جنين الدجاج كنموذج في الجسم الحي لإحياء مسببات الأمراض القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة

Summary

تعرض هذه الطريقة جنين الدجاج كنموذج بسيط وفعال من حيث التكلفة في الجسم الحي لإحياء العامل الممرض البكتيري L. monocytogenes من حالة قابلة للحياة ولكنها غير قابلة للزراعة (VBNC) ومع استخدامات أخرى محتملة في فهم آليات السكون البكتيري.

Abstract

ظهر جنين الدجاج كنموذج شائع في الجسم الحي مع زيادة التطبيق في البحوث الطبية الحيوية نظرا لبساطته وقدرته على تحمل التكاليف وقدرته على التكيف في دراسة الظواهر البيولوجية المختلفة. تم استخدام هذا النموذج للتحقيق في الإمراضية الميكروبية وأصبح أداة مفيدة لدراسة السكون البكتيري. الحالة القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة (VBNC) هي حالة نائمة تصبح فيها البكتيريا هادئة من الناحية الأيضية ومقاومة للزراعة للحفاظ على قدرتها على البقاء في البيئات القاسية. في ظل ظروف مواتية ، يمكن لبكتيريا VBNC أن تستيقظ مرة أخرى في حالة نشطة وقابلة للزراعة من الناحية الأيضية. تعد مسببات الأمراض البكتيرية التي تتحول إلى حالة VBNC ، مثل داء الليستريات المسبب لليستيريات المنقولة بالغذاء ، مصدر قلق للصحة العامة ، لأنها تتجنب الكشف عن طريق الطرق التقليدية المعتمدة على النمو ويمكنها استعادة ضراوتها عند إحيائها. هذا يحث على فهم أفضل للظروف والآليات التي تدفع إحياء مسببات الأمراض VBNC. تعرض الطريقة المعروضة هنا جنين الدجاج كنموذج فعال في الجسم الحي لإحياء VBNC L. monocytogenes مرة أخرى إلى حالة قابلة للزراعة. حيث كانت محاولات الإحياء في المختبر ، التي تعتمد إلى حد كبير على التجديد الغذائي ، غير منتجة ، ينجح هذا البروتوكول في تعزيز إعادة تنشيط أشكال VBNC التي تعاني من نقص جدار الخلية من L. monocytogenes الناتجة عن الجوع في المياه المعدنية. الأهم من ذلك ، أن النتائج التي تم الحصول عليها تؤكد على متطلبات الجنين لإحياء VBNC L. monocytogenes ، مما يشير إلى دور مهم للعوامل المرتبطة بالجنين في هذه العملية. تشمل الاستخدامات المحتملة الأخرى لهذه الطريقة فحص وتحديد العوامل البكتيرية المتورطة في آليات إحياء حالة VBNC. وبالتالي يمكن أن يوفر هذا النموذج نظرة ثاقبة للأعمال الجزيئية للسكون البكتيري ، الذي تعتبر معرفته أمرا بالغ الأهمية للحد من مخاطر الصحة العامة التي تنطوي عليها مسببات الأمراض التي لا يمكن اكتشافها.

Introduction

في البحث عن نماذج بحثية بديلة في الجسم الحي ، مع انخفاض التكاليف المرتبطة والاعتبارات اللوجستية والأخلاقية ، ظهر جنين الدجاج وسرعان ما أصبح أحد أكثر أنظمة نماذج الفقاريات قابلية للتطبيق وقابلية للإدارة وقابلية للتكرار في الجسم الحي ^1،2. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الأخرى ، مثل القوارض والأرانب ، فإن بيض الدجاج المخبض غير مكلف للحصول عليه ولا يتطلب أي لوجستيات سكنية معقدة لتطويره. علاوة على ذلك ، يتيح حجم بيضة الدجاج التعامل مع العديد من الأجنة بالتوازي ، مما يدعم عددا كبيرا من ظروف / مجموعات الاختبار التجريبية والتكرار. إن مدة التطور الجنيني القصيرة (21 يوما) وبساطة الوصول إلى الجنين والهياكل المرتبطة به ومراقبته في أي مرحلة من فترة النمو تجعل هذا نموذجا مفيدا في مجموعة متنوعة من المجالات ، مثل علم الأحياء التنموي (على سبيل المثال ، تكوين القلب والدماغ) ^3،4 وعلم الأدوية (اختبار نشاط الدواء وتوصيله وسميته) ^{1،5 ، 6}. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الجهاز المناعي غير الناضج لجنين الدجاج يجعله نظاما مناسبا للدراسات القائمة على المناعة والأساليب المتعلقة بأبحاث^{السرطان 7}. الأهم من ذلك ، نظرا للطبيعة الجنينية لهذا النموذج ، الذي يكتسب فقط نظاما ناضجا للألم بحلول اليوم التنموي 13-14⁸ ، فإن التطبيقات البحثية التي يتم إجراؤها خلال هذا الإطار الزمني ليست مقيدة بالمخاوف القانونية^{والأخلاقية 7}.

كما تم استخدام نموذج جنين الدجاج على نطاق واسع لدراسة إمراضية الميكروبات المسببة للأمراض لدى البشر والثدييات الأخرى. في الواقع ، استكشفت العديد من الدراسات هذا النموذج والتحقق من صحته للتحقيق في ضراوة الأوليات (على سبيل المثال ، Neospora caninum و Eimeria tenella و Cryptosporidium spp.)^9،10،11 ، الفطريات (على سبيل المثال ، المبيضات البيضاء ، الرشاشيات الدخانية) ^12،13 ، والأنواع البكتيرية (على سبيل المثال ، المكورات المعوية ، السالمونيلا المعوية ، الفرنسييلا النيابية ، العطيفة الصائمية ، المطثية perfringns ، الليستيريا المستودية ، النيسرية البنية ، المكورات العنقودية الذهبية)^{10 ، 14،15،16،17،18،19،20،21،22} ، وكذلك لاختبار التأثير العلاجي للمركبات المضادة للميكروبات^17،23.

غالبا ما تتعرض الكائنات الحية الدقيقة ، مثل تلك المذكورة أعلاه ، لمحفزات مرهقة في بيئتها (بيئاتها) ، وبالتالي ، طورت استراتيجيات للتعامل مع الإجهاد لتحمل المواقف الضارة / المميتة. يمكن لبعض الأنواع البكتيرية أن تنتج هياكل عالية المرونة ونائمة من الناحية الأيضية تسمى الأبواغ الداخلية ، والتي تحافظ على السلامة الخلوية والوراثية في ظل قيود بيئية شديدة. إذا تم جمع الظروف البيئية المواتية ، يمكن أن تتجدد الأبواغ الداخلية إلى خلايا نشطة قابلة للحياة عن طريق الإنبات²⁴. ومع ذلك ، قد تدخل البكتيريا غير الأبواغية في حالة نائمة بديلة من الناحية الأيضية تسمى قابلة للحياة ولكنها غير قابلة للزراعة (VBNC) ، والتي تتمثل سماتها المظهرية الرئيسية في فقدان القدرة على الزراعة في وسائط النمو الروتينية²⁵. بالنظر إلى أن جزءا كبيرا من > 100 نوع بكتيري تم الإبلاغ عن دخولها إلى حالة VBNC هي مسببة للأمراض للإنسان الأخرى²⁶ ، وأن مسببات الأمراض VBNC قد تنتعش مرة أخرى إلى حالة نشطة وخبيثة من الناحية^{الأيضية 25،26} ، فإن فشل الأساليب التقليدية القائمة على النمو للكشف عن مسببات الأمراض VBNC هو قضية صحية عامة مقلقة. لم يتم فهم الإشارات البيئية والآليات الجزيئية والفسيولوجية التي تقود عملية الإحياء هذه جيدا وقد تختلف باختلاف الأنواع الميكروبية والإجهاد (الإجهادات) التي تحفز حالة VBNC.

استفاد الباحثون من خصوصيات نموذج جنين الدجاج للتحقيق في قدرة إحياء مسببات الأمراض البكتيرية في الجسم الحي في حالة VBNC. المستمدة من الإنسان C. العزلات الصائمية ، التي دفعت إلى حالة VBNC بسبب الحرمان الغذائي من الماء ، استعادت قابليتها للزراعة والضراوة في الخلايا البشرية بعد مرورها في بيض الدجاج المجنم²⁷. وبالمثل ، تم الإبلاغ أيضا عن محاولات ناجحة لاستعادة حالة VBNC لمسببات الأمراض الأخرى ، مثل Edwardsiella tarda²⁸ و Legionella pneumophila²⁹ و L. monocytogenes³⁰.

لقد أبلغنا مؤخرا أنه عندما يتم دفع L. monocytogenes إلى حالة VBNC عن طريق الجوع في المياه المعدنية ، فإنه يتحول من خلية على شكل قضيب إلى خلية كوكويد. كشفنا أن هذا التحول المورفولوجي ناتج عن التلف التراكمي لجدار الخلية ، مما يؤدي إلى تساقطه بالكامل بواسطة البكتيريا ، والتي تصبح بعد ذلك خلية كروية تعاني من نقص في جدار^{الخلية 31}. أدت محاولاتنا الفاشلة لإحياء أشكال VBNC L. monocytogenes الخالية من الجدران في المختبر ، باستخدام أساليب تجديد المغذيات ، إلى التحقيق في إنقاذها المحتمل في الجسم الحي. نظرا لاستخدامه الواعد مع L. monocytogenes³⁰ ، اخترنا نموذج جنين الدجاج لهذه المهمة. أكدت النتائج قدرة نظام بيض الدجاج المجنم على تعزيز استعادة VBNC L. monocytogenes التي تعاني من نقص في جدار الخلية إلى حالة نشطة قابلة^{للزراعة 31}.

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يتيح إحياء L. monocytogenes في الجسم الحي من حالة VBNC الخاملة من خلال التعرض لبيئة بيض الدجاج الجنين. نصف تحضير ومراقبة بيض الدجاج وبكتيريا VBNC ، وتلقيح البيض ، ومعالجة البويضات الجنخة وغير المضغوطة ، وتسجيل العبء البكتيري القابل للزراعة لتقييم كفاءة إحياء خلايا VBNC. تؤكد النتائج على جنين الدجاج كنموذج بسيط وفعال من حيث التكلفة ومناسب لفهم الآليات التي تحكم الجوانب المختلفة للحياة الميكروبية ، مثل السكون البكتيري. يمكن استكشاف هذا النظام في الجسم الحي بشكل أكبر للتحقيق في مساهمة الجينات البكتيرية الفردية في عملية القيامة.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية المؤسسية الفرنسية (المرسوم رقم 2013-118) والأوروبية (التوجيه 2010/63 / EU) المعمول بها لاستخدام في البحوث. علاوة على ذلك ، بموجب القانون الفرنسي (المرسوم رقم 2020-274) ، لا يهتم هذا البروتوكول بالقيود الأخلاقية لأن جميع التجارب على أجنة الدجاج يتم إجراؤها وإكمالها قبل الفترة الثالثة الأخيرة من التطور الجنيني (أي قبل اليوم 14).

1. تحضير بكتيريا VBNC

1. سلالات بكتيرية متسلسلة من مخزون الجلسرين (المخزنة عند -80 درجة مئوية) على وسائط أجار ضخ القلب في الدماغ (BHI) باستخدام حلقات التلقيح. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية للحصول على مستعمرات معزولة.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر ، استكمل وسط الأجار بالمضادات الحيوية التي تمتلك السلالة (السلالات) مقاومة لها (إما بشكل طبيعي أو عن طريق التعديل الجيني).
2. لكل سلالة ، قم بإعداد 2-3 أنابيب مع 5 مل من مرق BHI واستخدم حلقة تلقيح للتلقيح ب 2-3 مستعمرات. احتضان المزارع طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع التحريض (200 دورة في الدقيقة) لنمو البكتيريا حتى المرحلة الثابتة. سيتم استخدام كل من هذه الثقافات لإعداد مكررات بيولوجية مستقلة من المعلقات البكتيرية VBNC.
3. قم بتخفيف كل ثقافة 1:10 في مرق BHI وقياس الكثافة الضوئية في مقياس الطيف الضوئي بطول موجي 600 نانومتر (OD₆₀₀). تتراوح قيمة OD₆₀₀ لمزارع الطور الثابتة المزروعة على النحو الأمثل من Listeria monocytogenes بين 2 و 4. هذا يعادل تركيز بكتيري يبلغ 2-4 × 10⁹ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل.
4. بيليه 1 مل من الثقافة البكتيرية في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي عند 6,000 × جم لمدة دقيقتين. شفط المادة الطافية باستخدام مضخة تفريغ. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المياه المعدنية المعقمة والمفلترة.
5. اغسل البكتيريا جيدا عن طريق تكرار الخطوة 1.4 ثلاث مرات. هذا يضمن الإزالة الكاملة للمغذيات المتوسطة المزروعة التي من شأنها أن تؤخر تكوين بكتيريا VBNC.
6. قم بإعداد المعلقات البكتيرية بتركيز يبدأ من 10⁶ CFU / مل عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من البكتيريا المغسولة إلى قوارير زراعة الخلايا T25 التي تحتوي على 30 مل من المياه المعدنية.
7. امزج المعلقات باستخدام ماصة مصلية. قم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة ، تحت ظروف الإضاءة الثابتة (قارورة في وضع رأسي) وخافتة.

2. مراقبة تكوين بكتيريا VBNC

1. حدد السكان القابلين للزراعة في المعلقات البكتيرية^{في اليوم الأول} (مباشرة بعد التحضير) ثم على أساس أسبوعي ، كما هو موضح أدناه.
   1. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف من المعلق البكتيري VBNC في المياه المعدنية (من ^10-1 إلى ^10-3 تخفيفات). صفيحة 100 ميكرولتر من المعلق غير المخفف وكل مخفف ، في نسختين ، على أجار BHI واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: عندما تقترب القابلية للزراعة < 1 CFU / مل ، يجب طلاء حجم أكبر (0.5-2 مل) من المعلق غير المخفف لتأكيد وجود / عدم وجود بكتيريا قابلة للزراعة.
   2. احسب تركيز البكتيريا القابلة للزراعة على النحو التالي:
      تركيز البكتيريا القابلة للزراعة (CFU / mL) = (متوسط عدد المستعمرات × عامل تخفيف العينة) / حجم العينة المطلي (بالمل).
2. تحديد السكان القابلين للحياة في المعلقات البكتيرية^{في اليوم الأول} (مباشرة بعد التحضير) ثم على أساس أسبوعي ، كما هو موضح أدناه.
   1. احتضان عينة من المعلق البكتيري (أي بتركيز حوالي 10⁶ خلايا / مل) بصبغة البقاء 5 (6) -كربوكسي فلوريسين ثنائي الأسيتات (CFDA) بتركيز نهائي يبلغ 30 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة في الظلام. قم أيضا بإعداد عينة بدون CFDA (تحكم غير ملطخ) وعينة معالجة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الحضانة باستخدام CFDA (التحكم في الخلايا الميتة غير القابلة للحياة).
   2. قم بتحليل العينات في مقياس التدفق الخلوي المجهز بليزر إثارة 488 نانومتر وكاشف انبعاث 520 نانومتر لمضان CFDA. للحصول على المتانة الإحصائية ، احصل على حوالي 1 × 10⁵ أحداث بكتيرية لكل عينة (وهذا يترجم إلى حجم عينة مكتسبة من 10-100 ميكرولتر) بمعدل تدفق لا يقل عن 30 ميكرولتر / دقيقة.
   3. استخدم العينة غير الملوثة للعثور على الأحداث المرتبطة بالبكتيريا وإبقائها في مخطط التشتت الأمامي ذي الحجم اللوغاريتمي (FSC) مقابل مخطط التشتت الجانبي (SSC). ارسم الأحداث البكتيرية المسورة في رسم بياني مضان CFDA ذو الحجم اللوغاريتمي واستخدم عينات الخلايا غير الملوثة وغير القابلة للحياة / الميتة لتمييز المجموعات القابلة للحياة (إيجابية CFDA) عن المجموعات غير القابلة للحياة (سلبية CFDA).
   4. احسب تركيز البكتيريا القابلة للحياة على النحو التالي:
      تركيز البكتيريا القابلة للحياة (الخلايا / مل) = متوسط عدد الأحداث الإيجابية لعقود الفروقات في العينة المكتسبة / حجم العينة المكتسبة (بالمل)
      ملاحظة: اعتمادا على نموذج مقياس الخلوي ، قد يتطلب القياس الكمي للخلية استخدام حبات عد قياس التدفق الخلوي.

3. حضانة البيض

1. عند الاستلام من المورد ، اترك البويضات المخصبة في درجة حرارة الغرفة حتى اليوم التالي.
2. في غضون ذلك ، املأ خزان المياه في حاضنة البيض بالماء منزوع الأيونات وقم بتشغيل الطاقة. اضبط درجة الحرارة على 37.7 درجة مئوية والحد الأقصى للرطوبة النسبية على 47٪.
   ملاحظة: في أيدينا ، يتم تحضين البيض في نطاق رطوبة نسبية يتراوح بين 38٪ و 42٪ ، مع عدم وجود تأثير واضح على معدل التطور الجنيني المتوقع ونجاحه.
3. انقل البويضات إلى الحاضنة لبدء التطور الجنيني. ضعها على صينية (صواني) الحاضنة بحيث يكون الجيب الهوائي متجها لأعلى (أي الطرف المدبب متجها لأسفل).
4. احتضن البيض لمدة 6 أيام. بعد 4 أيام ، قم بتمييز البيض الحي الجنين عن البيض الميت أو غير المضموم عن طريق الشمع.
   1. ضع البيضة تحت / فوق مصدر ضوء قوي (شمعة) لإضاءة الداخل وتمييز محتواها بصريا. بعد 3 أو 4 أيام من الحضانة ، يعرض البيض الجنين الحي شبكة من الأوعية الدموية تتوسع لأسفل من الجيب الهوائي. تبدو هذه الشبكة منهارة وغير منظمة في البويضات الجنينية الميتة وهي غائبة تماما في البويضات التي فشلت في بدء التطور الجنيني. إذا كان مرئيا ، فقد يظهر الجنين الحي حركة ارتعاش (الشكل 1).

4. تحضير البيض للتلقيح

1. في يوم التلقيح ، قم بشمعة البيض لتحديد العدد المتاح للبويضات المنحنة وغير المضغوطة القابلة للحياة. حدد البويضات غير الجنطة (حوالي 10٪ -20٪ من العدد الإجمالي) وأي بويضات بها أجنة ميتة ، كما هو موضح في الخطوة 3.4. تخلص من هذا الأخير وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للتخلص من النفايات البيولوجية.
2. ضع علامة على بقعة الحقن على قشر البيض عند 2-5 مم فوق حدود الجيب الهوائي (الشكل 2 أ). قم بتطهير هذه المنطقة عن طريق فرك المناديل الورقية المنقوع بنسبة 70٪ (v / v) من الإيثانول.
3. باستخدام إبرة 18G ، قم بعمل ثقب بعناية على القشرة في مكان الحقن دون اختراق غشاء القشرة (الشكل 2 ب). تطهير بقعة الحقن بمناديل ورقية مبللة ب 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول.

5. تلقيح البيض

1. قم بتوصيل إبرة 25G (0.5 مم × 16 مم) في حقنة سعة 1 مل واملأها بتعليق بكتيري VBNC. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة فقاعات الهواء الملتصقة بالجدار الداخلي للحقنة عن طريق النقر عليها بإصبع.
2. إجراء التلقيح بالمياه المعدنية وحدها أو تعليق L . monocytogenes (5 × 10³ CFU / mL) المزروعة بين عشية وضحاها في مرق BHI كظروف تحكم للعقم والنمو المستمد من البكتيريا القابلة للزراعة ، على التوالي.
3. أدخل الإبرة من خلال القشرة المثقوبة في مكان الحقن وأدخلها بالكامل ، بزاوية عمودية ، حتى تلامس قاعدة الإبرة سطح القشرة (الشكل 2 ج). هذا يضع طرف الإبرة لتوصيل محتوى المحقنة إلى التجويف الآلانتوي (في البويضات المضغونة) أو الزلال (في البويضات غير المجنمنة).
4. حقن 100 ميكرولتر من اللقاح بعناية وببطء. حافظ على زاوية الإبرة ثابتة قدر الإمكان عند وجودها داخل بويضة مجغرة لتجنب التسبب في إصابات مميتة للجنين.
5. قم بإزالة الإبرة بحذر وببطء وقم بتغطية بقعة الحقن بملصق دائري لإغلاق موقع دخول التلقيح. للراحة والوضوح ، استخدم ملصقات بلون مختلف لكل حالة / مجموعة من البيض.
6. أعد البيض الملقح إلى الحاضنة لمدة يومين إضافيين. تأكد من أن البويضات التي تحتوي على أجنة نامية ليست خارج الحاضنة (أو عند درجة حرارة أقل من 37.7 درجة مئوية) لأكثر من 30 دقيقة. قم بإجراء التلقيح على دفعات ، إذا لزم الأمر.

6. تقييم وجود خلايا قابلة للزراعة في عينات التلقيح

1. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من المعلق البكتيري VBNC في آبار متعددة من صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا. احسب عدد الآبار ≥ 2 × عدد البويضات الملقحة (الجنبة + غير المجنمة).
2. في حالة استخدام شروط التحكم المذكورة في الخطوة 5.2 ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من كل لقاح (أي المياه المعدنية أو البكتيريا القابلة للزراعة) في ثلاثة آبار على الأقل في نفس الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئر.
3. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من وسط BHI إلى كل بئر من الآبار المعدة في الخطوتين السابقتين.
4. احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة لتعزيز نمو البكتيريا في الآبار التي تحتوي على بكتيريا قابلة للزراعة. اعتمادا على وجود البكتيريا القابلة للزراعة ومعدل إعادة نموها في هذه الظروف ، قد يكون من الضروري يوم حضانة واحد أو أكثر للكشف الكامل عن الآبار التي تحتوي على بكتيريا قابلة للزراعة.
5. لكل لقاح ، افحص بصريا واحسب عدد الآبار التي تسجل إيجابيا وسلبيا لنمو البكتيريا.

7. مراقبة صلاحية الجنين

1. في اليوم التالي للتلقيح ، قم بشمعة البويضات الجنينية للتحقق من فتك الجنين.
2. ضع البويضات التي تحتوي على أجنة ميتة جانبا وتخلص منها وفقا للإرشادات المؤسسية للتخلص من النفايات البيولوجية المصابة.

8. معالجة البويضات المضغوطة

1. استرجع البويضات الجنينية من الحاضنة والشمعة للتحقق من فتك الأجنة. تخلص من الأجنة الميتة ولا تعتبرها في النتائج النهائية.
2. قم بإزالة الملصق من البيضة وقم بتطهير الطرف العلوي من القشرة (الذي يغطي الجيب الهوائي) بالمناديل الورقية المنقوع بنسبة 70٪ (حجم حجم / حجم) من الإيثانول.
3. باستخدام مقص تشريح نظيف ، اقطع القشرة من مكان الحقن لكشف الجيب الهوائي. باستخدام زوج نظيف من ملاقط التشريح ، قم بتمزيق غشاء القشرة الداخلي الذي يفصل الجيب الهوائي عن باقي البيضة.
4. أفرغي محتويات البيض بحذر في طبق بتري معقم. باستخدام زوج من الملقط ، قم بعزل الجنين ونقله إلى طبق بتري جديد. اغسل الجنين باستخدام PBS معقم ، إذا لزم الأمر.
5. نقل الجنين إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من PBS المعقم. فصل الجنين باستخدام الخالط (السرعة: 10,000 دورة في الدقيقة). قم بتنظيف طرف أداة التشتت بين كل تجانس عن طريق تمريره بالتتابع في PBS المعقم ، و 70٪ (v / v) الإيثانول ، ومرة أخرى PBS المعقم.
6. لوحة 500 ميكرولتر من الجنين متجانس على BHI agar. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية طوال الليل (أو لفترة أطول ، إذا لزم الأمر).
   ملاحظة: اختياريا ، يمكن طلاء التخفيفات التسلسلية للمتجانس في حالة توقع ارتفاع أعداد CFU (أي > 300) في المتجانس غير المخفف.
7. لكل مجموعة تلقيح ، احسب عدد البويضات التي سجلت إيجابيا وسلبيا لنمو L. monocytogenes على ألواح أجار.
   ملاحظة: على الرغم من الظروف المعقمة التي يتم فيها استخراج الأجنة وتجانسها ، فإن استخدام وسط أجار غير انتقائي لطلاء تجانس الأجنة ينطوي على خطر نمو الملوثات. يمكن أن يؤدي استخدام وسط نمو خاص بالجنس / الأنواع أو التكملة بمضاد حيوي انتقائي (لا تقاوم له سوى السلالة البكتيرية المختبرة) إلى تقليل أو منع هذا التلوث.

9. معالجة البويضات غير المضغوطة

1. استرجع البويضات غير المجنمة من الحاضنة. كرر الخطوتين 8.2 و 8.3 للوصول إلى زلال البيض.
2. باستخدام ماصة دقيقة ، اجمع 500 ميكرولتر من الزلال ووزعها مباشرة على أجار BHI. احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية طوال الليل أو لفترة أطول ، إذا لزم الأمر.
3. لكل مجموعة تلقيح ، احسب عدد البويضات التي سجلت نتيجة إيجابية لنمو L. monocytogenes على ألواح أجار.

النتائج

لاختبار إمكانات نموذج جنين الدجاج لإحياء أشكال VBNC التي تعاني من نقص جدار الخلية من L. monocytogenes الناتجة عن الجوع في المياه المعدنية ، كان من المهم توضيح توقيت تحضير اللقاح البكتيري VBNC (≥ 28 يوما) مع البويضات المجنمة (6 أيام). وهكذا تم إعداد المعلقات المكررة ل L. monocytogenes بتركيز 1 × 10⁶ CFU / مل في المياه المعدنية قبل 28 يوما من يوم تلقيح البويضات المخطط له. وقد تبين أن هذا التركيز البكتيري بداية يؤدي إلى الثقافة المتبقية المرغوبة من <1 CFU/مل بعد 28 أيام³¹. أدى التحقق النهائي من قابلية الخلايا البكتيرية ومستويات البقاء في المعلقات إلى اختيار VBNC L. monocytogenes لقاح يحتوي على 1 × 10⁶ خلايا قابلة للحياة و 0.5 خلية قابلة للزراعة لكل مل. للتجريب ، تم تسليم 100 ميكرولتر من هذا اللقاح (أي 1 × 10⁵ خلايا قابلة للحياة و < 0.1 وحدة تشكيل مستعمرة) في مجموعات من البويضات الملتغربة وغير المجنمنة. تم تحضير المجموعات الضابطة بالتوازي عن طريق حقن البويضات المجربة وغير المضغوطة بنفس حجم الجرعة من المياه المعدنية أو معلق 5 × 10³ CFU / مل من L. monocytogenes المزروع بين عشية وضحاها في مرق BHI.

في 2 أيام بعد التلقيح ، تمت معالجة البيض لتقييم وجود L. monocytogenes القابلة للزراعة. كما هو متوقع ، لم يتم استرداد أي نمو بكتيري من بيض مجموعة التحكم في العقم المحقون بالمياه المعدنية ، في حين أن 100٪ من البيض من المجموعة الضابطة المعالجة ب L. monocytogenes القابل للزراعة سجلت نتائج إيجابية للنمو على وسائط أجار (الجدول 1). الأهم من ذلك ، أن جميع الأجنة المستردة من البويضات الملقحة ببكتيريا VBNC أدت إلى نمو L. monocytogenes على اللوحة ، على النقيض من غيابها التام على كل صفيحة منتشرة مع محتوى البويضة غير المجنمة المحقونة بنفس بكتيريا VBNC (الجدول 1). تؤكد هذه النتيجة على متطلبات جنين الدجاج لعملية إيقاظ VBNC L. monocytogenes ، كما ورد سابقا³⁰.

لتحديد احتمالية أن L . monocytogenes النمو الذي تم استرداده من البويضات المضغنة المحقونة ببكتيريا VBNC يأتي من استعادة حقيقية لخلية VBNC ، وليس من إعادة نمو الخلايا القابلة للزراعة العالقة ، من الضروري مقارنة تواتر جرعات اللقاح التي تنتج نموا بكتيريا قبل وبعد مرور البويضة. للحصول على الأول ، تم خلط جرعات متعددة من 100 ميكرولتر من اللقاح البكتيري VBNC مع BHI ، وهو وسط غني بالمغذيات لا يدعم VBNC L. monocytogenes revival³² ، في صفيحة 96 بئرا وتحضنها عند 37 درجة مئوية. اختلف تواتر 9.5٪ من آبار BHI الملقحة إيجابية للنمو البكتيري (8 في 84) اختلافا كبيرا (اختبار فيشر الدقيق ، ص = 1.6 × ^10-17) عن تكرار 100٪ من البيض الذي يظهر البكتيريا القابلة للزراعة المستردة (الجدول 1). يشير هذا الاختلاف الجوهري والذو دلالة إحصائية بقوة إلى أن L. monocytogenes الذي تم استرداده من البويضات الجنينية كان يرجع إلى حد كبير إلى إعادة تنشيط بكتيريا VBNC. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس أشكاله الخضرية ، VBNC L. monocytogenes لم تكن قادرة على الانتعاش في البويضات غير المجربة ، مما يدعم أن إحياء خلايا VBNC في البويضات الجنطة لا يرجع إلى البكتيريا المتبقية القابلة للزراعة في اللقاح.

الشكل 1: التمييز بين بيض الدجاج غير الجنين والميت والجنين الحي عن طريق التشميع. يتم تحديد حالة التطور الجنيني عن طريق إضاءة البويضة بمصدر ضوء (شمعة البيض) من مسافة قريبة. يظهر البيض الذي يحتوي على جنين حي نامي (مرئي أم لا) شبكة قوية من الأوعية الدموية تتوسع لأسفل من الجيب الهوائي تبدو هذه الشبكة منهارة وغير منظمة في البويضات ذات الأجنة الميتة وهي غائبة تماما في البويضات التي فشلت في بدء التطور الجنيني. تم إنشاؤه في BioRender.com. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحضير البويضة للتلقيح. (أ) يتم تمييز موقع الحقن في موضع 2-5 مم فوق حدود الجيب الهوائي ، كما يتضح من التشميع. (ب) يتم ثقب القشرة في موقع الحقن بمساعدة طرف إبرة 18G دون ثقب غشاء الغلاف الخارجي. (ج) يتم توصيل اللقاح من خلال إبرة 25 جم (0.5 مم × 16 مم) إلى السائل الآلانتوي في البويضات المضغربة أو الزلال في البويضات غير الجنينة. تم إنشاؤه في BioRender.com. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لقاح	قابلية الزراعة قبل مرور البويضةأ	القابلية للزراعة بعد مرور البيضب
		البويضات المضغوطة	قيمة pج	البويضات غير المضغوطة	القيمة الاحتماليةD
المياه المعدنية	0/3 (0%)	0/10 (0%)	>0.999	0/10 (0%)	>0.999
في بي إن سي إل إم	8/84 (9.52%)	24/24 (100%)	1.63إ-17	0/18 (0%)	0.344
LM قابل للزراعة	3/3 (100%)	8/8 (100%)	>0.999	2/2 (100%)	>0.999
أعدد آبار BHI ذات النمو البكتيري / عدد آبار BHI التي تم تلقيحها.
بعدد البويضات ذات النمو البكتيري / عدد البويضات الملقحة.
جمقارنة بين قابلية الزراعة قبل وبعد المرور في البويضات الجنطة (اختبار فيشر الدقيق على الوجهين).
دمقارنة قابلية الزراعة قبل وبعد المرور في البويضات غير المجربة (اختبار فيشر الدقيق على الوجهين).

الجدول 1: VBNC L. تعود الموحيدات إلى حالة قابلة للزراعة بعد المرور في بيض الدجاج المجنم. تم تلقيح بيض الدجاج المنحني وغير المنحني (6 أيام) ب 100 ميكرولتر من المياه المعدنية فقط أو بمعلقات المياه المعدنية من VBNC (1 × 10⁴ خلايا ، 28 يوما) أو قابلة للزراعة (500 خلية) L. monocytogenes. بعد يومين ، تم استرداد الأجنة (أو الزلال في البويضات غير المجنمة) وطلاءها على BHI agar لتقييم وجود L. monocytogenes القابلة للزراعة. تم تحديد تواتر الخلايا القابلة للزراعة الموجودة في جرعة التلقيح قبل مرور البيض عن طريق خلط 100 ميكرولتر من كل معلق مع مرق BHI في آبار متعددة من صفيحة مجهرية مكونة من 96 بئرا وتسجيل عدد الآبار ذات النمو البكتيري بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية. تم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار فيشر الدقيق ثنائي الذيل ، مع اعتبار قيم p ≥ 0.05 غير ذات دلالة. تم استنساخ هذا الجدول من³¹.

Discussion

إن مخاطر الصحة العامة والمخاطر الاقتصادية المرتبطة بأشكال مسببات الأمراض البكتيرية القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة (VBNC) هي نتيجة لقدرتها على التهرب من الكشف عن طريق الطرق التقليدية القائمة على النمو الميكروبي وكذلك لتحملها / عدم حساسيتها لمعظم مضادات الميكروبات المستخدمة في البيئات السريرية والصناعات الغذائية^26،33. لذلك ، أصبح من الملح العثور على أدوات ونماذج بحثية لفهم الآليات التي تقود انتقال الخلايا البكتيرية وصيانتها وإحيائها بشكل أفضل في حالة VBNC.

في العديد من الجوانب ، يعد جنين الدجاج بديلا مفيدا لنماذج أبحاث الثدييات التقليدية (على سبيل المثال ، الفأر ، الفئران ، الأرانب). من الناحية الفنية العمل مع كائن حي بيضوي أكثر عملية، حيث أن تطوره الجنيني سريع ويحدث خارجيا ومستقلا عن سلفه. والأهم من ذلك أن الأعباء المالية واللوجستية المرتبطة بإنتاج وإسكان وصيانة بيض الدجاج والأجنة أقل بشكل ملحوظ. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح سهولة الحصول على أعداد كبيرة الاختبار المتوازي لظروف تجريبية متعددة و / أو تكرارات وتوليد بيانات شاملة وقوية إحصائيا. على الرغم من أن النماذج غير الثديية ، مثل الأسماك أو الديدان الخيطية ، يمكن أن توفر مزايا مماثلة ، إلا أن جنين الدجاج ، باعتباره من الفقاريات ذوات الدم الحار ، أقرب تطوريا إلى البشر ، وبالتالي فهو نموذج بحث أفضل في مجالات مثل علم المناعة ونمذجة الأمراض والتنمية وعلم السموم. من الأسهل أيضا التعامل مع النماذج الجنينية من وجهة نظر أخلاقية ، لا سيما خلال الثلثين الأولين من التطور ، عندما لا يتم إنشاء نظام تحسي للألم الناضج^{بعد 8}. هذه النافذة الزمنية القصيرة مناسبة للتطبيقات التي تتطلب أوقات استجابة سريعة (على سبيل المثال ، اختبار المخدرات¹) ، ولكنها يمكن أن تفرض قيودا على المقايسات التي تستمر في مراحل التكوين الجنيني اللاحقة أو حتى حياة ما بعد الفقس (على سبيل المثال ، الدراسات التنموية والسلوكية). كما أن الافتقار إلى نظام مناعي تكيفي يجعل جنين الدجاج أداة بحثية مفيدة في مجالات مثل التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض وبيولوجيا^{السرطان 7}.

تم استخدام جنين الدجاج على نطاق واسع في دراسة الفوعة الميكروبية^{9،10،11،12،13،14،15،16،17،18} ، ولكن باعتدال كنموذج لإحياء مسببات الأمراض VBNC^{27،28،29،30}. هنا ، قدمنا وصفا منهجيا مفصلا لكيفية استخدام هذا النظام في الجسم الحي بنجاح لإنقاذ VBNC L. monocytogenes.

من النقاط الحاسمة التي يجب مراعاتها في هذه الطريقة مسألة الوجود المتبقي للخلايا القابلة للزراعة وقدرتها على التغلب على إحياء خلايا VBNC الحقيقي. تثير قيود طريقة إنتاج خلايا VBNC لمعالجة هذه المسألة (تقترن مستويات نقاء خلايا VBNC ببدء التركيز البكتيري) الحاجة إلى استخدام طرق بديلة للقضاء على الخلايا الملوثة القابلة للزراعة تماما أو تقليلها إلى مستوى ضئيل. قد تشمل هذه الأساليب ، على سبيل المثال ، تحييد / قتل بواسطة مضادات الميكروبات التي تستهدف الخلايا القابلة للزراعة حصرا. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق الإزالة الفيزيائية لمجموعة الخلايا القابلة للزراعة بناء على الخصائص الفيزيولوجية المورفولوجية الفريدة (على سبيل المثال ، شكل الخلية أو الهياكل أو الجزيئات السطحية أو السيتوبلازمية) عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتمتع هذا النهج بميزة إضافية تتمثل في السماح بعزل / تنقية المجموعات السكانية الفرعية لخلايا VBNC بأعمار مختلفة (أي تشكلت في نقاط زمنية مختلفة) ، والتي يمكن أيضا اختبارها في البيض لقدرتها على الإحياء.

تشمل النقاط الأخرى لهذه الطريقة التي تتطلب الاهتمام التعامل بعناية مع البويضات الجنينة ، خاصة أثناء وبعد خطوة الحقن مباشرة (لتجنب الصدمة أو الفتك غير المقصودة المرتبطة بالإبرة) ، والسعي لتقليل وقت التلاعب خارج درجة حرارة الحضانة المثلى. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من الظروف المعقمة التي يجب في ظلها إجراء استرجاع الأجنة ومعالجتها وطلاءها ، فقد يستمر النمو الميكروبي غير المرغوب فيه على ألواح الأجار. يمكن حل ذلك عن طريق استخدام وسائط أجار بتركيبة (تركيبة قاعدية و / أو مكملات غذائية) انتقائية للأنواع البكتيرية ذات الأهمية أو باستخدام سلالة تمتلك مقاومة لمضاد حيوي معين.

يعرض هذا العمل جنين الدجاج كنموذج بسيط ولكنه قوي وفعال من حيث التكلفة في الجسم الحي للتحقيق في الجوانب الميكانيكية للسكون البكتيري. في هذا السياق ، يمكن استخدامه لتحديد العوامل البكتيرية المتورطة في عملية إيقاظ حالة VBNC من خلال فحص الطفرات البكتيرية الفردية أو على نطاق الجينوم من خلال استخدام مكتبة مختلطة (على سبيل المثال ، مكتبة الينقولات المتحولة).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879	Prepare stock solution at 30 mM in DMSO. Aliquot and store at −20 °C.
Benchtop centrifuge, 24 tubes 1.5–2 mL	Eppendorf
Biosafety cabinet, class II
Brain heart infusion (BHI) agar	BD	248130
Brain heart infusion (BHI) broth	BD	237500
Cell culture flasks, 25 cm2 (T25), vented cap
Centrifuge tubes, 15 mL	Sarstedt
Deionised water			To fill water reservoir of egg incubator
Dissection scissors, pointed ends
Dissection tweezers, curved + serrated ends
Egg candler	FIEM (Guanzate, IT)	IM35
Egg incubator (MG 244 Mercurius SH)	FIEM (Guanzate, IT)	SH244AD	Capacity for 144 chicken eggs (rocking trays) + 100 (hatching tray)
Eggs, fertilized	PFIE (INRAE Val-de-Loire, FR)		From white Leghorn chickens, raised in specific pathogen-free conditions
Ethyl alcohol, 70% (v/v)
Flow cytometer (CytoFLEX S)	Beckman Coulter	V0-B2-Y4-R0
Heating block (95 °C)
Incubator (37 °C)			For growth of bacteria on agar plates
Incubator w/ shaking (37 °C, 200 rpm)	INFORS-HT		For growth of liquid bacterial cultures
Inoculation loops
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf
Microtiter plates w/ lid, 96-well, transparent	Greiner		To prepare serial dilutions and analyze samples in flow cytometer
Mineral water			Autoclaved (121 °C, 20 min) and sterile-filtered (0.2 µm)
Needle, hypodermic, 18G	Terumo	AN1838R1	Dimensions: 1.2 × 38 mm
Needle, hypodermic, 25G	Terumo	AN2516R1	Dimensions: 0.5 × 16 mm
Petri dishes, 10 cm ø	Greiner		For preparation of BHI agar plates and processing of chicken embryos
Phosphate buffered saline (PBS), 1X	Gibco	14190
Plate spreaders
Serological pipettes, disposable, 5 + 10 + 25 mL
Spectrophotometer (UV-Vis) + cuvettes 1 mL
Stickers, round, colored (Tough-Spots)	Dutscher		Dimensions: 9.5 mm ø
Syringe, Luer slip, 1 mL	Terumo
Tissue homogenizer	IKA		ULTRA-TURRAX T25 disperser + S25N 8G dispersion tool
Vacuum pump