امتصاص / تأين الليزر بمساعدة المصفوفة المضان مع قياس الطيف الكتلي للتأين الناجم عن الليزر للخلايا العصبية الفردية للفئران

Summary

يحدد هذا البروتوكول استخدام microMS لقياس الطيف الكتلي MALDI-2 أحادي الخلية الموجه بالفلورة ، مما يتيح التنميط الجزيئي المعزز للخلايا العصبية الأولية للفئران.

Abstract

تعد قياسات الخلية المفردة أمرا بالغ الأهمية لفهم عدم التجانس الكيميائي المكاني الغني للدماغ. قياس الطيف الكتلي بالليزر / التأين بمساعدة المصفوفة (MALDI) قادر على توصيف الجزيئات الداخلية في الخلايا الفردية الخالية من الملصقات وعالية الإنتاجية. توفر التطورات الحديثة في تطوير مطياف الكتلة MALDI مع ما بعد التأين الناجم عن الليزر (MALDI-2) حساسية محسنة بشكل كبير للكشف عن مجموعة متنوعة من الدهون والجزيئات الصغيرة الأخرى. ومع ذلك ، فإن تصوير التصلب العصبي المتعدد للعينات الكبيرة باستخدام MALDI-2 بدقة خلوية بطيء للغاية بالنسبة لمعظم التطبيقات. في هذا البروتوكول ، يتم عزل الخلايا الأولية وتشتيتها على شرائح موصلة. يتم تحديد مواقع الخلايا النسبية عن طريق الفحص المجهري الفلوري كامل الشريحة ، متبوعا بتسجيل مشترك دقيق لإحداثيات الفحص المجهري لإحداثيات المرحلة لمطياف الكتلة MALDI-2. يوفر تحليل MS المستهدف لمواقع الخلايا فقط قياسات عالية الإنتاجية وحيدة الخلية مع تغطية تحليلية عالية وحجم بيانات أقل مقارنة بتصوير MS للعينة بأكملها. نصف الخطوات الحاسمة اللازمة لإعداد الخلية الواحدة ، والتصوير الفلوري للشريحة الكاملة ، وتطبيق المصفوفة ، وقياس الطيف الكتلي MALDI-2.

Introduction

تعتبر الدهون والمستقلبات أساسية للوظيفة الخلوية وتعمل كمكونات أساسية للأغشية ومصادر الطاقة وجزيئات الإشارات^1،2. ومع ذلك ، يمكن أن يختلف تكوينها ووفرة اختلافها بشكل كبير بين الخلايا الفردية ، مما يعكس الاختلافات في أنواع الخلايا والحالات التنموية^{والوظيفية 3،4،5}. يعد تحليل هذه الاختلافات أمرا بالغ الأهمية لفهم التباين البيولوجي وتحديد مجموعات الخلايا الفرعية المتميزة. توفر تقنيات قياس الخلية المفردة ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، ملفات تعريف نسخ مفيدة خاصة بالخلية⁶. ومع ذلك ، فإن هذه القياسات على مستوى النسخ لا تعكس بشكل مباشر الكميات الخلوية الفعلية للدهون والمستقلبات ، حيث لا يرتبط التعبير الجيني دائما بالوفرة الفعلية لهذه التحليلات. لذلك ، هناك حاجة إلى طرق متخصصة للقياسات المباشرة للدهون والمستقلبات للتحليل الشامل للتركيب الكيميائي للخلايا المفردة وأعدادها.

يعد التصوير اللطيفي الكتلي (MSI) لامتصاص / تأين الليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) أداة مفضلة لرسم الخرائط المكانية الخالية من الملصقات للجزيئات الحيوية الداخلية في الموقع^7،8. عادة ، مع MALDI ، يتم استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية لاستئصال المواد من طبقة عينة رقيقة متبلورة مع مصفوفة عضوية ، وتشكيل عمود من الأيونات والجزيئات المحايدة. ثم يتم فصل الأيونات المتكونة بواسطة محلل MS واكتشافها داخل مطياف الكتلة. نظرا لتحديد المواقع الدقيقة لمراحل مطياف الكتلة الحديثة ، يمكن وضع الليزر لاستهداف مناطق عينة معينة أو تنقيطه عبر المناطق لإنشاء صور جزيئية بواسطة MSI. يمكن استخدام MSI بدقة مكانية خلوية أو تحت خلوية (< 10 ميكرومتر) ، والتي يتم تحقيقها باستخدام شعاع ليزر مركز وحركة مرحلية دقيقة ، للحصول على معلومات كيميائية حول الخلايا الفردية^9،10. ومع ذلك ، فإن قياسات MSI على هذا المقياس غير فعالة ، خاصة في حالة العينات ذات الكثافة الخلوية المستهدفة المنخفضة ، بسبب مقدار الوقت المستغرق في تصوير المناطق الفارغة بين الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن قابلية الكشف عن العديد من التحليلات محدودة بسبب الحجم الصغير الذي تم أخذ عينات منه. للتغلب على هذه التحديات ، قمنا بتطوير نهج MALDI MS الموجه بالصور لتحليل الخلية المفردة عالي^{الإنتاجية 11،12}. في هذا النهج ، يتم تحديد مواقع الخلايا المشتتة برمجيا من صور مضان الشريحة الكاملة واستخدامها لتوجيه مرحلة مطياف الكتلة إلى المواضع التي توجد فيها الخلايا الفردية ذات المعلمات المحددة (على سبيل المثال ، الحجم والشكل) ثم يتم تحليلها عن طريق التشعيع باستخدام ليزر MALDI. تم استخدام العمل السابق باستخدام هذا النهج المستهدف لتوصيف الدهون والببتيدات والجزيئات الحيوية الأخرى في مجموعات الخلايا غير المتجانسة^5،13.

نظرا للطبيعة المحدودة للكتلة للخلايا المفردة ، فإن عدد التحليلات المكتشفة في هذه العينات أقل بشكل عام من تلك التي لوحظت مباشرة من الأنسجة. لذلك ، لزيادة تغطية التحليل في تحليل MS أحادي الخلية ، تعد زيادة حساسية الكشف عن التحليل أمرا بالغ الأهمية. أحد الأساليب التي تم تطويرها مؤخرا والتي تساعد في التغلب على تحدي الكشف هذا هو MALDI مع الليزر بعد التأين (MALDI-2) ، والذي ثبت أنه يعزز الحساسية لمجموعة واسعة من التحليلات^{9،14،15،16}. نتيجة لذلك ، يولد MALDI-2 مجموعات بيانات أكثر شمولا من خلية واحدة ويوفر تغطية جزيئية أعمق في العينات المحدودة الكتلة ، مثل الخلايا المعزولة.

الهدف من هذه الطريقة هو الحصول على قياسات الدهون من آلاف الخلايا الفردية. تحقيقا لهذه الغاية ، نصف سير العمل الذي يتيح قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية MALDI-2 عالي الإنتاجية ويمكن تمديده بشكل عام إلى أي نهج قياس الطيف الكتلي القائم على المسبار مع التحكم الدقيق في المرحلة¹⁷. في سير العمل هذا ، يتم تشريح الأنسجة من منطقة (مناطق) الدماغ ذات الأهمية ، ويتم الحصول على الخلايا الفردية من الأنسجة بعد إجراء تفكك غراء. ثم يتم تمييز الخلايا ببقعة نووية ويتم تشتيتها على شرائح زجاجية موصلة محفورة بعلامات إيمانية ، حيث يسمح لها بالالتصاق. بعد ذلك ، يتم التقاط صور الشريحة الكاملة باستخدام المجهر الفلوري. يتم ترسيب المصفوفة عن طريق التسامي ، مما يولد طبقة بلورية متجانسة قابلة للتكرار وإشارة عالية إلى ضوضاء لتحليل MS أحادي الخلية. باستخدام البرنامج مفتوح المصدر microMS¹¹ ، يتم تعيين الإحداثيات النسبية لمواقع الخلايا من صورة الفحص المجهري ومحاذاتها مع إحداثيات مرحلة مطياف الكتلة عن طريق تسجيل مجموعة النقاط باستخدام علامات إمانية محفورة على الشرائح الزجاجية حيث تم إيداع الخلايا. أخيرا ، باستخدام هذه المعلومات ، يتم الحصول على أطياف MS الدقيقة والمستهدفة من كل خلية على حدة ، مما يسمح بتحديد الآلاف من الخلايا في تشغيل واحد (<1 ساعة) ^12،13.

Protocol

أجريت جميع التجارب على في هذه الدراسة وفقا لبروتوكول استخدام المعتمد من قبل لجنة إلينوي المؤسسية لرعاية واستخدامه (23228) مع الالتزام الصارم بالمعايير الوطنية ومعايير ARRIVE للمعاملة الأخلاقية للحيوانات ورعايتها.

1. تحضير المواد والحلول

1. تحضير محلول الملح المتوازن Gey المعدل (mGBSS) مع 1.5 ملي CaCl₂ ، 4.9 ملي كلوريد كلوريد ، 0.2 ملي كلوريد كلوريد_{2 PO4} ، 11 ملي ملي كلوريد₂ ، 0.3 ملي مللي كلوريد_{الصوديوم 4} ، 138 ملي كلوريد الصوديوم ، 27.7 ملي هيدروكسيد_{الصوديوم 3} ، 0.8 ملي سنوميوم₂HPO₄ ، و 25 ملي هيبس. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام 3 M هيدروكسيد الصوديوم. يوصى بتحضير 1 لتر من mGBSS وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
2. قم بإعداد محاقن سعة 50 مل عن طريق ملئها بمحلول mGBSS المحضر ووضعها على الثلج من أجل نضح القلب. تحضير 1 حقنة لكل فأر تشريح.
3. قم بإعداد حصص من محلول غراء باتباع بروتوكول نظام تفكك غراء ورثينجتون. يحتوي هذا النظام على أربع قوارير كما هو موضح أدناه ، مع عدم استخدام القارورة 4 لهذا البروتوكول:
   قارورة 1: محلول ملح إيرل المتوازن المعقم (EBSS) مع البيكربونات والفينول الأحمر
   قارورة 2: غراء مع L-cysteine و EDTA
   قارورة 3: ديوكسيربونوكلاز I (DNase)
   قارورة 4: مثبط البروتياز الإبيضي مع ألبومين مصل الأبقار
   1. أضف 5 مل من EBSS (قارورة 1) إلى قارورة غراء (قارورة 2) وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإذابة الغراء.
   2. أضف 500 ميكرولتر من EBSS (قارورة 1) في قارورة DNase (قارورة 3) واخلطها برفق. أضف 250 ميكرولتر من قارورة DNase المخففة (قارورة 3) في قارورة الغراء (القارورة 2). يحتوي هذا المستحضر على تركيز نهائي يبلغ 20 وحدة / مل من غراء ، و 0.005٪ DNase ، و 0.5 ملي مولار EDTA ، و 1 ملي مولار L-cysteine.
   3. قم بتجميد 250 ميكرولتر من محلول غراء المحضر هذا للتفكك اللاحق (يجعل ~ 20 حصة). استكمل هذا المحلول بالمضادات الحيوية التالية: 100 وحدة / مل بنسلين G ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين. يمكن تعديل هذا لتطبيق المستخدم.
4. قم بإعداد محلول أسيتات الأمونيوم 150 ملي مولار وتخزينه عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد محلول الجلسرين بنسبة 33٪ عن طريق تخفيف الجلسرين في محلول mGBSS المحضر.
5. قم بحفر الحسابات على شرائح الفحص المجهري المطلي بأكسيد القصدير الإنديوم (ITO) باستخدام قلم نقش مع كربيد التنجستن أو طرف الماس أو آلة نقش ليزر CO₂ . على الجانب الموصل من الشريحة الزجاجية ITO ، قم بحفر 20-40 علامة إيمانية على شكل X على طول محيط الشريحة لتمكين التسجيل المكاني عبر الأنظمة الأساسية (على سبيل المثال ، المجهر ومطياف الكتلة).
   ملاحظة: احرص على عدم الحفر في خط متصل واحد يحيط بالعينة أو مناطقها لأن هذا يعطل توصيل السطح بين المنطقة ومحول الشريحة الزجاجية.

2. تحضير الخلايا العصبية الأولية

ملاحظة: يتم تشريح أنسجة الحصين في الفئران ، وتفكيكها إلى خلايا فردية مع غراء ، وترسبها على شرائح زجاجية موصلة بكثافة منخفضة. يتيح عزل الخلايا بهذه الطريقة قياس طيف كتلة الخلية المفردة عالي الإنتاجية للدهون الداخلية.

1. قبل تشريح ، قم بإذابة جزء من محلول غراء المحضر وضعه في وعاء به أنبوب مدخل ومخرج يسمح لثاني أكسيد الكربون₂ بإزاحة الهواء داخل الحاوية. ضع هذا النظام في حمام مائي مضبوطة على 37 درجة مئوية واستمر في تدفق ثاني أكسيد الكربون₂ حتى يصبح المحلول هو الأس الهيدروجيني المناسب ، كما هو موضح في اللون ، باستخدام مخطط ألوان الأس الهيدروجيني المضمن في حزمة نظام تفكك غراء ورثينجتون. يتراوح الرقم الهيدروجيني المستهدف بين 7.2 و 7.4.
   ملاحظة: لا تضع ثاني أكسيد الكربون₂ في المحلول الأنزيمي ، لأن هذا سيؤدي إلى تمسخ DNase وفقدان النشاط البيولوجي. استخدم أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مع أنبوبين ملتصقين في الغطاء ، مما يسمح لثاني أكسيد الكربون₂ بملء الأنبوب من الأسفل والهروب من أنبوب المخرج العلوي.
2. القتل الرحيم للفئران (الفئران) وفقا لبروتوكولات IACUC باتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية والمحلية والفيدرالية. هنا ، يتم استخدام ذكور فئران Sprague-Dawley البالغة من العمر 2 إلى 3 أشهر والتضحية بها عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ .
3. قم بنشر الفئران عبر القلب بمحلول مثلج بارد (4 درجات مئوية) mGBSS لإزالة الدم من الأوعية الدموية وتبريد جسم بسرعة. يمكن العثور على أحد الأمثلة على هذا الإجراء في البروتوكول بواسطة We et ^al.18.
4. عزل الدماغ جراحيا عن الفئران ، مع التأكد من عدم إتلاف منطقة الدماغ ذات الاهتمام. توفر نظرة عامة منشورة سابقا على هذه العزل مزيدا من التفاصيل حول بعض الخطوات الفردية¹⁹.
5. استخدم مفرمة الأنسجة أو مكعب الأنسجة لقطع مقطع عرضي (~ 2 مم) من الدماغ لكشف المنطقة (الحصين أو القشرة أو المخطط) لأخذ العينات.
6. استخدم لكمة خزعة 2 مم لأخذ عينات من منطقة الدماغ ذات الاهتمام وإيداع قطعة الأنسجة في قارورة محلول غراء.
7. احتضان هذا النسيج ومحلول غراء عند 37 درجة مئوية تحت التحريك المستمر (على سبيل المثال ، بواسطة هزاز كهربائي) لمدة 30-90 دقيقة.
   ملاحظة: يجب تحسين مدة العلاج الأنزيمي بناء على منطقة الدماغ ، وسلالة ، والعمر ، وإخراج الخلية المطلوب (على سبيل المثال ، الخلايا العصبية والخلايا النجمية ذات الأطراف مقابل أقصى إنتاجية للخلايا بدون أطراف). بالنسبة لأنسجة الحصين في الفئران ، تكون 60-90 دقيقة نموذجية. قد تحافظ العلاجات الأقصر على بعض الأطراف ولكنها تترك العديد من الخلايا في مجموعات غير منفصلة ، في حين أن العلاجات الأطول يمكن أن تحسن المحصول ولكنها تزيد من تلف الخلايا ، مما يتطلب تقييما باستخدام فحوصات حية / ميتة (على سبيل المثال ، مجموعة البقاء / السمية الخلوية LIVE / DEAD). بالنسبة للدراسات المقارنة ، يجب أن تكون العلاجات متسقة عبر أنواع العينات.
8. ضع قارورة من الأنسجة والغراء على الثلج لتبريد وقمع النشاط الأنزيمي. قم بتقطيع الأنسجة باستخدام طرف ماصة مقطوع متصل بماصة حجم قابلة للتعديل P100 حتى يتم تفتيت معظم الأنسجة بصريا. لا تشكل فقاعات هواء أثناء التفكك لتجنب تلف الخلايا المفرط.
   ملاحظة: ينتج عن التجربة القوية إنتاجية عالية من الخلايا. ومع ذلك ، فإنهم لا يحتفظون بمعظم عملياتهم. يوفر التخلي اللطيف المزيد من العمليات على الخلايا ولكنه ينتج عنه المزيد من الخلايا غير المنفصلة. يمكن أيضا استخدام أطراف الماصات ذات الأحجام المختلفة والطرق الأخرى وتحسينها للحصول على نتائج تفكك مثالية²⁰.
9. الطرد المركزي للخلايا المنفصلة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحبيبات الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من mGBSS. أضف صبغة Hoechst 33342 النووية إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل.
10. الماصة 100-500 ميكرولتر من تعليق الخلية على شرائح زجاجية محفورة ITO والسماح لها بالجلوس لمدة 5 دقائق تقريبا أو أكثر للسماح للخلايا بالترسيب والالتصاق بالشريحة.
    1. يجب تحديد تخفيف تعليق الخلية تجريبيا. باستخدام المجهر البصري ، أضف قطرة من الخلايا إلى الشريحة لتحديد الكثافة الخشنة وتخفيفها من هناك للتأكد من وجود مسافة كافية بين الخلايا (أي أكبر بما فيه الكفاية من حجم شعاع MALDI). يمكن إجراء هذا التخفيف على الشريحة الأولى ، ومن ثم يمكن ضبط التخفيف حسب الضرورة للشرائح اللاحقة.
11. قم بسحب تعليق الخلية برفق من الشريحة باستخدام نظام تفريغ يحتوي على (يقع بالترتيب بدءا من خط التفريغ): 1) أنبوب مزود بمرشح HEPA غاز مدمج ، 2) أنبوب مثبت على قارورة ترشيح سعة 50 مل ، 3) أنبوب متصل بمدخل قارورة ترشيح ثان بطرف ماصة متصل (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر). في حالة تخزين الخلايا المطلية للاستخدام في المستقبل ، استبدل المعلق المستنشق بمحلول جلسرين بنسبة 33٪ لمدة 1-2 دقيقة وقم بإزالته.
    ملاحظة: ستضمن هذه الخطوة استقرار الخلية. يعد الاستغناء عن محلول الجلسرين من جانب واحد مع الشفط اللطيف من الجانب الآخر مثاليا للحفاظ على البنية الخلوية. راقب دائما بصريا جميع الخطوات الموضحة هنا باستخدام مجهر مقلوب أثناء تحضير العينة الأولى.
12. ضع 100-500 ميكرولتر من أسيتات الأمونيوم على المناطق المترسبة ، واتركها لمدة دقيقة واحدة تقريبا ، ثم استنشق لتنظيف الشرائح. كرر حسب الضرورة للتأكد من خلو الشرائح من أي ملح أو جلسرين.

3. الفحص المجهري

ملاحظة: لتحديد موقع الخلايا المترسبة ، يتم تصوير كل شريحة بواسطة المجهر الساطع / الفلور. تسمح قناة التألق بتحديد موقع الخلايا الملطخة ب Hoechst بدقة ، بينما يوفر التصوير الساطع معلومات مورفولوجية. أي مجهر قادر على الحصول على الصور المبلطة مناسب لهذه العملية.

1. إذا لم يتم القيام به مسبقا ، اشطف الشرائح ب 2-3 مل من أسيتات الأمونيوم 150 مل. هذه الخطوة ضرورية لإزالة بلورات الجلسرين والملح ، والتي يمكن أن تتداخل مع المراقبة المجهرية وتطبيق مصفوفة MALDI. ينزلق التجفيف تحت تيار لطيف من N₂ أو يترك ليجف في الهواء.
2. تحميل الشريحة في مرحلة المجهر. قم بتركيز المجهر باستخدام 10 نقاط دعم على الأقل موزعة بالتساوي عبر الشريحة.
3. باستخدام مرشحات مناسبة ل DAPI (الإثارة: 335-383 نانومتر ، الانبعاث: 420-470 نانومتر) والتصوير الساطع ، احصل على صورة مضان مبلطة بتكبير 5x-10x على الشريحة بأكملها ، مما يضمن التقاط العلامات الإيمانية (التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.5).
   ملاحظة: عادة ما يكون التكبير بمقدار 5x كافيا، خاصة عندما تحتاج العديد من الشرائح إلى التصوير. لحل التشكل الخلوي الدقيق ، يمكن استخدام أهداف 10x أو 20x على حساب وقت تصوير أطول بشكل تربيعي وزيادة أحجام الملفات.
4. قم بربط الصورة المبلطة باستخدام برنامج الفحص المجهري ، مثل ZEN (Zeiss). يعد الخياطة الدقيقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث ستنتشر أي أخطاء في هذه الخطوة إلى خطوة التسجيل النهائية ، مما يؤدي إلى استهداف غير دقيق. للتحقق، تأكد من عدم إزاحة المربعات المتجاورة رأسيا. بالإضافة إلى ذلك ، ضع في اعتبارك الحصول على صور متجانبة مع تداخل كبير في البلاط (20٪ -30٪).
5. قم بمعالجة وتصدير كل صورة كملف bigTIFF في برنامج الفحص المجهري. إذا كانت المنطقة المصورة صغيرة نسبيا وينتج عنها حجم صورة نهائي أقل من 2 غيغابايت، فاستخدم تنسيق ملف TIFF قياسي بدلا من ذلك.

4. تطبيق المصفوفة

ملاحظة: يعد تطبيق مصفوفة MALDI المتسق والمناسب أمرا بالغ الأهمية للحصول على بيانات عالية الجودة أحادية الخلية. أثناء استخدام التسامي باستخدام جهاز تجاري هنا ، يمكن أيضا إجراء تطبيق المصفوفة باستخدام بخاخ آلي¹² أو البخاخة²¹ أو جهاز التسامي محلي الصنع²². لقد وجدنا أن المستحضرات أحادية الخلية تتطلب مصفوفة أقل من أقسام الأنسجة الرقيقة المستخدمة عادة في تصوير قياس الطيف الكتلي. لتقليل تأثيرات الدفعات ، يوصى بتطبيق المصفوفة على جميع الشرائح قيد الدراسة خلال جلسة واحدة وإيداع الخلايا من مجموعات مختلفة (على سبيل المثال ، منطقة الدماغ أو العلاج مقابل التحكم) على نفس الشريحة كلما أمكن ذلك. يعد اختيار المصفوفة أمرا بالغ الأهمية لكل من سير العمل أحادي الخلية MALDI و MALDI-2 التقليدي. بالنسبة إلى MALDI أحادية الخلية ، تم استخدام DHB²³ و 9-AA²⁴ و CHCA²⁵ بنجاح. في MALDI-2 ، لاحظنا نحن وآخرون تحسنا كبيرا في الإشارة مع DHAP⁹ ، بينما تم أيضا تطبيق المصفوفات مثل NEDC¹⁶ و CHCA²⁶ بشكل فعال.

1. قم بإذابة 20 مجم من 2,5-ثنائي هيدروكسي أسيتوفينون (DHAP) في 1.5 مل من الأسيتون. ضع الشرائح في حامل غرفة التسامي وضعها في جهاز التسامي.
2. قم بسحب محلول المصفوفة المذاب على رقاقة السيراميك والسماح للأسيتون بالتبخر. أغلق غرفة التسامي لإغلاقها.
3. املأ غرفة التبريد بطين من الماء المثلج وضعه فوق الغرفة.
4. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية واسمح للنظام بالتوازن لمدة 5 دقائق. يجب أن يكون الضغط في النظام أقل من 40 ملي بار.
5. ابدأ التسامي عن طريق تسخين الغرفة إلى 200 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
6. قم بإزالة حمام الماء المثلج ، وقم بتحويل درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية ، ثم ضع غرفة التبريد فوق الغرفة. اترك النظام يسخن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتجنب التكثيف.
   ملاحظة: يمكن إفراغ الحاوية التي تحتوي على حمام الماء المثلج وتعبئتها بالماء الساخن لتكون بمثابة المشتت الحراري.
7. قم بتنفيس النظام ببطء ، وافتح الغرفة ، وقم بإزالة الشرائح.

5. خلية واحدة MALDI MS

ملاحظة: يتم الحصول على بيانات MS أحادية الخلية على جهاز MALDI-2 timsTOF (timsTOF flex) باستخدام حزمة microMS مفتوحة المصدر لاكتشاف الخلايا وتوجيه مطياف الكتلة. يتطلب ذلك ترجمة مواقع بكسل الصورة البصرية للخلايا المستهدفة إلى الإحداثيات الفيزيائية لمرحلة مطياف الكتلة.

1. افتح microMS وقم بالقضاء على صور الفحص المجهري bigTIFF باستخدام خيار Image Group ، حيث توجد قنوات brightfield و fluorescence.
2. باستخدام أداة خيارات الكائن الثنائي كبير الحجم، حدد المعلمات المثلى لتحديدها للخلايا المستهدفة. اضبط المعلمات التالية: الحد الأقصى والحد الأدنى لحجم الكائن الثنائي كبير الحجم لتحديد مدى صغر أو حجم الكائنات الثنائية كبيرة الحجم التي يجب العثور عليها. إعداد العتبة، الذي يحدد كيفية عتبة قناة التألق للكشف عن الكائن الثنائي كبير الحجم؛ والدائرية ، التي تحدد مدى دائرية الخلايا المحددة للنظر فيها. بالنسبة للبيانات المعروضة هنا ، استخدمنا قيم المعلمات التالية: الحد الأقصى للدائرية: لا شيء. الحد الأدنى للدائرية: 0.6 ؛ العتبة: 75; الحد الأدنى للحجم: 20 ؛ الحد الأقصى للحجم: لا شيء.
3. استخدم خيار البحث عن الكائن الثنائي كبير الحجم للبحث عن الكائنات الثنائية كبيرة الحجم والنافذة المنبثقة لحفظ قائمة الكائن الثنائي كبير الحجم تحت الاسم المطلوب.
4. استخدم أداة تصفية المسافة لتحديد مسافة محددة تحتاجها كل خلية لتكون بعيدة عن بعضها البعض (بالنسبة لهذه البيانات ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري 5x ، استخدمنا مرشح مسافة يبلغ 35 بكسل). هذا للتأكد من أن الخلايا بعيدة بما يكفي عن بعضها البعض لإجراء تحليل خلية واحدة. هذا الرقم بوحدات البكسل ، لذا تعرف على تحويل البكسل إلى ميكرومتر للمجهر لتحديد الرقم المثالي. استخدم حجم قطر مسبار الليزر بالإضافة إلى حوالي 20-30 ميكرومتر لحساب الأخطاء في التسجيل.
5. قم بتحميل الشرائح في الجهاز باستخدام محول الشريحة MTP II. ارجع إلى الكمبيوتر باستخدام microMS ، وباستخدام تطبيق سطح المكتب البعيد ، قم بالوصول إلى كمبيوتر مطياف الكتلة.
6. إذا كانت هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها استخدام الأداة ، فتحقق من موضع XY للأداة. للقيام بذلك ، انتقل إلى إعدادات الأدوات والأداة. ستعرض النافذة المنبثقة مجموعة من الإحداثيات مع موضعيها X و Y. حدد كل نقطة من هذه النقاط المحددة في هندسة محول الشرائح II على الجهاز وقم بتحديث مواضع X و Y في نافذة microMS.
7. باستخدام الكاميرا وعناصر التحكم في المسرح لمقياس طيف الكتلة ، انتقل إلى موقع يمكن التعرف عليه بسهولة على الشريحة وانسخ إحداثيات الأداة. في microMS ، ابحث عن الموقع المقابل في صورة المجهر ، وانقر بزر الماوس الأيمن على هذا الموضع ، واكتب الإحداثيات في موقع نص النافذة المنبثقة. قم بتقريب جميع الإحداثيات لأقرب عدد صحيح ، وافصل إحداثيات X و Y مع المسافة (على سبيل المثال ، 39595 -23232).
8. كرر الخطوة 5.7. لتسجيل ما لا يقل عن 12 علامة إيمانية عبر الشريحة بأكملها. بعد إضافة ثلاث نقاط تسجيل ، ستتحول إحدى الدوائر إلى اللون الأحمر ، مما يشير إلى أنها الموضع الأكثر انبعادا من التسجيل. إذا حدث ذلك، فاحذف نقطة التسجيل الحالية باستخدام shift + انقر بزر الماوس الأيمن وحاول مرة أخرى.
9. ضمن ملف، انتقل إلى حفظ ثم التسجيل لحفظ ملف التسجيل (.msreg).
10. مع عرض الكائنات الثنائية كبيرة الحجم على الشريحة، احفظ ملف موضع الأداة (.xeo) بالانتقال إلى ملف، ثم حفظ، ثم مواضع الأداة. باستخدام برنامج سطح المكتب البعيد ، انقل ملف .xeo هذا إلى كمبيوتر الأجهزة.
11. انسخ النص من ملف .xeo المخصص الذي تم إنشاؤه في ملف MTP Slide Adapter II .xeo على الأداة واحفظه. سيؤدي هذا إلى تحديث هذا الملف الهندسي بمواقع الخلايا.
12. انقر فوق علامة التبويب التنفيذ التلقائي وحدد جديد... لبدء التشغيل التلقائي. اسحب عبر منطقة العينة المعروضة لتحديد الخلايا، ثم انقر بزر الماوس الأيمن لإضافتها إلى قائمة التحليل. احفظ تشغيل التشغيل التلقائي وانقر فوق بدء التشغيل التلقائي لبدء الاستحواذ. يعتمد طول الجري على مجموعة متنوعة من العوامل ، بما في ذلك عدد الخلايا ولقطات الليزر وتردد الليزر ، ولكن بشكل عام ، يمكن تحليل ما يقرب من 5-10 خلايا في وضع MALDI (معدل تكرار الليزر 10 كيلو هرتز) ، ويمكن تحليل 1-5 خلايا في وضع MALDI-2 (معدل تكرار الليزر 1 كيلو هرتز) كل ثانية.

6. معالجة البيانات

ملاحظة: حزم البرامج التجارية الحالية ليست مناسبة تماما لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية عالية الإنتاجية. بينما يمكن تصور الأطياف الفردية ، فإن استخراج رؤى بيولوجية ذات مغزى يتطلب أدوات متخصصة. لمعالجة هذه المشكلة ، نقدم برنامجا متاحا مجانا يسهل تحليل بيانات MALDI-2 MS أحادية الخلية. يسهل سير العمل المحدث لدينا التحويل المباشر للبيانات أحادية الخلية إلى تنسيق imzML^{مفتوح المصدر 27} ، مما يسمح بالتوافق مع SCiLS MVS وبرامج البائعين الأخرى. لتحليل البيانات الأكثر تقدما ، يتضمن البرنامج النصي الكامل أيضا وظائف للتعليق التوضيحي للدهون والتجميع وأدوات التصور الأخرى التي تم تمكينها بواسطة Matplotlib (الإصدار 3.7.3). يتم تسهيل تحليل البيانات الأولية وقراءتها من خلال مكتبة pyTDFSDK ، وهي مجموعة من الوظائف المضمنة في سير عمل TIMSCONVERT²⁸.

1. قم بتهيئة مكتبة Python المخصصة SC_MALDI2_Analysis عن طريق نسخ الملف المتوفر في الملف التكميلي 1 إلى نفس مسار العمل مثل Jupyter Notebook ثم اضغط على Shift + Enter على لوحة المفاتيح في خلية التعليمات البرمجية الأولى. سيسمح لنا ذلك باستدعاء هذه الوظائف لاحقا واستخدامها لمعالجة البيانات.
2. انسخ المسار إلى البيانات التي تم جمعها (ملفات Bruker .d). نوصي بتسمية المجلدات والأسماء الخاصة بكل ملف بشكل وصفي حتى نتمكن من تحليل مسارات الملفات هذه لاحقا لإنشاء بيانات وصفية لكل عينة. قم بتشغيل استيراد ملفات Bruker .d واحفظها في خلية رمز القائمة. سيؤدي هذا إلى إخراج العدد الإجمالي لملفات .d التي تم تحميلها.
3. قم بتشغيل خلية التعليمات البرمجية بعنوان معالجة البيانات الأولية وحفظها في imzML. سيؤدي هذا إلى قراءة كل ملف Bruker .d المقدم ، وإجراء التقاط الذروة للبيانات ، ثم حفظ 20 صفحة في الدقيقة من البيانات حول كل ذروة إلى ملف .imzML مكتوب داخل ملف .d.
   1. للعثور على البيانات المحفوظة ، افتح موقع ملف .d الأول وسيتم حفظ imzML والبيانات الوصفية الأخرى في هذا المسار. في هذه المرحلة ، يمكن استيراد ملف imzML المحفوظ إلى برنامج المورد ، مثل SCiLS Lab MVS. لمزيد من تحليل البيانات المتقدمة، استمر في اتباع البرنامج النصي.
4. قم بتحميل بيانات imzML المحفوظة عن طريق تشغيل التحميل في خلية التعليمات البرمجية لملف imzML المحفوظة مسبقا. يؤدي هذا إلى تحميل البيانات المحفوظة في البيانات المتغيرة.
5. قم بتشغيل تجميع البيانات وحفظ خلية مصفوفة البيانات لتجميع جميع البيانات على طول محور m/z مشترك، وإزالة الميزات الموجودة بكثرة منخفضة (<0.1٪)، وإزالة القيم الأقل من الضوضاء (100 كثافة نسبية). تقوم هذه الوظيفة بعد ذلك بإعادة تجميع البيانات عن طريق حساب متوسط كل قيمة ذروة m / z داخل كل سلة. يتم حفظ مصفوفة البيانات الناتجة على أنها datacube_array ، ويتم حفظ الصناديق m / z المرتبطة بالمصفوفة على أنها valid_mz_bins ، ويتم حفظ عدد كل حاوية كعدد.
6. للتعليق على البيانات، قم بتشغيل تصدير ذروة الخلية للتعليق التوضيحي لخرائط LIPID . سيؤدي هذا إلى نسخ جميع قمم m / z داخل مصفوفة البيانات الخاصة بك إلى الحافظة الخاصة بك. الصق هذا في ملف نصي فارغ واحفظه لتحميله على خرائط LIPID.
7. افتح lipidmaps.org ، ثم حدد MS Data Bulk Search and Search LMSD للبحث عن أنواع الدهون ذات الصلة بيولوجيا. قم بتحميل قائمة الذروة عن طريق اختيار الملف النصي وحدد المقاربات المناسبة (على سبيل المثال ، [M + H] + و [M + Na] ⁺ و [M + K] ⁺). حدد تفاوت الكتلة المناسب لمطياف الكتلة الخاص بك (اخترنا +/- 0.01 م / ز) ، وحدد جميع فئات الدهون ذات الأهمية ، واضغط على بحث. قم بتنزيل ملف .tsv.
8. قم بتحميل بيانات تعريف الأطياف عن طريق تشغيل التحميل في مسارات الخلية المفردة لخلايا بيانات التعريف . قم بتغيير التعليمات البرمجية المنقسمة هنا بناء على هياكل مسار الملف.
9. المعالجة المسبقة للبيانات عن طريق تشغيل خلية المعالجة المسبقة للبيانات والتعليقات التوضيحية للدهون . سيستخدم هذا ملف lipidMAPS tsv للتعليق على مجموعة البيانات إلى خطأ 10 صفحات في المليون ، وإزالة دهون السلسلة الفردية من نتائج lipidMAPS ، وتطبيع البيانات المتبقية ، وإزالة الميزات أو الخلايا التي لا تتجاوز حدا محددا. سيؤدي هذا إلى حفظ مجموعة البيانات الجديدة المعالجة كبيانات2 وبيانات تعريف الأطياف المحدثة ك updated_cell_types.
10. يتم إجراء تحليل البيانات بواسطة Scanpy. قم بتشغيل UMAP و تحليل المجموعات لخلية الخلايا المفردة لتحديد البيانات ذات الأهمية (هنا اخترنا بيانات MALDI-2 و M2 فقط) ، وتوسيع نطاق مجموعة البيانات ، وتحميلها في كائن AnnData ضئيل لإجراء تحليلات سهلة.
    ملاحظة: هنا ، تم إجراء تجميع Leiden وتقليل الأبعاد (UMAP) على مجموعة البيانات ، وتم تصور كل من فئات البيانات الأصلية والمجموعات الموجودة على UMAP ، وتم تلخيص بعض الميزات الأكثر دلالة إحصائيا بين المجموعات باستخدام وظيفة rank_genes_groups_dotplot من scanpy.

النتائج

تظهر نظرة عامة على سير العمل ل MALDI-2 MS أحادية الخلية الموجهة بالفلورة في الشكل 1. أولا ، يتم فصل الأنسجة التي تم تشريحها من مناطق الدماغ المستهدفة (الشكل 1 أ) إلى خلايا مفردة وترسبها على شرائح الفحص المجهري الموصلة المطلية ب ITO (الش...

Discussion

يعد MALDI MS أحادي الخلية عالي الإنتاجية والموجه بالصور أداة قيمة لفهم عدم التجانس الكيميائي على نطاق خلية واحدة. توفر إضافة ما بعد التأين الناجم عن الليزر (MALDI-2) تغطية تحليلية أعمق ، وهو أمر بالغ الأهمية للعينات محدودة الكتلة والحجم مثل خلايا الثدييات المعزولة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',5'-dihydroxyacetophenone	Sigma Aldrich	D107603	DHAP, 97% purity
Ammonium acetate	Sigma Aldrich	238074	ACS reagent, ≥97%
Axio M2 Imager	Zeiss	N/A	N/A
Biopsy punch, 2 mm	Fisher Scientific	12-460-399	integra miltex standard biopsy punch, 2mm
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901	anhydrous, powder ≥97%
Eppendorf Centrifuge	Sigma Aldrich	EP5405000441	centrifuge 5425 with rotor FA-24x2
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1272	liquid, BioReagent
Glass etching pen	Sigma Aldrich	Z225568	carbide time, pkg of 1
Glycerol	Sigma Aldrich	G7893	ACS reagent, ≥99.5%
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H3375	≥99.5% (titration)
Hoechst 33258 Solution	Sigma Aldrich	94403	1 mg/mL in H2O, ≥98.0% (HPLC)
In line HEPA Filter	Sigma Aldrich	WHA67225001	VACU-GUARD 60 mm disc, 0.45 PFTE housing
ITO-Coated Microscopy Slides	Delta Technologies	CG-90IN-S115	70-100Ω resistance
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M8266	anhydrous, ≥98%
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	208094	anhydrous, ≥97%
Microcentrifuge tubes	Sigma Aldrich	HS4323K	tube capacity 1.5 mL, pack of 500
Papain dissociation system	Worthington Biochemical	LK003150	one box, 5 single use vials
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458	liquid, BioReagent
Potassium chloride	Sigma Aldrich	529552	Molecular biology grade
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379	Reagent Plus
Sodium biocarbonate	Sigma Aldrich	S6014	ACS reagent, ≥99.7%
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888	ACS reagent, ≥99%
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	221465	ACS reagent, ≥97%, pellets
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9763	ACS reagent, ≥99%
Sublimate	HTX	N/A	N/A
timsTOF FleX MALDI-2	Bruker	N/A	microGRID enabled
Vacuum tubing	Thermo Scientific	8701-0080	Nalgene Non-phthalate PVC Tubing