(램프)을 설정하거나 현미경 자체의 빛을 사용하여 세포 성장과 이동에 필요한 에너지를 제공할 수 있습니다. Olympus Ix83 또는 Ix63 현미경에서는 트랜스 램프의 5-6V 전력이 잘 작동합니다. 이를 위해서는 시스템에 대한 시행 착오가 필요할 수 있습니다.
6. 세포벽 확장을 추적하기 위해 TRITC 필터 세트를 사용하여 10-30분마다 이미지화합니다. 3.8단계에서 사용된 WHM에 화학 물질/효소를 추가합니다(있는 경우).

5. 세포외 고분자 물질(EPS) 생산 관찰

1. 세포 준비: 10-14일 된 배양액에서 5mL 세포를 얻고 위의 1-4단계와 같이 세척합니다.
2. 형광 비드 준비: 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 0.75μm 형광 비드(Polysphere) 1방울(약 100μL)을 추가합니다. WHM 1mL를 튜브에 넣고 세게 흔들어 비드를 다시 현탁시킵니다. 10,000 x g 에서 3분 동안 원심분리기 상층액을 제거합니다. 펠릿에 WHM 1mL를 넣고 흔듭니다. 10,000 x g 에서 3분 동안 원심분리기 펠릿을 500μL의 WHM에 재현탁합니다.
3. 웰 준비: 12웰 플레이트의 웰에 1mL의 WHM 배지를 추가합니다. 억제제 또는 성장 조절제를 원하는 농도에 추가하고 부드럽게 휘젓습니다. 비드 용액 10μL를 추가하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 비드를 혼합합니다. 세척된 세포 10μL를 각 웰에 넣고 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다.
4. 위와 같이 세포 플레이트를 배양합니다(1.1). 24시간 후, FITC 필터가 장착된 도립 형광 현미경에 플레이트(섞이지 않도록 주의)를 부드럽게 놓습니다. 구슬은 EPS에 부착되어 EPS 방출 패턴을 나타냅니다. 4x, 10x 또는 20x로 셀을 촬영합니다.

6. EPS 트레일 형성의 타임랩스 이미징

1. 위에서 준비한 대로 12웰 플레이트(3.2단계) 또는 개별 페트리 접시에서 타임 랩스 이미징을 수행합니다. 1-4단계를 수행합니다. 형광등 아래에서 세포를 배양하는 대신, 도립 형광 현미경에 장착된 상태에서 세포를 성장시킬 수 있습니다.
2. 세포의 움직임을 가장 잘 포착하기 위해 5-10분마다 세포를 이미지화합니다. 형광 비드는 FITC 필터 세트를 사용하여 볼 수 있지만 농축 비드의 경우 명시야 채널을 사용합니다. 외부 조명(램프)을 설정하거나 현미경 자체의 빛을 사용하여 세포 성장과 이동에 필요한 에너지를 제공할 수 있습니다. Olympus Ix83 현미경에서는 트랜스 램프의 5-6V 전력이 잘 작동합니다. 이를 위해서는 시스템에 대한 시행 착오가 필요할 수 있습니다.

7. 주사 전자 현미경(SEM)을 사용한 세포벽의 상관 구조 분석

참고: 세포 특이적 항체로 표지된 살아있는 세포에서 관찰된 세포벽의 변형된 특징은 SEM을 사용하여 자세한 특징을 위해 이미지화할 수 있습니다. 이 상관 관계 접근 방식을 통해 형광 데이터와 비교할 수 있는 초구조 데이터를 얻을 수 있습니다.

1. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 1mL의 세포 현탁액(대조군 또는 실험적 처리)을 얻습니다. 4,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기
2. 상등액을 버리십시오. 펠릿이 들어 있는 튜브를 액체 질소에 넣거나 사용할 수 없는 경우 -80°C 냉동고에 넣습니다. 냉동 세포는 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
3. 세포벽 처리 시 냉동실에서 튜브를 제거하고 15분 동안 해동합니다. 펠릿을 20μL의 WHM에 재현탁하고 밀도가 높은 세포 현탁액 한 방울을 45mm x 50mm 커버슬립에 떨어뜨립니다.
4. 드롭 위에 두 번째 커버슬립을 올려 샌드위치를 만듭니다. 실험실 테이블에 놓고 샌드위치를 계속 눌러 세포를 파열시킵니다(예: 30초).
5. 유리 커버슬립을 조심스럽게 분리하고 파열된 세포를 15mL 원심분리 튜브로 세척합니다. 500 x g 에서 1분 동안 원심분리기
6. 상등액을 붓습니다. 펠릿은 흰색 또는 약간 녹색이어야 합니다. 후속 영상에서 충분한 수의 세포가 파열되지 않은 것으로 나타나면 여기에서 펠릿으로 3단계를 반복합니다.
7. 세포벽이 포함된 펠릿을_D-H2O에 재현탁하고 7.4단계와 7.5단계를 반복합니다. 펠릿을 100μL의 D-H₂O에 재현탁시키고 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
8. 캠브리지 스터브(반경 6mm 또는 8mm)를 구하고 표면에 탄소 테이프(EMS)를 부착합니다. 다음으로, 재현탁된 세포벽 현탁액(7단계)의 5μL 방울을 탄소 테이프에 놓습니다. 해부 현미경을 사용하여 세포벽의 수를 관찰합니다. 현탁액이 너무 조밀하면 D-H2O로 희석하십시오.
9. 스텁을 뚜껑이 있는 용기에 넣고 건조시킵니다(2시간에서 하룻밤). 스퍼터링은 팔라듐 타겟을 사용하여 50초 동안 스텁을 코팅합니다(다른 타겟도 사용할 수 있음). 2차 전자 검출기에서 10cm 떨어진 5kV, 스폿 크기에서 셀을 관찰합니다.
   참고: 탄소 테이프에 방울을 떨어뜨리기 전에 세포벽 현탁액을 희석하면 세포벽이 서로 증착되는 것을 제한할 수 있습니다.

결과

P. margaritaceum의 세포벽을 항펙틴 mAb(예: JIM5)로 표지하면 규칙적인 패턴 또는 격자를 형성하는 칼슘 복합 섬유와 돌기의 네트워크가 드러납니다(그림 1). 펙틴은 세포 중심 또는 지협에 침착되어 오래된 펙틴을 극 쪽으로 치환합니다(그림 2). 다른 펙틴 항체와 유사한 JIM7로 표지하면 지협의 좁은 띠에서 높은 메틸 에스테?...

토론

P. margaritaceum은 식물과 연쇄상 식물 조류의 세포벽 발달 및 ECM 분비의 역학을 설명하는 데 효과적인 유기체입니다. 주요 속성으로는 단세포 습관과 배양 유지 관리 및 실험 조작의 용이성, 뚜렷한 외부 펙틴 격자 및 기타 폴리머가 있는 1차 세포벽, 후속 개발 및/또는 실험 연구를 위해 적시에 추적할 수 있는 세포벽 지향 mAb를 사용한 살아있는 세포 라벨링의 용이성,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcent. Tubes	Fisher Scientific	01-549-740
12 welled microplate	Fisher Scientific	50-233-6077
22 x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	12-541-016
45x 50 cm coverslips	Brain Research	4550-1.5D
Agar	Sigma Aldrich	A9414
anti-rat FITC	Sigma Aldrich	F6258
anti-rat TRITC	Sigma Aldrich	T4280
calcium chloride	Sigma Aldrich	C4981
Cambbridge stubs	EMS	75183-65
Fluoview CLSM	Evident	Fluoview 1200
JIM5	Kerafast	ELD004
JIM7	Kerafast	ELD005
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-675
Micropipetors	BioRad	1660499EDU
Penium margaritaceum	Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae at Göttingen University	2640
Polysphere kit	Polysciences	18336
SEM	ThermoFisher	Quattro SEM
sputter coater	EMS	Q150V
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-414