Désorption/ionisation laser assistée par matrice guidée par fluorescence avec spectrométrie de masse de postionisation induite par laser de cellules neurales de rat individuelles

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de la microMS pour la spectrométrie de masse monocellulaire MALDI-2 guidée par fluorescence, permettant un profilage moléculaire amélioré des cellules neuronales primaires du rat.

Résumé

Les mesures sur cellule unique sont essentielles pour comprendre la riche hétérogénéité spatiochimique du cerveau. La spectrométrie de masse (MS) par laser/désorption assistée par matrice (MALDI) est capable de caractériser sans marquage et à haut débit des molécules endogènes dans des cellules individuelles. Les progrès récents dans la mise au point de spectromètres de masse MALDI avec post-ionisation induite par laser (MALDI-2) offrent une sensibilité de détection considérablement accrue pour une variété de lipides et d’autres petites molécules. Cependant, l’imagerie MS de grands échantillons avec MALDI-2 à résolution cellulaire est d’une lenteur prohibitive pour la plupart des applications. Dans ce protocole, les cellules primaires sont isolées et dispersées sur des lames conductrices. L’emplacement relatif des cellules est déterminé par microscopie à fluorescence sur lame entière, suivie d’un co-enregistrement précis des coordonnées de la microscopie avec les coordonnées de l’étage du spectromètre de masse MALDI-2. L’analyse MS ciblée de l’emplacement des cellules uniquement fournit des mesures à haut débit sur une seule cellule avec une couverture d’analyte élevée et une taille de données réduite par rapport à l’imagerie MS de l’ensemble de l’échantillon. Nous décrivons les étapes critiques nécessaires à la préparation d’une cellule unique, à l’imagerie de fluorescence sur lame entière, à l’application matricielle et à la spectrométrie de masse MALDI-2.

Introduction

Les lipides et les métabolites sont fondamentaux pour la fonction cellulaire et servent de composants essentiels des membranes, des sources d’énergie et des molécules de signalisation ^1,2. Cependant, leur composition et leur abondance peuvent varier considérablement d’une cellule à l’autre, reflétant les différences de types de cellules et d’états développementaux et fonctionnels ^3,4,5. L’analyse de ces différences est cruciale pour comprendre la variabilité biologique et identifier des sous-populations cellulaires distinctes. Les techniques de mesure unicellulaires, telles que le séquençage de l’ARN, fournissent des profils de transcrits spécifiques aux cellules⁶. Cependant, ces mesures au niveau du transcrit ne reflètent pas directement les quantités cellulaires réelles de lipides et de métabolites, car l’expression des gènes n’est pas toujours corrélée avec l’abondance réelle de ces analytes. Des méthodes spécialisées pour les mesures directes des lipides et des métabolites sont donc nécessaires pour une analyse complète de la composition chimique des cellules individuelles et de leurs populations.

L’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est un outil de choix pour la cartographie spatiale sans marquage des biomolécules endogènes in situ ^7,8. En règle générale, avec MALDI, un laser UV est utilisé pour enlever le matériau d’une mince couche d’échantillon co-cristallisée avec une matrice organique, formant un panache d’ions et de molécules neutres. Les ions formés sont ensuite séparés par un analyseur MS et détectés dans un spectromètre de masse. Compte tenu du positionnement précis des étages de spectromètre de masse modernes, le laser peut être positionné pour cibler des régions d’échantillon spécifiques ou pixellisé à travers les régions pour générer des images moléculaires par MSI. La MSI à une résolution spatiale cellulaire ou subcellulaire (< 10 μm), obtenue avec un faisceau laser focalisé et un mouvement précis de la platine, peut être utilisée pour obtenir des informations chimiques sur des cellules individuelles ^9,10. Cependant, les mesures MSI à cette échelle sont inefficaces, en particulier dans le cas d’échantillons à faible densité cellulaire ciblée, en raison du temps passé à imager les régions vides entre les cellules. De plus, la détectabilité de nombreux analytes est limitée en raison du petit volume échantillonné. Pour surmonter ces défis, nous avons développé une approche MALDI MS guidée par l’image pour l’analyse de cellules uniques à haut débit^11,12. Dans cette approche, l’emplacement des cellules dispersées est déterminé de manière programmatique à partir d’images de fluorescence de lames entières et utilisé pour guider l’étage du spectromètre de masse vers des positions où se trouvent des cellules individuelles présentant des paramètres spécifiques (par exemple, la taille et la forme) et sont ensuite analysées par irradiation avec le laser MALDI. Des travaux antérieurs utilisant cette approche ciblée ont été utilisés pour caractériser les lipides, les peptides et d’autres biomolécules dans des populations cellulaires hétérogènes ^5,13.

Étant donné la nature limitée en masse des cellules uniques, le nombre d’analytes détectés dans ces échantillons est généralement inférieur à celui observé directement dans les tissus. Par conséquent, pour augmenter la couverture d’analytes dans l’analyse MS unicellulaire, il est essentiel d’augmenter la sensibilité de détection de l’analyte. Une approche récemment mise au point qui aide à surmonter ce défi de détection est MALDI avec post-ionisation laser (MALDI-2), dont il a été démontré qu’il améliore la sensibilité d’une large gamme d’analytes 9,14,15,16. En conséquence, MALDI-2 génère des ensembles de données unicellulaires plus complets et fournit une couverture moléculaire plus profonde dans des échantillons à masse limitée, tels que les cellules isolées.

L’objectif de cette méthode est d’obtenir des mesures lipidiques à partir de milliers de cellules individuelles. À cette fin, nous décrivons un flux de travail qui permet la spectrométrie de masse MALDI-2 à cellule unique à haut débit et qui est généralement extensible à toute approche de spectrométrie de masse basée sur une sonde avec un contrôle de platine précis¹⁷. Dans ce flux de travail, les tissus de la ou des régions cérébrales d’intérêt sont disséqués et des cellules individuelles sont obtenues à partir du tissu après une procédure de dissociation de la papaïne. Les cellules sont ensuite marquées d’une coloration nucléaire et sont dispersées sur des lames de verre conductrices gravées de marqueurs repères, où elles sont autorisées à adhérer. Ensuite, des images de lames entières sont prises à l’aide de la microscopie à fluorescence. La matrice est déposée par sublimation, générant une couche cristalline homogène reproductible et un rapport signal/bruit élevé pour l’analyse MS sur cellule unique. À l’aide du logiciel open source microMS¹¹, les coordonnées relatives de l’emplacement des cellules à partir de l’image de microscopie sont cartographiées et alignées avec les coordonnées de l’étage du spectromètre de masse par un recalage de points à l’aide de marqueurs de repère gravés sur les lames de verre où les cellules ont été déposées. Enfin, à l’aide de ces informations, des spectres MS précis et ciblés sont acquis à partir de chaque cellule individuelle, ce qui permet de profiler des milliers de cellules en une seule fois (<1 h)^12,13.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux de cette étude ont été effectuées conformément au protocole d’utilisation des animaux approuvé par l’Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (23228), dans le strict respect des normes nationales et d’ARRIVE pour le traitement et les soins éthiques des animaux.

1. Préparation des matériaux et des solutions

1. Préparez une solution saline équilibrée de Gey modifiée (mGBSS) avec 1,5 mM de CaCl₂, 4,9 mM de KCl, 0,2 mM de KH₂PO₄, 11 mM de MgCl₂, 0,3 mM de MgSO₄, 138 mM de NaCl, 27,7 mM de NaHCO₃, 0,8 mM de Na₂HPO₄ et 25 mM d’HEPES. Ajustez le pH à 7,2 en utilisant 3 M de NaOH. Il est recommandé de préparer 1 L de mGBSS et de le conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparez des seringues de 50 ml en les remplissant de la solution de mGBSS préparée et placez-les sur de la glace pour la perfusion transcardique. Préparez 1 seringue pour chaque rat disséqué.
3. Préparez des aliquotes de solution de papaïne en suivant le protocole du système de dissociation de la papaïne de Worthington. Ce système contient quatre flacons, comme décrit ci-dessous, le flacon 4 n’étant pas utilisé pour ce protocole :
   Flacon 1 : solution saline équilibrée d’Earle (EBSS) stérile avec bicarbonate et rouge de phénol
   Flacon 2 : papaïne avec L-cystéine et EDTA
   Flacon 3 : désoxyribonucléase I (DNase)
   Flacon 4 : inhibiteur de la protéase ovomucoïde avec albumine sérique bovine
   1. Ajouter 5 ml d’EBSS (flacon 1) dans le flacon de papaïne (flacon 2) et le placer dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 minutes pour dissoudre la papaïne.
   2. Ajouter 500 μL d’EBSS (flacon 1) dans le flacon de DNase (flacon 3) et mélanger délicatement. Ajouter 250 μL de la fiole de DNase diluée (fiole 3) dans la fiole de papaïne (fiole 2). Cette préparation contient une concentration finale de 20 unités/ml de papaïne, 0,005 % de DNase, 0,5 mM d’EDTA et 1 mM de L-cystéine.
   3. Congelez 250 μL d’aliquotes de cette solution de papaïne préparée pour les dissociations ultérieures (pour une concentration de ~20 aliquotes). Complétez cette solution avec les antibiotiques suivants : 100 unités/ml de pénicilline G, 100 μg/ml de streptomycine et 100 μg/ml de gentamicine. Cela peut être modifié pour l’application de l’utilisateur.
4. Préparez une solution d’acétate d’ammonium de 150 mM et conservez-la à 4 °C. Préparez une solution de glycérol à 33 % en diluant le glycérol dans la solution de mGBSS préparée.
5. Gravez des repères sur des lames de microscopie recouvertes d’oxyde d’indium et d’étain (ITO) à l’aide d’un stylo à graver avec une pointe en carbure de tungstène ou en diamant ou d’un graveur laser CO₂ . Sur la face conductrice de la lame de verre ITO, gravez des marqueurs repères en forme de X de 20 à 40 le long de la périphérie de la lame pour permettre un recalage spatial multiplateforme (par exemple, microscope et spectromètre de masse).
   REMARQUE : Veillez à ne pas graver dans une ligne connectée autour de l’échantillon ou de ses zones, car cela perturbe la conductivité de surface entre la zone et un adaptateur de lame de verre.

2. Préparation des cellules neurales primaires

REMARQUE : Le tissu hippocampique du rat est disséqué, dissocié en cellules individuelles avec de la papaïne et déposé sur des lames de verre conductrices à faible densité. L’isolement des cellules de cette manière permet la spectrométrie de masse unicellulaire à haut débit des lipides endogènes.

1. Avant la dissection de l’animal, décongelez une aliquote de la solution de papaïne préparée et placez-la dans un récipient doté d’un tube d’entrée et de sortie permettant au CO₂ de déplacer l’air à l’intérieur du récipient. Placez ce système dans un bain-marie réglé à 37 °C et continuez le flux de CO₂ jusqu’à ce que la solution ait le bon pH, comme indiqué par la couleur, à l’aide du nuancier de pH inclus dans l’emballage du système de dissociation Worthington Papain. Le pH cible se situe entre 7,2 et 7,4.
   REMARQUE : Ne faites pas de bulles de CO₂ dans la solution enzymatique, car cela entraînerait une dénaturation de la DNase et une perte d’activité biologique. Utilisez un tube à centrifuger de 50 ml avec deux tubes collés dans le couvercle, permettant au CO₂ de remplir le tube par le bas et de s’échapper par le tube de sortie supérieur.
2. Euthanasier le(s) rat(s) conformément aux protocoles de l’IACUC en suivant les directives institutionnelles, locales et fédérales. Ici, des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 2 à 3 mois sont utilisés et sacrifiés par asphyxie au CO₂ .
3. Perfuser le rat par voie transcardique avec une solution de mGBSS glacée (4 °C) pour éliminer le sang du système vasculaire et refroidir rapidement le corps de l’animal. Un exemple de cette procédure peut être trouvé dans le protocole de We et ^al.18.
4. Isolez chirurgicalement le cerveau du rat, en vous assurant de ne pas endommager la région cérébrale d’intérêt. Une vue d’ensemble de cette isolation précédemment publiée fournit plus de détails sur certaines des étapes individuelles¹⁹.
5. À l’aide d’un hachoir à tissus ou d’un cube de tissus, coupez une coupe transversale (~2 mm d’épaisseur) du cerveau afin d’exposer la région (hippocampe, cortex ou striatum) à échantillonner.
6. À l’aide d’un poinçon de biopsie de 2 mm, échantillonnez la région cérébrale d’intérêt et déposez le morceau de tissu dans le flacon de solution de papaïne.
7. Incuber cette solution de tissu et de papaïne à 37 °C sous agitation constante (par exemple, à l’aide d’une bascule électrique) pendant 30 à 90 minutes.
   REMARQUE : La durée du traitement enzymatique doit être optimisée en fonction de la région du cerveau, de la souche animale, de l’âge et de la production cellulaire souhaitée (p. ex., neurones et astrocytes avec terminales par rapport au rendement maximal des cellules sans terminales). Pour le tissu de l’hippocampe du rat, 60-90 min est typique. Des traitements plus courts peuvent préserver certaines terminaisons mais laisser de nombreuses cellules dans des amas non dissociés, tandis que des traitements plus longs peuvent améliorer le rendement mais augmenter les dommages cellulaires, nécessitant une évaluation à l’aide de tests vivants/morts (par exemple, kit de viabilité / cytotoxicité LIVE/DEAD). Pour les études comparatives, les traitements doivent être cohérents entre les types d’échantillons.
8. Placez un flacon de mouchoir et de papaïne sur de la glace pour refroidir et supprimer l’activité enzymatique. Triturez le tissu à l’aide d’une pointe de pipette coupée fixée à une pipette à volume réglable P100 jusqu’à ce que la majeure partie du tissu soit visiblement brisée. Ne formez pas de bulles d’air pendant la dissociation pour éviter des dommages cellulaires excessifs.
   REMARQUE : Une trituration vigoureuse entraîne un rendement élevé de cellules ; Cependant, ils ne conservent pas la plupart de leurs processus. La trituration douce fournit plus de processus sur les cellules mais entraîne plus de cellules non dissociées. Des pointes de pipette de différentes tailles et d’autres méthodes peuvent également être utilisées et optimisées pour des résultats de dissociation idéaux²⁰.
9. Centrifuger les cellules dissociées à 300 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de mGBSS. Ajouter la coloration nucléaire Hoechst 33342 à une concentration finale de 1 μg/mL.
10. Pipeter 100 à 500 μL de la suspension cellulaire sur des lames de verre ITO gravées et laisser reposer pendant environ 5 minutes ou plus pour permettre aux cellules de sédimenter et d’adhérer à la lame.
    1. La dilution de la suspension cellulaire devra être déterminée empiriquement. À l’aide d’un microscope optique, ajoutez une gouttelette des cellules sur la lame pour déterminer la densité approximative et diluez à partir de là pour vous assurer qu’il y a une distance suffisante entre les cellules (c’est-à-dire suffisamment grande que la taille du faisceau MALDI). Cette dilution peut être effectuée sur la première lame, puis la dilution peut être ajustée si nécessaire pour les lames suivantes.
11. Aspirez doucement la suspension cellulaire de la lame à l’aide d’un système de vide contenant (situé dans l’ordre à partir de la conduite de vide) : 1) un tube avec un filtre HEPA à gaz en ligne, 2) un tube monté sur un ballon filtrant de 50 ml, 3) un tube relié à une deuxième entrée de flacon filtrant avec une pointe de pipette attachée (par exemple, 100 μL). Si vous stockez les cellules plaquées pour une utilisation future, remplacez la suspension aspirée par une solution de glycérol à 33 % pendant 1 à 2 minutes et retirez-la.
    REMARQUE : Cette étape assurera la stabilité de la cellule. La distribution d’une solution de glycérol d’un côté tout en aspirant doucement de l’autre côté est optimale pour maintenir la structure cellulaire. Surveillez toujours visuellement toutes les étapes décrites ici à l’aide d’un microscope inversé lors de la préparation du premier échantillon.
12. Appliquez 100 à 500 μL d’acétate d’ammonium sur les zones déposées, laissez reposer pendant environ 1 min, puis aspirez pour nettoyer les lames. Répétez l’opération au besoin pour vous assurer que les lames sont exemptes de sel ou de glycérol.

3. Microscopie

REMARQUE : Pour déterminer l’emplacement des cellules déposées, chaque lame est imagée par microscopie à fond clair/fluorescence. Le canal de fluorescence permet de localiser avec précision les cellules colorées à Hoechst, tandis que l’imagerie en fond clair fournit des informations morphologiques. Tout microscope capable d’acquérir des images en mosaïque convient à ce processus.

1. Si ce n’est pas fait auparavant, rincez les lames avec 2 à 3 ml d’acétate d’ammonium de 150 mM. Cette étape est essentielle pour éliminer les cristaux de glycérol et de sel, qui peuvent interférer avec l’observation en microscopie et l’application de la matrice MALDI. Sécher les lames sous un léger jet de N₂ ou laisser sécher à l’air.
2. Chargez la lame dans la platine du microscope. Faites la mise au point du microscope à l’aide d’au moins 10 points d’appui répartis uniformément sur la lame.
3. À l’aide de filtres adaptés à l’imagerie DAPI (excitation : 335-383 nm, émission : 420-470 nm) et à l’imagerie en fond clair, obtenez une image de fluorescence en mosaïque à un grossissement de 5x-10x sur l’ensemble de la lame, en veillant à ce que les marqueurs repères (créés à l’étape 1.5) soient capturés.
   REMARQUE : Un grossissement de 5x est généralement suffisant, surtout lorsque de nombreuses diapositives doivent être imagées. Pour résoudre une morphologie cellulaire plus fine, des objectifs 10x ou 20x peuvent être utilisés au prix d’un temps d’imagerie quadratiquement plus long et d’une augmentation de la taille des fichiers.
4. Assemblez l’image en mosaïque à l’aide d’un logiciel de microscopie, tel que ZEN (Zeiss). Une couture précise est essentielle, car toute erreur dans cette étape se propagera à l’étape d’enregistrement finale, ce qui entraînera un ciblage inexact. Pour vérifier, assurez-vous que les tuiles adjacentes verticalement ne sont pas décalées. De plus, envisagez d’acquérir des images en mosaïque avec un grand chevauchement de tuiles (20 à 30 %).
5. Traitez et exportez chaque image sous forme de fichier bigTIFF dans le logiciel de microscopie. Si la zone imagée est relativement petite et que la taille de l’image finale est inférieure à 2 Go, utilisez plutôt un format de fichier TIFF standard.

4. Application matricielle

REMARQUE : Une application cohérente et appropriée de la matrice MALDI est essentielle pour obtenir des données unicellulaires de qualité. Bien que la sublimation à l’aide d’un appareil commercial soit utilisée ici, l’application matricielle peut également être effectuée à l’aide d’un pulvérisateur robotisé¹², d’un aérographe²¹ ou d’un appareil de sublimation fait maison²². Nous avons constaté que les préparations unicellulaires nécessitent moins de matrice que les coupes de tissus minces généralement utilisées pour l’imagerie par spectrométrie de masse. Pour réduire les effets de lot, il est recommandé d’appliquer la matrice à toutes les lames étudiées au cours d’une seule séance et de déposer des cellules de différents groupes (par exemple, région du cerveau ou traitement ou contrôle) sur la même lame dans la mesure du possible. La sélection matricielle est cruciale pour les flux de travail monocellulaires traditionnels MALDI et MALDI-2. Pour le MALDI unicellulaire, DHB²³, 9-AA²⁴ et CHCA²⁵ ont été utilisés avec succès. Dans MALDI-2, nous et d’autres avons observé une amélioration significative du signal avec DHAP⁹, tandis que des matrices telles que NEDC¹⁶ et CHCA²⁶ ont également été appliquées efficacement.

1. Dissoudre 20 mg de 2,5-dihydroxyacétophénone (DHAP) dans 1,5 mL d’acétone. Placez les lames dans le support de la chambre de sublimation et placez-les dans l’appareil de sublimation.
2. Placez la solution de matrice dissoute à l’aide d’une pipette sur la plaquette de céramique et laissez l’acétone s’évaporer. Fermez la chambre de sublimation pour la sceller.
3. Remplissez la chambre de refroidissement avec une gadoue d’eau glacée et placez-la sur le dessus de la chambre.
4. Allumez l’aspirateur et laissez le système s’équilibrer pendant 5 min. La pression dans le système doit être inférieure à 40 mbar.
5. Commencez la sublimation en chauffant la chambre à 200 °C pendant 5 min.
6. Retirez le bain d’eau glacée, réglez la température à 25 °C et placez un dissipateur thermique sur le dessus de la chambre. Laissez le système se réchauffer à température ambiante pendant 5 minutes pour éviter la condensation.
   REMARQUE : Le récipient contenant le bain d’eau glacée peut être vidé et rempli d’eau chaude pour servir de dissipateur thermique.
7. Ventilez lentement le système, ouvrez la chambre et retirez les lames.

5. MALDI MS à cellule unique

REMARQUE : Les données MS unicellulaires sont obtenues sur un instrument MALDI-2 timsTOF (timsTOF flex) à l’aide du progiciel microMS open source pour détecter les cellules et guider le spectromètre de masse. Cela nécessite que les emplacements des pixels de l’image optique des cellules ciblées soient traduits en coordonnées physiques de l’étage du spectromètre de masse.

1. Ouvrez microMS et décimez les images de microscopie bigTIFF à l’aide de l’option Groupe d’images, car il existe des canaux en fond clair et en fluorescence.
2. À l’aide de l’outil Options d’objet blob, identifiez les paramètres optimaux à sélectionner pour les cellules ciblées. Ajustez les paramètres suivants : la taille maximale et minimale des objets blob pour sélectionner la taille des objets blob à rechercher ; le réglage du seuil, qui détermine comment seuiller le canal de fluorescence pour la détection des blob ; et la circularité, qui détermine à quel point les cellules identifiées doivent être circulaires pour être prises en compte. Pour les données présentées ici, nous avons utilisé les valeurs de paramètres suivantes : circularité maximale : aucune ; circularité minimale : 0,6 ; seuil : 75 ; taille minimale : 20 ; Taille maximale : Aucune.
3. Utilisez l’option Recherche d’objets blob pour rechercher des objets blob et la fenêtre contextuelle pour enregistrer la liste des objets blob sous le nom de votre choix.
4. Utilisez l’outil de filtre de distance pour sélectionner une distance spécifique à laquelle chaque cellule doit être éloignée l’une de l’autre (pour ces données, à l’aide de la microscopie à fluorescence 5x, nous avons utilisé un filtre de distance de 35 pixels). Il s’agit de s’assurer que les cellules sont suffisamment éloignées les unes des autres pour effectuer une analyse unicellulaire. Ce nombre est exprimé en unités de pixels, il faut donc connaître la conversion du pixel en μm pour le microscope afin de déterminer le nombre idéal. Utilisez la taille du diamètre de la sonde laser plus environ 20-30 μm pour tenir compte des erreurs dans le repérage.
5. Chargez les diapositives dans l’instrument à l’aide de l’adaptateur de glissière MTP II. Retournez à l’ordinateur avec microMS et, à l’aide d’une application de bureau à distance, accédez à l’ordinateur du spectromètre de masse.
6. Si c’est la première fois que l’instrument est utilisé, vérifiez la position X-Y de l’instrument. Pour ce faire, rendez-vous dans la section Outils et paramètres de l’instrument. La fenêtre contextuelle affichera un ensemble de coordonnées avec leurs positions X et Y. Sélectionnez chacun de ces points spécifiques sur la géométrie de l’adaptateur de glissière II de l’instrument et mettez à jour les positions X et Y dans la fenêtre microMS.
7. À l’aide de la caméra et de la platine du spectromètre de masse, naviguez jusqu’à un emplacement facilement identifiable sur la diapositive et copiez les coordonnées de l’instrument. Dans microMS, trouvez l’emplacement correspondant dans l’image du microscope, cliquez avec le bouton droit de la souris sur cette position et tapez les coordonnées dans l’emplacement du texte de la fenêtre contextuelle. Arrondissez toutes les coordonnées à l’entier le plus proche et séparez les coordonnées X et Y par de l’espace (c’est-à-dire 39595 -23232).
8. Répétez l’étape 5.7. d’enregistrer au moins 12 marqueurs repères sur l’ensemble de la diapositive. Après l’ajout de trois points d’enregistrement, l’un des cercles devient rouge, indiquant qu’il s’agit de la position la plus éloignée de l’enregistrement. Si cela se produit, supprimez le point d’enregistrement actuel à l’aide de Maj + clic droit et réessayez.
9. Sous Fichier, accédez à Enregistrer, puis à Enregistrement pour enregistrer le fichier d’enregistrement (.msreg).
10. Une fois les gouttes affichées sur la diapositive, enregistrez le fichier de position de l’instrument (.xeo) en accédant à Fichier, puis à Enregistrer, puis à Positions des instruments. À l’aide d’un logiciel de bureau à distance, transférez ce fichier .xeo sur l’ordinateur de l’instrument.
11. Copiez le texte du fichier .xeo personnalisé généré dans le fichier .xeo MTP Slide Adapter II sur l’instrument et enregistrez-le. Cela mettra à jour ce fichier de géométrie avec les emplacements des cellules.
12. Cliquez sur l’onglet Automatisation et sélectionnez Nouveau... pour démarrer une exécution automatique. Faites glisser le pointeur sur la région d’échantillonnage affichée pour sélectionner les cellules, puis cliquez avec le bouton droit de la souris pour les ajouter à la liste d’analyse. Enregistrez l’exécution de l’automatisation et cliquez sur Démarrer l’exécution automatique pour commencer l’acquisition. La durée de l’exécution dépend de divers facteurs, notamment du nombre de cellules, des tirs laser et de la fréquence laser, mais en général, environ 5 à 10 cellules peuvent être analysées en mode MALDI (taux de répétition laser de 10 kHz), et 1 à 5 cellules peuvent être analysées en mode MALDI-2 (taux de répétition laser de 1 k Hz) chaque seconde.

6. Traitement des données

REMARQUE : Les progiciels commerciaux existants ne sont pas bien adaptés à l’analyse des données de spectrométrie de masse à cellule unique à haut débit. Bien que les spectres individuels puissent être visualisés, l’extraction d’informations biologiques significatives nécessite des outils spécialisés. Pour résoudre ce problème, nous fournissons un logiciel disponible gratuitement qui facilite l’analyse des données MALDI-2 MS à cellule unique. Notre flux de travail mis à jour facilite la conversion directe des données unicellulaires au format open source imzML²⁷, ce qui permet une compatibilité avec SCiLS MVS et d’autres logiciels de fournisseurs. Pour une analyse de données plus avancée, le script complet inclut également des fonctionnalités d’annotation de lipides, de clustering et d’autres outils de visualisation activés par Matplotlib (version 3.7.3). L’analyse et la lecture des données brutes sont facilitées par la bibliothèque pyTDFSDK, un ensemble de fonctions englobées dans le flux de travail TIMSCONVERT²⁸.

1. Initialisez la bibliothèque Python personnalisée SC_MALDI2_Analysis en copiant le fichier fourni dans le fichier supplémentaire 1 dans le même chemin de travail que Jupyter Notebook, puis appuyez sur Maj + Entrée sur le clavier de la première cellule de code. Cela nous permettra d’appeler ces fonctions ultérieurement et de les utiliser pour traiter les données.
2. Copiez le chemin d’accès aux données collectées (fichiers .d Bruker). Nous vous recommandons de nommer les dossiers et les noms de chaque fichier de manière descriptive afin de pouvoir analyser ces chemins d’accès ultérieurement afin d’établir des métadonnées pour chaque échantillon. Exécutez la section Importation des fichiers .d Bruker et enregistrez-les dans une cellule de code de liste. Cela affichera le nombre total de fichiers .d chargés.
3. Exécutez la cellule de code intitulée Traitement des données brutes et enregistrement dans imzML. Cela permettra de lire chaque fichier .d Bruker fourni, d’effectuer une sélection de pic sur les données, puis d’enregistrer 20 ppm de données autour de chaque pic dans un fichier .imzML écrit à l’intérieur du fichier .d.
   1. Pour trouver les données enregistrées, ouvrez l’emplacement du premier fichier .d et l’imzML et les autres métadonnées seront enregistrés dans ce chemin. À ce stade, le fichier imzML enregistré peut être importé dans un logiciel du fournisseur, tel que SCiLS Lab MVS. Pour une analyse de données plus avancée, continuez à suivre le script.
4. Chargez les données imzML enregistrées en exécutant la cellule de code Chargement dans le fichier imzML précédemment enregistré. Cela charge les données enregistrées dans les données variables.
5. Exécutez la cellule de matrice de regroupement des données et d’enregistrement des données pour regrouper toutes les données le long d’un axe m/z commun, supprimer les entités présentes en faible abondance (<0,1 %) et supprimer les valeurs inférieures au bruit (intensité relative de 100). Cette fonction réintègre ensuite les données en faisant la moyenne de chaque valeur maximale m/z dans chaque compartiment. La matrice de données résultante est enregistrée en tant que datacube_array, les emplacements m/z associés à la matrice sont enregistrés en tant que valid_mz_bins et le nombre de chaque emplacement est enregistré en tant que nombre.
6. Pour annoter les données, exécutez la cellule d’annotation Exporter des pics pour les CARTES LIPIDIQUES . Cela copiera tous les pics m/z de votre matrice de données dans votre presse-papiers. Collez-le dans un fichier texte vide et enregistrez-le pour le télécharger sur LIPID MAPS.
7. Ouvrez lipidmaps.org, puis sélectionnez Recherche en masse de données MS et Rechercher LMSD pour rechercher des espèces lipidiques biologiquement pertinentes. Téléchargez la liste des pics en choisissant le fichier texte et en sélectionnant les adduits appropriés (par exemple, [M+H]+, [M+Na]⁺ et [M+K]⁺). Sélectionnez la tolérance de masse appropriée pour votre spectromètre de masse (nous avons choisi +/- 0,01 m/z), sélectionnez toutes les classes de lipides d’intérêt et cliquez sur Rechercher. Téléchargez le fichier .tsv.
8. Chargez les métadonnées des spectres en exécutant l’option Chargement dans les chemins d’accès aux cellules individuelles pour les cellules de métadonnées . Modifiez le code fractionné ici en fonction des structures du chemin d’accès au fichier.
9. Prétraitez les données en exécutant la cellule Prétraitement des données et annotation lipidique . Cela utilisera le fichier lipidMAPS tsv pour annoter l’ensemble de données à une erreur de 10 ppm, éliminer les lipides de la chaîne impaire des résultats lipidMAPS, normaliser les données restantes et supprimer les caractéristiques ou les cellules qui ne dépassent pas un seuil spécifique. Cela enregistrera le nouvel ensemble de données traité en tant que data2 et les métadonnées spectrales mises à jour en tant que updated_cell_types.
10. L’analyse des données est effectuée par scanpy. Exécutez la cellule UMAP et l’analyse de clustering pour les cellules uniques pour sélectionner les données d’intérêt (ici, nous avons sélectionné uniquement les données MALDI-2, M2), mettre à l’échelle l’ensemble de données et le charger dans un objet AnnData scanpy pour faciliter les analyses.
    REMARQUE : Ici, le clustering et la réduction de dimensionnalité (UMAP) de Leiden ont été effectués sur l’ensemble de données, les classes de données d’origine et les clusters sur l’UMAP ont été visualisés, et certaines des caractéristiques les plus statistiquement significatives parmi les clusters ont été résumées à l’aide de la fonction rank_genes_groups_dotplot de scanpy.

Résultats

La figure 1 présente une vue d’ensemble du flux de travail pour la spectrométrie monocellulaire MALDI-2 guidée par fluorescence. Tout d’abord, le tissu disséqué à partir de régions cérébrales ciblées (Figure 1A) est dissocié en cellules uniques et déposé sur des lames de microscopie conductrices recouvertes d’ITO (Figure 1B). L’emplacement des cellules est déterminé par imager...

Discussion

La MALDI MS unicellulaire à haut débit et guidée par l’image est un outil précieux pour comprendre l’hétérogénéité chimique à l’échelle d’une seule cellule. L’ajout de la post-ionisation induite par laser (MALDI-2) fournit une couverture analytique plus profonde, ce qui est essentiel pour les échantillons à masse et en volume limités, tels que les cellules de mammifères isolées.

Alors que l’écrasante majorité des flux de travail p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',5'-dihydroxyacetophenone	Sigma Aldrich	D107603	DHAP, 97% purity
Ammonium acetate	Sigma Aldrich	238074	ACS reagent, ≥97%
Axio M2 Imager	Zeiss	N/A	N/A
Biopsy punch, 2 mm	Fisher Scientific	12-460-399	integra miltex standard biopsy punch, 2mm
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901	anhydrous, powder ≥97%
Eppendorf Centrifuge	Sigma Aldrich	EP5405000441	centrifuge 5425 with rotor FA-24x2
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1272	liquid, BioReagent
Glass etching pen	Sigma Aldrich	Z225568	carbide time, pkg of 1
Glycerol	Sigma Aldrich	G7893	ACS reagent, ≥99.5%
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H3375	≥99.5% (titration)
Hoechst 33258 Solution	Sigma Aldrich	94403	1 mg/mL in H2O, ≥98.0% (HPLC)
In line HEPA Filter	Sigma Aldrich	WHA67225001	VACU-GUARD 60 mm disc, 0.45 PFTE housing
ITO-Coated Microscopy Slides	Delta Technologies	CG-90IN-S115	70-100Ω resistance
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M8266	anhydrous, ≥98%
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	208094	anhydrous, ≥97%
Microcentrifuge tubes	Sigma Aldrich	HS4323K	tube capacity 1.5 mL, pack of 500
Papain dissociation system	Worthington Biochemical	LK003150	one box, 5 single use vials
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458	liquid, BioReagent
Potassium chloride	Sigma Aldrich	529552	Molecular biology grade
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379	Reagent Plus
Sodium biocarbonate	Sigma Aldrich	S6014	ACS reagent, ≥99.7%
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888	ACS reagent, ≥99%
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	221465	ACS reagent, ≥97%, pellets
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9763	ACS reagent, ≥99%
Sublimate	HTX	N/A	N/A
timsTOF FleX MALDI-2	Bruker	N/A	microGRID enabled
Vacuum tubing	Thermo Scientific	8701-0080	Nalgene Non-phthalate PVC Tubing