Dessorção/ionização a laser assistida por matriz guiada por fluorescência com espectrometria de massa de postionização induzida por laser de células neurais de ratos individuais

Resumo

Este protocolo descreve o uso de microMS para espectrometria de massa MALDI-2 de célula única guiada por fluorescência, permitindo um perfil molecular aprimorado de células neuronais primárias de ratos.

Resumo

As medições de uma única célula são essenciais para entender a rica heterogeneidade espaçoquímica do cérebro. A espectrometria de massa (MS) de ionização por dessorção assistida por matriz (MALDI) é capaz de caracterizar moléculas endógenas em células individuais sem marcação e de alto rendimento. Os recentes avanços no desenvolvimento de espectrômetros de massa MALDI com pós-ionização induzida por laser (MALDI-2) fornecem sensibilidade de detecção muito maior para uma variedade de lipídios e outras moléculas pequenas. No entanto, a imagem de MS de grandes amostras com MALDI-2 em resolução celular é proibitivamente lenta para a maioria das aplicações. Neste protocolo, as células primárias são isoladas e dispersas em lâminas condutoras. As localizações relativas das células são determinadas por microscopia de fluorescência de lâmina inteira, seguida de co-registro preciso das coordenadas da microscopia para as coordenadas do estágio do espectrômetro de massa MALDI-2. A análise de MS direcionada apenas de localizações de células fornece medições de célula única de alto rendimento com alta cobertura de analito e tamanho de dados reduzido em comparação com a imagem de MS de toda a amostra. Descrevemos as etapas críticas necessárias para a preparação de célula única, imagem de fluorescência de lâmina inteira, aplicação de matriz e espectrometria de massa MALDI-2.

Introdução

Lipídios e metabólitos são fundamentais para a função celular e servem como componentes essenciais de membranas, fontes de energia e moléculas de sinalização ^1,2. No entanto, sua composição e abundância podem variar significativamente entre as células individuais, refletindo as diferenças nos tipos de células e nos estados de desenvolvimento e funcionais ^3,4,5. A análise dessas diferenças é crucial para entender a variabilidade biológica e identificar subpopulações celulares distintas. Técnicas de medição de célula única, como sequenciamento de RNA, fornecem perfis de transcrição específicos de células^{úteis 6}. No entanto, essas medições em nível de transcrição não refletem diretamente as quantidades celulares reais de lipídios e metabólitos, pois a expressão gênica nem sempre se correlaciona com a abundância real desses analitos. Métodos especializados para medições diretas de lipídios e metabólitos são, portanto, necessários para uma análise abrangente da composição química de células individuais e suas populações.

A imagem de espectrometria de massa (MSI) de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) é uma ferramenta de escolha para mapeamento espacial sem marcação de biomoléculas endógenas in situ ^7,8. Normalmente, com o MALDI, um laser UV é usado para remover material de uma fina camada de amostra co-cristalizada com uma matriz orgânica, formando uma pluma de íons e moléculas neutras. Os íons formados são então separados por um analisador MS e detectados dentro de um espectrômetro de massa. Dado o posicionamento preciso dos estágios modernos do espectrômetro de massa, o laser pode ser posicionado para atingir regiões de amostra específicas ou rasterizado entre regiões para gerar imagens moleculares por MSI. MSI em resolução espacial celular ou subcelular (< 10 μm), alcançada com um feixe de laser focalizado e movimento de estágio preciso, pode ser usado para obter informações químicas sobre células individuais ^9,10. No entanto, as medições de MSI nessa escala são ineficientes, especialmente no caso de amostras com baixas densidades de células alvo, devido à quantidade de tempo gasto na imagem de regiões vazias entre as células. Além disso, a detectabilidade de muitos analitos é limitada devido ao pequeno volume amostrado. Para superar esses desafios, desenvolvemos uma abordagem MALDI MS guiada por imagem para análise de célula única de alto rendimento^11,12. Nesta abordagem, as localizações das células dispersas são determinadas programaticamente a partir de imagens de fluorescência de lâmina inteira e usadas para guiar o estágio do espectrômetro de massa para posições onde células individuais com parâmetros específicos (por exemplo, tamanho e forma) estão localizadas e são então analisadas por irradiação com o laser MALDI. Trabalhos anteriores usando essa abordagem direcionada foram usados para caracterizar lipídios, peptídeos e outras biomoléculas em populações de células heterogêneas ^5,13.

Dada a natureza limitada em massa de células individuais, o número de analitos detectados nessas amostras é geralmente menor do que o observado diretamente do tecido. Portanto, para aumentar a cobertura do analito na análise de MS de célula única, é fundamental aumentar a sensibilidade de detecção do analito. Uma abordagem recentemente desenvolvida que ajuda a superar esse desafio de detecção é o MALDI com pós-ionização a laser (MALDI-2), que demonstrou aumentar a sensibilidade para uma ampla gama de analitos 9,14,15,16. Como resultado, o MALDI-2 gera conjuntos de dados de célula única mais abrangentes e fornece cobertura molecular mais profunda em amostras com massa limitada, como células isoladas.

O objetivo deste método é obter medições lipídicas de milhares de células individuais. Para esse fim, descrevemos um fluxo de trabalho que permite a espectrometria de massa MALDI-2 de célula única de alto rendimento e geralmente é extensível a qualquer abordagem de espectrometria de massa baseada em sonda com controle preciso^{do estágio 17}. Nesse fluxo de trabalho, o tecido da(s) região(ões) cerebral(is) de interesse é dissecado e células individuais são obtidas do tecido após um procedimento de dissociação da papaína. As células são então marcadas com uma coloração nuclear e são dispersas em lâminas de vidro condutoras gravadas com marcadores fiduciais, onde podem aderir. Em seguida, imagens de lâmina inteira são tiradas usando microscopia de fluorescência. A matriz é depositada por sublimação, gerando uma camada cristalina homogênea repetível e alta relação sinal-ruído para análise de MS de célula única. Usando o software de código aberto microMS¹¹, as coordenadas relativas das localizações das células da imagem de microscopia são mapeadas e alinhadas com as coordenadas do estágio do espectrômetro de massa por um registro de conjunto de pontos usando marcadores fiduciais gravados nas lâminas de vidro onde as células foram depositadas. Por fim, usando essas informações, espectros precisos e direcionados de MS são adquiridos de cada célula individual, permitindo que milhares de células sejam perfiladas em uma única execução (<1 h)^12,13.

Protocolo

Todos os experimentos com animais neste estudo foram feitos de acordo com o protocolo de uso de animais aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Illinois (23228) com estrita adesão aos padrões nacionais e ARRIVE para o tratamento ético e cuidado de animais.

1. Preparação de materiais e soluções

1. Prepare a solução salina balanceada de Gey modificada (mGBSS) com 1.5 mM CaCl₂, 4.9 mM KCl, 0.2 mM KH₂PO₄, 11 mM MgCl₂, 0.3 mM MgSO₄, 138 mM NaCl, 27.7 mM NaHCO₃, 0.8 mM Na₂HPO₄ e 25 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,2 usando 3 M NaOH. Recomenda-se preparar 1 L de mGBSS e armazenar a 4 °C até o uso.
2. Prepare seringas de 50 mL enchendo-as com a solução de mGBSS preparada e coloque-as no gelo para a perfusão transcárdica. Prepare 1 seringa para cada rato dissecado.
3. Prepare alíquotas da solução de papaína seguindo o protocolo do Sistema de Dissociação de Papaína de Worthington. Este sistema contém quatro frascos para injetáveis conforme descrito abaixo, com o frasco 4 não utilizado para este protocolo:
   Frasco 1: solução salina balanceada de Earle estéril (EBSS) com bicarbonato e vermelho de fenol
   Frasco 2: papaína com L-cisteína e EDTA
   Frasco 3: desoxirribonuclease I (DNase)
   Frasco para injetáveis 4: inibidor da protease ovomucóide com albumina de soro bovino
   1. Adicione 5 ml de EBSS (frasco 1) ao frasco para injetáveis de papaína (frasco 2) e coloque-o em banho-maria a 37 °C durante 10 min para dissolver a papaína.
   2. Adicione 500 μL de EBSS (frasco 1) no frasco DNase (frasco 3) e misture suavemente. Adicione 250 μL do frasco para injetáveis de DNase diluído (frasco para injetáveis 3) no frasco para injetáveis de papaína (frasco para injetáveis 2). Esta preparação contém uma concentração final de 20 unidades/mL de papaína, 0,005% de DNase, 0,5 mM de EDTA e 1 mM de L-cisteína.
   3. Congelar alíquotas de 250 μL desta solução preparada de papaína para dissociações subsequentes (faz ~ 20 alíquotas). Complemente esta solução com os seguintes antibióticos: 100 unidades / mL de penicilina G, 100 μg / mL de estreptomicina e 100 μg / mL de gentamicina. Isso pode ser modificado para o aplicativo do usuário.
4. Preparar uma solução de acetato de amónio a 150 mM e conservá-la a 4 °C. Prepare uma solução de glicerol a 33% diluindo o glicerol na solução mGBSS preparada.
5. Gravura fiduciais em lâminas de microscopia revestidas de óxido de índio e estanho (ITO) usando uma caneta de gravação com ponta de carboneto de tungstênio ou diamante ou um gravador a laser CO₂ . No lado condutor da lâmina de vidro ITO, grave 20-40 marcadores fiduciais em forma de X ao longo da periferia da lâmina para permitir o registro espacial entre plataformas (por exemplo, microscópio e espectrômetro de massa).
   NOTA: Tome cuidado para não gravar em uma linha conectada ao redor da amostra ou de suas áreas, pois isso interrompe a condutividade da superfície entre a área e um adaptador de lâmina de vidro.

2. Preparação de células neurais primárias

NOTA: O tecido do hipocampo de ratos é dissecado, dissociado em células individuais com papaína e depositado em lâminas de vidro condutoras em baixa densidade. O isolamento de células dessa maneira permite espectrometria de massa de célula única de alto rendimento de lipídios endógenos.

1. Antes da dissecação do animal, descongele uma alíquota da solução de papaína preparada e coloque-a em um recipiente com um tubo de entrada e saída que permita que o CO₂ desloque o ar dentro do recipiente. Coloque este sistema em banho-maria regulado para 37 °C e continue o fluxo de CO₂ até que a solução atinja o pH adequado, conforme indicado pela cor, usando a tabela de cores de pH incluída no pacote do Sistema de Dissociação de Papaína Worthington. O pH alvo está entre 7,2 e 7,4.
   NOTA: Não borbulhe CO₂ na solução enzimática, pois isso resultará na desnaturação da DNase e perda de atividade biológica. Use um tubo de centrífuga de 50 mL com dois tubos colados na tampa, permitindo que o CO₂ encha o tubo pela parte inferior e escape pelo tubo de saída superior.
2. Eutanasiar rato(s) de acordo com os protocolos da IACUC seguindo as diretrizes institucionais, locais e federais. Aqui, ratos Sprague-Dawley machos de 2 a 3 meses de idade são usados e sacrificados por asfixia por CO₂ .
3. Perfundir transcardia o rato com uma solução gelada (4 °C) de mGBSS para remover o sangue do sistema vascular e resfriar rapidamente o corpo do animal. Um exemplo desse procedimento pode ser encontrado no protocolo de We et ^al.18.
4. Isole cirurgicamente o cérebro do rato, certificando-se de não danificar a região cerebral de interesse. Uma visão geral publicada anteriormente desse isolamento fornece mais detalhes sobre algumas das etapas individuais¹⁹.
5. Use um cortador de tecido ou cubo de tecido para cortar uma seção transversal (~ 2 mm de espessura) do cérebro para expor a região (hipocampo, córtex ou estriado) à amostra.
6. Use um punção de biópsia de 2 mm para coletar amostras da região cerebral de interesse e depositar o pedaço de tecido no frasco de solução de papaína.
7. Incubar esta solução de tecido e papaína a 37 °C sob agitação constante (por exemplo, por um balancim elétrico) por 30-90 min.
   NOTA: A duração do tratamento enzimático deve ser otimizada com base na região do cérebro, cepa animal, idade e produção celular desejada (por exemplo, neurônios e astrócitos com terminais versus rendimento máximo de células sem terminais). Para tecido hipocampal de rato, 60-90 min é típico. Tratamentos mais curtos podem preservar alguns terminais, mas deixar muitas células em aglomerados não dissociados, enquanto tratamentos mais longos podem melhorar o rendimento, mas aumentar o dano celular, exigindo avaliação usando ensaios vivos/mortos (por exemplo, kit de viabilidade/citotoxicidade VIVO/MORTO). Para estudos comparativos, os tratamentos devem ser consistentes entre os tipos de amostra.
8. Coloque um frasco de lenço de papel e papaína no gelo para resfriar e suprimir a atividade enzimática. Triturar o tecido usando uma ponta de pipeta cortada conectada a uma pipeta de volume ajustável P100 até que a maior parte do tecido esteja visualmente quebrada. Não forme bolhas de ar durante a dissociação para evitar danos celulares excessivos.
   NOTA: A trituração vigorosa resulta em um alto rendimento de células; no entanto, eles não retêm a maioria de seus processos. A trituração suave fornece mais processos nas células, mas resulta em mais células não dissociadas. Ponteiras de pipeta de tamanhos diferentes e outros métodos também podem ser usados e otimizados para resultados ideais de dissociação²⁰.
9. Centrifugue as células dissociadas a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente para peletar as células. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de mGBSS. Adicione a coloração nuclear Hoechst 33342 a uma concentração final de 1 μg/ml.
10. Pipetar 100-500 μL da suspensão celular em lâminas de vidro ITO gravadas e deixar descansar por cerca de 5 minutos ou mais para permitir que as células sedimentem e adiram à lâmina.
    1. A diluição da suspensão celular terá de ser determinada empiricamente. Usando um microscópio óptico, adicione uma gota das células na lâmina para determinar a densidade aproximada e dilua a partir daí para garantir que haja distância suficiente entre as células (ou seja, suficientemente maior que o tamanho do feixe MALDI). Esta diluição pode ser realizada na primeira lâmina e, em seguida, a diluição pode ser ajustada conforme necessário para as lâminas subsequentes.
11. Aspire suavemente a suspensão celular da lâmina usando um sistema de vácuo contendo (localizado na ordem a partir da linha de vácuo): 1) Tubulação com um filtro HEPA de gás em linha, 2) Tubulação instalada em um frasco filtrante de 50 mL, 3) Tubulação conectada a uma segunda entrada de frasco filtrante com uma ponta de pipeta acoplada (por exemplo, 100 μL). Se armazenar as células plaqueadas para uso futuro, substitua a suspensão aspirada por solução de glicerol a 33% por 1-2 min e remova-a.
    NOTA: Esta etapa garantirá a estabilidade da célula. Dispensar a solução de glicerol de um lado enquanto aspira suavemente do outro lado funciona é ideal para manter a estrutura celular. Sempre monitore visualmente todas as etapas descritas aqui usando um microscópio invertido durante a preparação da primeira amostra.
12. Aplique 100-500 μL de acetato de amônio nas regiões depositadas, deixe descansar por cerca de 1 min e aspire para limpar as lâminas. Repita conforme necessário para garantir que as lâminas estejam livres de sal ou glicerol.

3. Microscopia

NOTA: Para determinar a localização das células depositadas, cada lâmina é fotografada por microscopia de campo claro/fluorescência. O canal de fluorescência permite que as células coradas por Hoechst sejam localizadas com precisão, enquanto a imagem de campo claro fornece informações morfológicas. Qualquer microscópio capaz de aquisição de imagens lado a lado é adequado para este processo.

1. Se não tiver feito anteriormente, enxágue as lâminas com 2-3 mL de acetato de amônio 150 mM. Esta etapa é fundamental para remover cristais de glicerol e sal, que podem interferir na observação da microscopia e na aplicação da matriz MALDI. Seque as lâminas sob uma corrente suave de N₂ ou deixe secar ao ar.
2. Carregue a corrediça na platina do microscópio. Focalize o microscópio usando pelo menos 10 pontos de apoio distribuídos uniformemente pela lâmina.
3. Usando filtros adequados para DAPI (excitação: 335-383 nm, emissão: 420-470 nm) e imagens de campo claro, obtenha uma imagem de fluorescência lado a lado com ampliação de 5x-10x em toda a lâmina, garantindo que os marcadores fiduciais (criados na etapa 1.5) sejam capturados.
   NOTA: Uma ampliação de 5x geralmente é suficiente, especialmente quando muitos slides precisam ser fotografados. Para resolver a morfologia celular mais fina, objetivas de 10x ou 20x podem ser usadas ao custo de um tempo de imagem quadraticamente mais longo e aumento do tamanho dos arquivos.
4. Costure a imagem lado a lado usando um software de microscopia, como o ZEN (Zeiss). A costura precisa é crítica, pois qualquer erro nessa etapa será propagado para a etapa final de registro, resultando em segmentação imprecisa. Para verificar, certifique-se de que os ladrilhos adjacentes verticalmente não estejam deslocados. Além disso, considere adquirir imagens lado a lado com uma grande sobreposição de blocos (20% a 30%).
5. Processe e exporte cada imagem como um arquivo bigTIFF no software de microscopia. Se a região com imagem for relativamente pequena e resultar em um tamanho de imagem final inferior a 2 GB, use um formato de arquivo TIFF padrão.

4. Aplicação matricial

NOTA: A aplicação consistente e adequada da matriz MALDI é fundamental para obter dados de célula única de qualidade. Embora a sublimação usando um aparelho comercial seja usada aqui, a aplicação da matriz também pode ser realizada usando um pulverizador robótico¹², aerógrafo²¹ ou aparelho de sublimação caseiro²². Descobrimos que as preparações de célula única requerem menos matriz do que as seções de tecido fino normalmente usadas para imagens de espectrometria de massa. Para reduzir os efeitos do lote, recomenda-se aplicar a matriz a todas as lâminas em estudo durante uma sessão e depositar células de diferentes grupos (por exemplo, região do cérebro ou tratamento vs. controle) na mesma lâmina sempre que possível. A seleção de matriz é crucial para os fluxos de trabalho de célula única MALDI e MALDI-2 tradicionais. Para MALDI de célula única, DHB²³, 9-AA²⁴ e CHCA²⁵ foram usados com sucesso. No MALDI-2, nós e outros observamos um aumento significativo do sinal com o DHAP⁹, enquanto matrizes como NEDC¹⁶ e CHCA²⁶ também foram aplicadas de forma eficaz.

1. Dissolva 20 mg de 2,5-di-hidroxiacetofenona (DHAP) em 1,5 mL de acetona. Coloque as lâminas no suporte da câmara de sublimação e coloque-as no aparelho de sublimação.
2. Pipetar a solução de matriz dissolvida sobre o wafer cerâmico e deixar evaporar a acetona. Feche a câmara de sublimação para selá-la.
3. Encha a câmara de refrigeração com uma lama de água gelada e coloque-a em cima da câmara.
4. Ligue o aspirador e deixe o sistema se equilibrar por 5 min. A pressão no sistema deve ser inferior a 40 mbar.
5. Comece a sublimação aquecendo a câmara a 200 °C por 5 min.
6. Remova o banho de água gelada, gire a temperatura para 25 °C e coloque um dissipador de calor em cima da câmara. Deixe o sistema aquecer até a temperatura ambiente por 5 min para evitar condensação.
   NOTA: O recipiente que contém o banho de água gelada pode ser esvaziado e enchido com água quente para servir como dissipador de calor.
7. Ventile lentamente o sistema, abra a câmara e remova as lâminas.

5. MALDI MS de célula única

NOTA: Os dados de MS de célula única são obtidos em um instrumento MALDI-2 timsTOF (timsTOF flex) usando o pacote microMS de código aberto para detectar células e guiar o espectrômetro de massa. Isso requer que os locais de pixel da imagem óptica das células-alvo sejam traduzidos para as coordenadas físicas do estágio do espectrômetro de massa.

1. Abra o microMS e dizime as imagens de microscopia bigTIFF usando a opção Grupo de imagens, pois existem canais de campo claro e fluorescência.
2. Usando a ferramenta Opções de Blob, identifique os parâmetros ideais a serem selecionados para as células de destino. Ajuste os seguintes parâmetros: o tamanho máximo e mínimo do blob para selecionar o tamanho dos blobs a serem localizados; a configuração de limite, que determina como limitar o canal de fluorescência para detecção de blobs; e a circularidade, que determina o quão circulares as células identificadas precisam ser para consideração. Para os dados aqui apresentados, foram utilizados os seguintes valores de parâmetros: circularidade máxima: nenhuma; circularidade mínima: 0,6; limiar: 75; tamanho mínimo: 20; Tamanho máximo: nenhum.
3. Use a opção Localização de blob para localizar blobs e a janela pop-up para salvar a lista de blobs com o nome desejado.
4. Use a ferramenta Filtro de distância para selecionar uma distância específica que cada célula precisa estar longe uma da outra (para esses dados, usando microscopia de fluorescência 5x, usamos um filtro de distância de 35 pixels). Isso é para garantir que as células estejam longe o suficiente umas das outras para realizar a análise de uma única célula. Esse número está em unidades de pixel, portanto, conheça a conversão de pixel para μm para o microscópio para determinar o número ideal. Use o tamanho do diâmetro da sonda do laser mais cerca de 20-30 μm para contabilizar erros no registro.
5. Carregue os slides no instrumento usando o adaptador de slides MTP II. Retorne ao computador com microMS e, usando um aplicativo de área de trabalho remota, acesse o computador do espectrômetro de massa.
6. Se esta for a primeira vez que o instrumento está sendo usado, verifique a posição XY do instrumento. Para fazer isso, vá para Ferramentas e configurações de instrumentos. A janela pop-up exibirá um conjunto de coordenadas com suas posições X e Y. Selecione cada um desses pontos específicos na geometria do Slide Adapter II no instrumento e atualize as posições X e Y na janela microMS.
7. Usando os controles da câmera e do estágio do espectrômetro de massa, navegue até um local facilmente identificável no slide e copie as coordenadas do instrumento. No microMS, encontre o local correspondente na imagem do microscópio, clique com o botão direito do mouse nessa posição e digite as coordenadas no local do texto da janela pop-up. Arredonde todas as coordenadas para o inteiro mais próximo e separe as coordenadas X e Y com espaço (ou seja, 39595 -23232).
8. Repita a etapa 5.7. para registrar pelo menos 12 marcadores fiduciais em toda a lâmina. Depois que três pontos de registro forem adicionados, um dos círculos ficará vermelho, indicando que é a posição mais fora do registro. Se isso ocorrer, exclua o ponto de registro atual usando shift + clique com o botão direito do mouse e tente novamente.
9. Em Arquivo, vá para Salvar e, em seguida, Registro para salvar o arquivo de registro (.msreg).
10. Com os blobs exibidos no slide, salve o arquivo de posição do instrumento (.xeo) acessando Arquivo, Salvar e Posições do Instrumento. Usando o software de área de trabalho remota, transfira este arquivo .xeo para o computador do instrumento.
11. Copie o texto do arquivo .xeo personalizado gerado no arquivo .xeo do MTP Slide Adapter II no instrumento e salve-o. Isso atualizará esse arquivo de geometria com as localizações das células.
12. Clique na guia Automação e selecione Novo... para iniciar uma execução automática. Arraste pela região de amostra exibida para selecionar as células e clique com o botão direito do mouse para adicioná-las à lista de análise. Salve a execução de automação e clique em Iniciar execução automática para iniciar a aquisição. A duração da execução depende de uma variedade de fatores, incluindo número de células, disparos de laser e frequência do laser, mas, em geral, cerca de 5 a 10 células podem ser analisadas no modo MALDI (taxa de repetição do laser de 10 kHz) e 1 a 5 células podem ser analisadas no modo MALDI-2 (taxa de repetição do laser de 1k Hz) a cada segundo.

6. Processamento de dados

NOTA: Os pacotes de software comerciais existentes não são adequados para analisar dados de espectrometria de massa de célula única de alto rendimento. Embora os espectros individuais possam ser visualizados, a extração de insights biológicos significativos requer ferramentas especializadas. Para resolver isso, fornecemos software disponível gratuitamente que facilita a análise de dados MALDI-2 MS de célula única. Nosso fluxo de trabalho atualizado facilita a conversão direta de dados de célula única para o formato imzML de código aberto²⁷, permitindo a compatibilidade com SCiLS MVS e outros softwares de fornecedores. Para uma análise de dados mais avançada, o script completo também inclui funcionalidade para anotação lipídica, agrupamento e outras ferramentas de visualização habilitadas pelo Matplotlib (versão 3.7.3). A análise e a leitura dos dados brutos são facilitadas pela biblioteca pyTDFSDK, um conjunto de funções englobadas no fluxo de trabalho TIMSCONVERT²⁸.

1. Inicialize o SC_MALDI2_Analysis personalizado da biblioteca Python copiando o arquivo fornecido no Arquivo Suplementar 1 no mesmo caminho de trabalho do Jupyter Notebook e pressione Shift + Enter no teclado na primeira célula de código. Isso nos permitirá chamar essas funções posteriormente e usá-las para processar os dados.
2. Copie o caminho para os dados coletados (arquivos Bruker .d). Recomendamos nomear as pastas e os nomes de cada arquivo descritivamente, de modo que possamos analisar esses caminhos de arquivo posteriormente para estabelecer metadados para cada exemplo. Execute a seção Importando os arquivos .d do Bruker e salve em uma célula de código de lista. Isso produzirá o número total de arquivos .d carregados.
3. Execute a célula de código intitulada Processando os dados brutos e salvando em imzML. Isso lerá cada arquivo .d Bruker fornecido, executará a seleção de pico nos dados e salvará 20 ppm de dados em torno de cada pico em um arquivo .imzML gravado dentro do arquivo .d.
   1. Para localizar os dados salvos, abra o local do primeiro arquivo .d e o imzML e outros metadados serão salvos nesse caminho. Neste estágio, o arquivo imzML salvo pode ser importado para o software do fornecedor, como o SCiLS Lab MVS. Para uma análise de dados mais avançada, continue seguindo o script.
4. Carregue os dados imzML salvos executando a célula de código de arquivo imzML salva anteriormente. Isso carrega os dados salvos nos dados variáveis.
5. Execute a célula Binning the data and saving data matrix para compartimentar todos os dados ao longo de um eixo m/z comum, remover feições que estão presentes em baixa abundância (<0,1%) e remover valores menores que ruído (intensidade relativa de 100). Em seguida, essa função redefine os dados calculando a média de cada valor m/z de pico em cada compartimento. A matriz de dados resultante é salva como datacube_array, os compartimentos m/z associados à matriz são salvos como valid_mz_bins e uma contagem de cada compartimento é salva como contagem.
6. Para anotar os dados, execute a célula de anotação Exportando picos para MAPAS LIPÍDICOS . Isso copiará todos os picos m/z dentro de sua matriz de dados para sua área de transferência. Cole-o em um arquivo de texto vazio e salve-o para carregá-lo no LIPID MAPS.
7. Abra lipidmaps.org e selecione MS Data Bulk Search e Search LMSD para pesquisar espécies lipídicas biologicamente relevantes. Carregue a lista de picos escolhendo o arquivo de texto e selecione os adutos apropriados (por exemplo, [M+H]+, [M+Na]⁺ e [M+K]⁺). Selecione a tolerância de massa apropriada para o seu espectrômetro de massa (escolhemos +/- 0,01 m/z), selecione todas as classes lipídicas de interesse e clique em Pesquisar. Baixe o arquivo .tsv.
8. Carregue os metadados de espectros executando o Carregamento nos caminhos de célula única para células de metadados . Altere o código de divisão aqui com base nas estruturas do caminho do arquivo.
9. Pré-processe os dados executando a célula Pré-processamento de Dados e Anotação de Lipídios . Isso usará o arquivo lipidMAPS tsv para anotar o conjunto de dados com um erro de 10 ppm, eliminar lipídios de cadeia ímpar dos resultados do lipidMAPS, normalizar os dados restantes e remover recursos ou células que não ultrapassam um limite específico. Isso salvará o novo conjunto de dados processado como data2 e os metadados de espectros atualizados como updated_cell_types.
10. A análise dos dados é realizada por scanpy. Execute a célula UMAP e Análise de Clustering para Células Únicas para selecionar dados de interesse (aqui selecionamos apenas dados MALDI-2, M2), dimensionar o conjunto de dados e carregá-lo em um objeto AnnData escancado para facilitar as análises.
    NOTA: Aqui, o agrupamento de Leiden e a redução da dimensionalidade (UMAP) foram realizados no conjunto de dados, tanto as classes de dados originais quanto os clusters no UMAP foram visualizados, e algumas das características estatisticamente mais significativas entre os clusters foram resumidas usando a função rank_genes_groups_dotplot do scanpy.

Resultados

Uma visão geral do fluxo de trabalho para MALDI-2 MS de célula única guiada por fluorescência é mostrada na Figura 1. Primeiro, o tecido dissecado de regiões cerebrais alvo (Figura 1A) é dissociado em células únicas e depositado em lâminas de microscopia condutivas revestidas com ITO (Figura 1B). As localizações das células são determinadas por imagem de fluorescência de lâmina intei...

Discussão

O MALDI MS de célula única guiado por imagem e de alto rendimento é uma ferramenta valiosa para entender a heterogeneidade química em escala de célula única. A adição de pós-ionização induzida por laser (MALDI-2) fornece uma cobertura mais profunda do analito, o que é crítico para amostras limitadas em massa e volume, como células isoladas de mamíferos.

Embora a esmagadora maioria dos fluxos de trabalho publicados de lipídios e metabólitos de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',5'-dihydroxyacetophenone	Sigma Aldrich	D107603	DHAP, 97% purity
Ammonium acetate	Sigma Aldrich	238074	ACS reagent, ≥97%
Axio M2 Imager	Zeiss	N/A	N/A
Biopsy punch, 2 mm	Fisher Scientific	12-460-399	integra miltex standard biopsy punch, 2mm
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901	anhydrous, powder ≥97%
Eppendorf Centrifuge	Sigma Aldrich	EP5405000441	centrifuge 5425 with rotor FA-24x2
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1272	liquid, BioReagent
Glass etching pen	Sigma Aldrich	Z225568	carbide time, pkg of 1
Glycerol	Sigma Aldrich	G7893	ACS reagent, ≥99.5%
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H3375	≥99.5% (titration)
Hoechst 33258 Solution	Sigma Aldrich	94403	1 mg/mL in H2O, ≥98.0% (HPLC)
In line HEPA Filter	Sigma Aldrich	WHA67225001	VACU-GUARD 60 mm disc, 0.45 PFTE housing
ITO-Coated Microscopy Slides	Delta Technologies	CG-90IN-S115	70-100Ω resistance
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M8266	anhydrous, ≥98%
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	208094	anhydrous, ≥97%
Microcentrifuge tubes	Sigma Aldrich	HS4323K	tube capacity 1.5 mL, pack of 500
Papain dissociation system	Worthington Biochemical	LK003150	one box, 5 single use vials
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458	liquid, BioReagent
Potassium chloride	Sigma Aldrich	529552	Molecular biology grade
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379	Reagent Plus
Sodium biocarbonate	Sigma Aldrich	S6014	ACS reagent, ≥99.7%
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888	ACS reagent, ≥99%
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	221465	ACS reagent, ≥97%, pellets
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9763	ACS reagent, ≥99%
Sublimate	HTX	N/A	N/A
timsTOF FleX MALDI-2	Bruker	N/A	microGRID enabled
Vacuum tubing	Thermo Scientific	8701-0080	Nalgene Non-phthalate PVC Tubing