Embrión de pollo como modelo in vivo para revivir patógenos viables pero no cultivables

Resumen

Este método muestra el embrión de pollo como un modelo in vivo simple y rentable para revivir el patógeno bacteriano L. monocytogenes desde un estado viable pero no cultivable (VBNC) y con posibles usos posteriores en la comprensión de los mecanismos de latencia bacteriana.

Resumen

El embrión de pollo se ha convertido en un modelo popular in vivo con una aplicación cada vez mayor en la investigación biomédica debido a su simplicidad, asequibilidad y adaptabilidad en el estudio de diversos fenómenos biológicos. Este modelo se ha utilizado para investigar la patogenicidad microbiana y se está convirtiendo en una herramienta útil para estudiar la latencia bacteriana. El estado viable pero no cultivable (VBNC) es un estado latente en el que las bacterias se vuelven metabólicamente inactivas y resistentes al cultivo para preservar su viabilidad en entornos hostiles. En condiciones favorables, las bacterias VBNC pueden despertar de nuevo a un estado metabólicamente activo y cultivable. Los patógenos bacterianos que cambian a un estado VBNC, como la Listeria monocytogenes, causante de la listeriosis transmitida por los alimentos, son un problema de salud pública, ya que eluden la detección por los métodos convencionales dependientes del crecimiento y pueden recuperar su virulencia al revivir. Esto insta a una mejor comprensión de las condiciones y los mecanismos que impulsan la reactivación de los patógenos VBNC. El método presentado aquí muestra el embrión de pollo como un modelo in vivo eficiente para revivir VBNC L. monocytogenes a un estado cultivable. Mientras que los intentos de reactivación in vitro , basados en gran medida en la reposición nutricional, fueron improductivos, este protocolo logra promover la reactivación de las formas VBNC deficientes en la pared celular de L. monocytogenes generadas por inanición en agua mineral. Es importante destacar que los resultados obtenidos subrayan el requerimiento del embrión para la reactivación de VBNC L. monocytogenes, lo que indica un papel importante de los factores asociados al embrión en este proceso. Otros usos potenciales de este método incluyen la detección e identificación de factores bacterianos implicados en los mecanismos de reactivación del estado de VBNC. Por lo tanto, este modelo puede proporcionar información sobre el funcionamiento molecular de la latencia bacteriana, cuyo conocimiento es fundamental para reducir los riesgos para la salud pública que conllevan los patógenos indetectables.

Introducción

En la búsqueda de modelos alternativos de investigación in vivo, con menores costos asociados y consideraciones logísticas y éticas, surgió el embrión de pollo y rápidamente se convirtió en uno de los sistemas modelo de vertebrados in vivo más aplicables, manejables y reproducibles ^1,2. En comparación con otros modelos animales, como los roedores y los conejos, los huevos de gallina fertilizados son baratos de obtener y no requieren una logística de alojamiento compleja para su desarrollo. Además, el tamaño del huevo de gallina permite la manipulación de numerosos embriones en paralelo, lo que soporta un gran número de condiciones/grupos de pruebas experimentales y réplicas. La corta duración de la embriogénesis (21 días) y la simplicidad de acceder y observar el embrión y las estructuras asociadas en cualquier punto del período de desarrollo hacen de este un modelo útil en una variedad de campos, como la biología del desarrollo (por ejemplo, la formación del corazón y el cerebro)^3,4 y la farmacología (prueba de la actividad, administración y toxicidad de los fármacos)^{1,5, 6}. Además, el sistema inmunitario inmaduro del embrión de pollo lo convierte en un sistema adecuado para estudios basados en el sistema inmunitario y enfoques relacionados con la investigación del cáncer⁷. Es importante destacar que, debido a la naturaleza embrionaria de este modelo, que solo adquiere un sistema nociceptivo maduro en el día de desarrollo 13-14⁸, las solicitudes de investigación realizadas dentro de este período de tiempo no están limitadas por preocupaciones legales y éticas⁷.

El modelo de embrión de pollo también se ha utilizado ampliamente para estudiar la patogenicidad de los microbios que causan enfermedades en humanos y otros mamíferos. De hecho, numerosos estudios han explorado y validado este modelo para investigar la virulencia de los protozoos (por ejemplo, Neospora caninum, Eimeria tenella, Cryptosporidium spp.)^9,10,11, especies fúngicas (p. ej., Candida albicans, Aspergillus fumigatus)^12,13 y bacterianas (p. ej., Enterococcus spp., Salmonella enterica, Francisella spp., Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus)^10, 14,15,16,17,18,19,20,21,22, así como para probar el efecto terapéutico de los compuestos antimicrobianos^17,23.

Los microorganismos, como los mencionados anteriormente, a menudo están expuestos a estímulos estresantes en su(s) entorno(s) y, por lo tanto, han desarrollado estrategias de afrontamiento del estrés para soportar situaciones potencialmente dañinas/letales. Algunas especies bacterianas pueden producir estructuras altamente resistentes y metabólicamente inactivas llamadas endosporas, que preservan la integridad celular y genética bajo severas restricciones ambientales. Si se reúnen condiciones ambientales favorables, las endosporas pueden regenerarse en células activas viables por germinación²⁴. Las bacterias no esporulantes, sin embargo, pueden entrar en un estado alternativo metabólicamente latente llamado viables pero no cultivables (VBNC), cuyo principal rasgo fenotípico es la pérdida de cultivabilidad en medios de crecimiento de rutina²⁵. Dado que una gran parte de las > 100 especies bacterianas reportadas para entrar en un estado VBNC son patógenas para los seres humanos y otros animales²⁶, y que los patógenos VBNC pueden revivir a un estado metabólicamente activo y virulento^25,26, el fracaso de los métodos convencionales basados en el crecimiento para detectar patógenos VBNC es un problema preocupante de salud pública. Las señales ambientales y los mecanismos moleculares y fisiológicos que impulsan este proceso de reactivación aún no se comprenden bien y pueden variar con las especies microbianas y el estrés inductor del estado VBNC.

Los investigadores han aprovechado las particularidades del modelo de embrión de pollo para investigar la capacidad de reactivación in vivo de patógenos bacterianos en un estado VBNC. Los aislados de C. jejuni de origen humano, conducidos a un estado VBNC por la privación nutricional en el agua, recuperaron su cultivabilidad y virulencia en células humanas después de pasar a huevos de gallina embrionados²⁷. De manera similar, también se informaron intentos exitosos de revertir el estado de VBNC para otros patógenos, como Edwardsiella tarda²⁸, Legionella pneumophila²⁹ y L. monocytogenes³⁰.

Recientemente hemos informado que cuando L. monocytogenes es conducido a un estado VBNC por inanición en agua mineral, cambia de una célula en forma de bastón a una célula coccoide. Revelamos que esta transformación morfológica es causada por el daño acumulativo en la pared celular, lo que lleva a su eliminación completa por parte de la bacteria, que luego se convierte en una forma de célula esférica deficiente en la pared celular³¹. Nuestros intentos infructuosos de revivir estas formas VBNC sin paredes de L. monocytogenes in vitro, utilizando enfoques de reposición de nutrientes, nos llevaron a investigar su posible rescate in vivo. Dado su prometedor uso con L. monocytogenes³⁰, seleccionamos el modelo de embrión de pollo para esta tarea. Los resultados confirmaron la capacidad del sistema de huevo de gallina embrionado para promover la restauración de L . monocytogenes de VBNC deficiente en la pared celular a un estado cultivable activo³¹.

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado que permite la reactivación in vivo de L. monocytogenes desde un estado VBNC latente a través de la exposición al entorno de huevos de gallina embrionados. Describimos la preparación y el seguimiento de los huevos de gallina y las bacterias VBNC, la inoculación de los huevos, el procesamiento de los huevos embrionados y no embrionados, y la puntuación de la carga bacteriana cultivable para evaluar la eficiencia de la reactivación celular VBNC. Los resultados reafirman al embrión de pollo como un modelo sencillo, rentable y adecuado para comprender los mecanismos que gobiernan diferentes aspectos de la vida microbiana, como la latencia bacteriana. Este sistema in vivo puede explorarse más a fondo para investigar la contribución de genes bacterianos individuales en el proceso de resurrección.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices institucionales francesas (Decreto n.º 2013-118) y europeas (Directiva 2010/63/UE) aplicables para el uso de animales en investigación. Además, según la legislación francesa (Decreto n.º 2020-274), este protocolo no se refiere a restricciones éticas porque toda la experimentación con embriones de pollo se realiza y finaliza antes del último tercer período de la embriogénesis (es decir, antes del día 14).

1. Preparación de las bacterias VBNC

1. Coloque las cepas bacterianas de las existencias de glicerol (almacenadas a -80 °C) en medios de agar de infusión cerebro-corazón (BHI) utilizando bucles de inoculación. Incubar durante la noche a 37 °C para obtener colonias aisladas.
   NOTA: Si es necesario, complemente el medio de agar con antibióticos para los que la(s) cepa(s) posee(n) resistencia (ya sea de forma natural o por modificación genética).
2. Para cada cepa, prepare 2-3 tubos con 5 mL de caldo BHI y use un asa de inoculación para inocular con 2-3 colonias. Incubar los cultivos durante la noche a 37 °C con agitación (200 rpm) para cultivar bacterias hasta la fase estacionaria. Cada uno de estos cultivos se utilizará para preparar réplicas biológicas independientes de suspensiones bacterianas de VBNC.
3. Diluir cada cultivo 1:10 en caldo BHI y medir la densidad óptica en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm (OD₆₀₀). El valor de OD₆₀₀ de cultivos en fase estacionaria de Listeria monocytogenes cultivados de manera óptima oscila entre 2 y 4. Esto equivale a una concentración bacteriana de 2-4 x 10⁹ unidades formadoras de colonias (UFC)/mL.
4. Pellet de 1 mL de cultivo bacteriano en un microtubo de 1,5 mL por centrifugación a 6.000 x g durante 2 min. Aspire el sobrenadante con una bomba de vacío. Vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de agua mineral filtrada y esterilizada en autoclave.
5. Lave bien las bacterias repitiendo el paso 1.4 tres veces. Esto asegura la eliminación completa de los nutrientes del medio de cultivo que, de otro modo, retrasarían la formación de bacterias VBNC.
6. Prepare suspensiones bacterianas a una concentración inicial de 10⁶ UFC/mL añadiendo 30 μL de bacterias lavadas a matraces de cultivo celular T25 que contengan 30 mL de agua mineral.
7. Mezclar las suspensiones con una pipeta serológica. Guárdelos a temperatura ambiente, en condiciones estáticas (matraz en posición vertical) y con poca luz.

2. Seguimiento de la formación de bacterias VBNC

1. Determine la población cultivable en las suspensiones bacterianas el^{primer día (} inmediatamente después de la preparación) y luego semanalmente, como se describe a continuación.
   1. Preparar diluciones en serie 10 veces de la suspensión bacteriana VBNC en agua mineral (de ^10-1 a ^10-3 diluciones). Colocar 100 μL de suspensión sin diluir y de cada dilución, por duplicado, en agar BHI e incubar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: Cuando la cultivabilidad se acerca a < 1 UFC/mL, se debe colocar un volumen mayor (0,5-2 mL) de la suspensión sin diluir para confirmar la presencia/ausencia de bacterias cultivables.
   2. Calcule la concentración de bacterias cultivables de la siguiente manera:
      concentración de bacterias cultivables (UFC/mL) = (número medio de colonias x factor de dilución de la muestra) / volumen de la muestra en placa (en mL).
2. Determine la población viable en las suspensiones bacterianas el^1er día (inmediatamente después de la preparación) y luego semanalmente, como se describe a continuación.
   1. Incubar una muestra de la suspensión bacteriana (es decir, a una concentración de aproximadamente 10^{a 6} células/mL) con el colorante de viabilidad 5(6)-diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) a una concentración final de 30 μM durante 30 min en la oscuridad. Preparar también una muestra sin CFDA (control sin tinción) y una muestra tratada a 95 °C durante 30 min antes de la incubación con CFDA (control de células no viables/muertas).
   2. Analice las muestras en un citómetro de flujo equipado con un láser de excitación de 488 nm y un detector de emisión de 520 nm para fluorescencia CFDA. Para obtener solidez estadística, adquiera aproximadamente 1 x 10⁵ eventos bacterianos por muestra (esto se traduce en un volumen de muestra adquirido de 10-100 μL) a un caudal de al menos 30 μL/min.
   3. Utilice la muestra sin teñir para encontrar y controlar los eventos asociados a las bacterias en un gráfico de dispersión directa (FSC) a escala logarítmica frente a dispersión lateral (SSC). Trace los eventos bacterianos activados en un histograma de fluorescencia CFDA a escala logarítmica y utilice las muestras no teñidas y no viables/de células muertas para distinguir las poblaciones viables (CFDA positivas) de las no viables (CFDA negativas).
   4. Calcule la concentración de bacterias viables de la siguiente manera:
      concentración de bacterias viables (células/mL) = número medio de eventos positivos para CFDA en la muestra adquirida / volumen de la muestra adquirida (en mL)
      NOTA: Dependiendo del modelo de citómetro, la cuantificación celular puede requerir el uso de perlas de recuento de citometría de flujo.

3. Incubación de huevos

1. Al recibirlos del proveedor, permita que los óvulos fertilizados se acomoden a temperatura ambiente hasta el día siguiente.
2. Mientras tanto, llene el depósito de agua de la incubadora de huevos con agua desionizada y encienda la alimentación. Ajuste la temperatura a 37,7 °C y la humedad relativa máxima al 47%.
   NOTA: En nuestras manos, los huevos se incuban a un rango de humedad relativa del 38% al 42%, sin ningún impacto visible en la tasa de embriogénesis esperada y el éxito.
3. Transfiera los huevos a la incubadora para iniciar la embriogénesis. Colóquelos en la(s) bandeja(s) de la incubadora con la bolsa de aire hacia arriba (es decir, con el extremo puntiagudo hacia abajo).
4. Incubar los huevos durante 6 días. Después de 4 días, distinga los huevos embrionados vivos de los huevos muertos o no embrionados mediante ovoscopia.
   1. Coloque el huevo debajo o sobre una fuente de luz fuerte (candelabro) para iluminar el interior y discernir visualmente su contenido. Después de 3 o 4 días de incubación, los huevos embrionados vivos muestran una red de vasos sanguíneos que se expanden hacia abajo desde la bolsa de aire. Esta red aparece colapsada y desorganizada en los óvulos embrionados muertos y está completamente ausente en los óvulos que no lograron iniciar la embriogénesis. Si es visible, un embrión vivo puede incluso mostrar movimientos espasmódicos (Figura 1).

4. Preparación de los huevos para la inoculación

1. El día de la inoculación, se colocan los huevos con una vela para determinar el número disponible de óvulos viables embrionados y no embrionados. Identifique los óvulos no embrionados (alrededor del 10%-20% del número total) y cualquier óvulo con embriones muertos, como se describe en el paso 3.4. Deseche estos últimos de acuerdo con los lineamientos institucionales para la disposición de residuos biológicos.
2. Marque el punto de inyección en la cáscara del huevo a 2-5 mm por encima del borde de la bolsa de aire (Figura 2A). Desinfecte esta área frotando con papel de seda empapado con etanol al 70% (v/v).
3. Con una aguja de 18G, haga con cuidado una abolladura en la carcasa en el lugar de la inyección sin perforar la membrana de la carcasa (Figura 2B). Desinfecte el lugar de inyección con un pañuelo de papel empapado con etanol al 70% (v/v).

5. Inoculación de huevos

1. Conecte una aguja de 25 G (0,5 mm x 16 mm) en una jeringa de 1 ml y llénela con suspensión bacteriana VBNC. Si es necesario, elimine las burbujas de aire adheridas a la pared interna de la jeringa golpeándola con un dedo.
2. Realizar la inoculación con agua mineral sola o con una suspensión de L. monocytogenes (5 x 10³ UFC/mL) cultivada durante la noche en caldo BHI como condiciones de control de la esterilidad y el crecimiento derivados de bacterias cultivables, respectivamente.
3. Introduzca la aguja a través de la carcasa perforada en el punto de inyección e insértela hasta el final, en un ángulo perpendicular, hasta que la base de la aguja toque la superficie de la carcasa (Figura 2C). Esto posiciona la punta de la aguja para administrar el contenido de la jeringa en la cavidad alantoidea (en los óvulos embrionados) o en la albúmina (en los óvulos no embrionados).
4. Inyecte con cuidado y lentamente 100 μL del inóculo. Mantenga el ángulo de la aguja lo más quieto posible cuando esté dentro de un óvulo embrionado para evitar causar lesiones letales al embrión.
5. Retire la aguja con cuidado y lentamente y cubra el lugar de inyección con una etiqueta redonda para sellar el sitio de entrada de la inoculación. Para mayor comodidad y claridad, use calcomanías con un color diferente para cada condición/grupo de huevos.
6. Regrese los huevos inoculados a la incubadora durante 2 días más. Asegúrese de que los huevos con embriones en desarrollo no estén fuera de la incubadora (o a una temperatura inferior a 37,7 °C) durante más de 30 minutos. Realizar la inoculación en lotes, si es necesario.

6. Evaluación de la presencia de células cultivables en las muestras de inoculación

1. Dispense 100 μL de suspensión bacteriana VBNC en varios pocillos de una microplaca de 96 pocillos. Calcule el número de pocillos ≥ 2 x el número de óvulos inoculados (embrionados + no embrionados).
2. Si se utilizan las condiciones de control mencionadas en el paso 5.2, dispense 100 μL de cada inóculo (es decir, agua mineral o bacterias cultivables) en al menos tres pocillos en la misma microplaca de 96 pocillos.
3. Con una pipeta multicanal, añada 100 μL de medio BHI a cada uno de los pocillos preparados en los dos pasos anteriores.
4. Incubar la placa a 37 °C en condiciones estáticas para promover el crecimiento bacteriano en pocillos que contengan bacterias cultivables. Dependiendo de la presencia de bacterias cultivables y su tasa de rebrote en estas condiciones, pueden ser necesarios uno o más días de incubación para revelar completamente los pocillos que contienen bacterias cultivables.
5. Para cada inóculo, inspeccione visualmente y cuente el número de pocillos con una puntuación positiva y negativa para el crecimiento bacteriano.

7. Seguimiento de la viabilidad embrionaria

1. Al día siguiente de la inoculación, vela los óvulos embrionados para comprobar la letalidad del embrión.
2. Apartar los óvulos que contengan embriones muertos y desecharlos de acuerdo con las directrices institucionales para la eliminación de residuos biológicos infectados.

8. Procesamiento de óvulos embrionados

1. Recupere los huevos embrionados de la incubadora y la vela para verificar la letalidad del embrión. Descartar los embriones muertos y no tenerlos en cuenta en los resultados finales.
2. Retire la pegatina del huevo y desinfecte el extremo superior de la cáscara (cubriendo la bolsa de aire) con papel de seda empapado con etanol al 70% (v/v).
3. Con un par de tijeras de disección limpias, corte la cáscara desde el lugar de inyección para exponer la bolsa de aire. Con un par de pinzas de disección limpias, rompe la membrana de la cáscara interna que separa la bolsa de aire del resto del huevo.
4. Vacíe con cuidado el contenido del huevo en una placa de Petri estéril. Con un par de pinzas, aísle y transfiera el embrión a una nueva placa de Petri. Lavar el embrión con PBS estéril, si es necesario.
5. Transfiera el embrión a un tubo centrífugo de 15 mL que contenga 4 mL de PBS estéril. Disociar el embrión mediante un homogeneizador (velocidad: 10.000 rpm). Limpie la punta de la herramienta de dispersión entre cada homogeneización pasándola secuencialmente en PBS estéril, etanol al 70% (v/v) y nuevamente PBS estéril.
6. Placa de 500 μL del embrión homogeneizado en agar BHI. Incubar las placas a 37 °C durante la noche (o más, si es necesario).
   NOTA: Opcionalmente, se pueden sembrar diluciones en serie del homogeneizado en caso de que se esperen números elevados de UFC (es decir, > 300) en el homogeneizado sin diluir.
7. Para cada grupo de inoculación, cuente el número de óvulos con una puntuación positiva y negativa para el crecimiento de L. monocytogenes en placas de agar.
   NOTA: A pesar de las condiciones asépticas en las que se realiza la extracción y homogeneización del embrión, el uso de un medio de agar no selectivo para la siembra de homogeneizados de embriones conlleva un riesgo de crecimiento contaminante. El uso de un medio de crecimiento específico de un género/especie o la suplementación con un antibiótico selectivo (al que solo es resistente la cepa bacteriana analizada) puede reducir o prevenir dicha contaminación.

9. Procesamiento de óvulos no embrionados

1. Recuperar los óvulos no embrionados de la incubadora. Repita los pasos 8.2 y 8.3 para acceder a la albúmina de huevo.
2. Con una micropipeta, recoja 500 μL de albúmina y extiéndala directamente sobre el agar BHI. Incubar las placas a 37 °C durante la noche o más, si es necesario.
3. Para cada grupo de inoculación, cuente el número de huevos que dieron positivo para el crecimiento de L. monocytogenes en placas de agar.

Resultados

Para probar el potencial del modelo de embrión de pollo para revivir formas VBNC deficientes en la pared celular de L. monocytogenes generadas por inanición en agua mineral, fue importante articular el momento de la preparación del inóculo bacteriano VBNC (≥ 28 días) con el de los huevos embrionados (6 días). De este modo, se establecieron suspensiones repetidas de L. monocytogenes a una concentración de 1 x 10⁶ UFC/mL en agua mineral 28 días antes del día previsto para la inoculación de los huevos. Se demostró que esta concentración bacteriana inicial da como resultado una cultivabilidad residual deseada de <1 UFC/mL después de 28 días³¹. Una verificación final de los niveles de cultivabilidad y viabilidad de las suspensiones celulares bacterianas dio como resultado la selección de un inóculo de L . monocytogenes de VBNC que contenía 1 x 10⁶ células viables y 0,5 células cultivables por mL. Para la experimentación, se administraron 100 μL de este inóculo (es decir, 1 x 10⁵ células viables y < 0,1 UFC) en grupos de óvulos embrionados y no embrionados. Los grupos control se prepararon en paralelo inyectando óvulos embrionados y no embrionados con el mismo volumen de dosis de agua mineral o de una suspensión de 5 x 10^{3 UFC} /mL de L. monocytogenes cultivada durante la noche en caldo BHI.

A los 2 días después de la inoculación, los óvulos se procesaron para evaluar la presencia de L. monocytogenes cultivable. Como se esperaba, no se recuperó ningún crecimiento bacteriano de los huevos del grupo de control de esterilidad inyectados con agua mineral, mientras que el 100% de los huevos del grupo de control tratados con L. monocytogenes cultivable obtuvieron resultados positivos para el crecimiento en medios de agar (Tabla 1). Es importante destacar que todos los embriones recuperados de óvulos inoculados con la bacteria VBNC dieron lugar al crecimiento de L. monocytogenes en la placa, lo que contrasta con su ausencia total en cada placa esparcida con el contenido de un huevo no embrionado inyectado con la misma bacteria VBNC (Tabla 1). Este resultado subraya el requerimiento del embrión de pollo para el proceso de despertar de VBNC L. monocytogenes, como se informó previamente³⁰.

Para determinar la probabilidad de que el crecimiento de L. monocytogenes recuperado de óvulos embrionados inyectados con bacterias VBNC provenga de una verdadera recuperación de células VBNC, no del rebrote de células cultivables remanentes, es necesario comparar la frecuencia de las dosis de inóculo que producen crecimiento bacteriano antes y después del paso de los huevos. Para obtener el primero, se mezclaron múltiples dosis de 100 μL del inóculo bacteriano VBNC con BHI, un medio rico en nutrientes que no soporta el resurgimiento de VBNC L. monocytogenes ³², en una placa de 96 pocillos y se incubó a 37 °C. Una frecuencia del 9,5% de los pocillos de BHI inoculados positivos para el crecimiento bacteriano (8 en 84) difirió significativamente (prueba exacta de Fisher, p = 1,6 × ^10-17) de la frecuencia del 100% de los huevos que mostraron bacterias cultivables recuperadas (Tabla 1). Esta diferencia sustancial y estadísticamente significativa indica fuertemente que el crecimiento de L. monocytogenes recuperado de huevos embrionados se debió en gran medida a la reactivación de la bacteria VBNC. Además, a diferencia de sus formas vegetativas, VBNC L. monocytogenes no pudo revivir en óvulos no embrionados, lo que respalda que la reactivación de las células VBNC en los óvulos embrionados no se debe a las bacterias cultivables residuales en el inóculo.

Figura 1: Distinción de huevos de gallina no embrionados, embrionados muertos y embrionados vivos por ovoscopia. El estado de la embriogénesis se determina iluminando el huevo con una fuente de luz (vela de huevos) a corta distancia. Los óvulos que contienen un embrión vivo en desarrollo (visible o no) muestran una fuerte red de vasos sanguíneos que se expanden hacia abajo desde la bolsa de aire. Esta red parece colapsada y desorganizada en los óvulos con embriones muertos y está completamente ausente en los óvulos que no lograron iniciar la embriogénesis. Creado en BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Preparación del huevo para la inoculación. (A) El sitio de inyección está marcado en una posición de 2 a 5 mm por encima del borde de la bolsa de aire, como se ve mediante ovoscopia. (B) La carcasa en el sitio de inyección se perfora con la ayuda de la punta de una aguja 18G sin perforar la membrana exterior de la capa. (C) El inóculo se administra a través de una aguja de 25G (0,5 mm x 16 mm) en el líquido alantoideo en los huevos embrionados o en la albúmina en los huevos no embrionados. Creado en BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Inóculo	Cultivabilidad antes del paso del huevoa	Cultivabilidad después del paso del huevob
		Óvulos embrionados	Valorp C	Óvulos no embrionados	Valorp d
Agua mineral	0/3 (0%)	0/10 (0%)	>0,999	0/10 (0%)	>0,999
VBNC Lm	8/84 (9.52%)	24/24 (100%)	1.63E-17	0/18 (0%)	0.344
Culturable Lm	3/3 (100%)	8/8 (100%)	>0,999	2/2 (100%)	>0,999
unNúmero de pocillos de BHI con crecimiento bacteriano/Número de pocillos de BHI inoculados.
bNúmero de huevos con crecimiento bacteriano/Número de huevos inoculados.
cComparación de la cultivabilidad antes y después del paso en huevos embrionados (prueba exacta de Fisher de dos caras).
dComparación de la cultivabilidad antes y después del paso en huevos no embrionados (prueba exacta de Fisher de dos caras).

Tabla 1: VBNC L. monocytogenes vuelve a un estado cultivable después de su paso en huevos de gallina embrionados. Los huevos de gallina embrionados y no embrionados (6 días) se inocularon solo con 100 μL de agua mineral o con suspensiones de agua mineral de VBNC (1 x 10⁴ células, 28 días) o cultivables (500 células) de L. monocytogenes. Después de 2 días, los embriones (o albúmina en óvulos no embrionados) se recuperaron y se colocaron en agar BHI para evaluar la presencia de L. monocytogenes cultivable. La frecuencia de células cultivables presentes en una dosis de inoculación antes del paso del huevo se determinó mezclando 100 μL de cada suspensión con caldo BHI en múltiples pocillos de una microplaca de 96 pocillos y anotando el número de pocillos con crecimiento bacteriano después de la incubación a 37 °C. La significación estadística se calculó mediante una prueba exacta de Fisher de dos colas, considerándose no significativos los valores de p ≥ 0,05. Esta tabla fue reproducida de la³¹.

Discusión

Los riesgos económicos y para la salud pública asociados con las formas viables pero no cultivables de patógenos bacterianos son consecuencia de su capacidad para evadir la detección por los métodos convencionales basados en el crecimiento microbiano, así como de su tolerancia/insensibilidad a la mayoría de los antimicrobianos utilizados en entornos clínicos y de la industria alimentaria^26,33. Por lo tanto, se vuelve urgente encontrar herramientas y modelos de investigación para comprender mejor los mecanismos que impulsan la transición, el mantenimiento y la reactivación de las células bacterianas en un estado VBNC.

En muchos aspectos, el embrión de pollo es una alternativa ventajosa a los modelos de investigación más convencionales de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, conejo). Técnicamente es más práctico trabajar con un organismo ovíparo, ya que su desarrollo embrionario es rápido y se produce de forma externa e independiente de su progenitor. Es importante destacar que las cargas financieras y logísticas asociadas con la producción, el alojamiento y el mantenimiento de huevos y embriones de gallina son notablemente más bajas. Además, la facilidad para obtener grandes números permite la realización de pruebas paralelas de múltiples condiciones experimentales y/o réplicas y la generación de datos completos y estadísticamente robustos. Aunque los modelos no mamíferos, como los peces o los nematodos, pueden proporcionar ventajas similares, el embrión de pollo, como vertebrado de sangre caliente, está evolutivamente más cerca de los humanos y, por lo tanto, es un mejor modelo de investigación en áreas como la inmunología, el modelado de enfermedades, el desarrollo y la toxicología. Los modelos embrionarios también son más fáciles de trabajar desde un punto de vista ético, particularmente durante los primeros dos tercios del desarrollo, cuando aún no se ha establecido un sistema nociceptivo maduro⁸. Este corto período de tiempo es conveniente para aplicaciones que requieren tiempos de respuesta rápidos (por ejemplo, pruebas de drogas¹), pero puede plantear restricciones para ensayos que duran hasta etapas posteriores de embriogénesis o incluso hasta la vida posterior a la eclosión (por ejemplo, estudios de desarrollo y comportamiento). La falta de un sistema inmunológico adaptativo también hace que el embrión de pollo sea una herramienta de investigación útil en áreas como las interacciones huésped-patógeno y la biología del^cáncer.

El embrión de pollo se ha utilizado ampliamente en el estudio de la virulencia microbiana 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, pero con moderación como modelo para revivir patógenos VBNC 27,28,29,30. Aquí, hemos proporcionado una descripción metodológica detallada de cómo este sistema in vivo puede ser utilizado con éxito para el rescate de VBNC L. monocytogenes.

Un punto crítico a considerar en este método es la cuestión de la presencia residual de células cultivables y su potencial para dominar la verdadera reactivación de células VBNC. Las limitaciones del método de producción de células VBNC para abordar este asunto (los niveles de pureza de las células VBNC se combinan con la concentración bacteriana inicial) plantean la necesidad de emplear enfoques alternativos para eliminar por completo las células cultivables contaminantes o reducirlas a un nivel insignificante. Dichos enfoques pueden incluir, por ejemplo, la neutralización/eliminación mediante antimicrobianos dirigidos exclusivamente a células cultivables. Alternativamente, la eliminación física de la población de células cultivables se puede lograr sobre la base de características morfofisiológicas únicas (por ejemplo, forma de la célula, superficie o estructuras o moléculas citoplasmáticas) mediante citometría de flujo. Este enfoque tiene la ventaja añadida de permitir el aislamiento/purificación de subpoblaciones de células VBNC con diferentes edades (es decir, formadas en diferentes puntos de tiempo), que también pueden probarse in ovo para determinar su capacidad de reactivación.

Otros puntos de este método que requieren atención incluyen el manejo cuidadoso de los óvulos embrionados, particularmente durante e inmediatamente después de la etapa de inyección (para evitar traumatismos o letalidad involuntarios asociados a la aguja), y esforzarse por reducir el tiempo de manipulación fuera de la temperatura óptima de incubación. Además, a pesar de las condiciones asépticas en las que se debe realizar la extracción, el procesamiento y la siembra de embriones, aún puede ocurrir un crecimiento microbiano no deseado en las placas de agar. Esto puede resolverse mediante el uso de medios de agar con una formulación (composición basal y/o suplementos) selectiva para las especies bacterianas de interés o mediante el uso de una cepa que posea resistencia a un antibiótico determinado.

Este trabajo muestra el embrión de pollo como un modelo in vivo simple pero potente y rentable para investigar los aspectos mecanicistas de la latencia bacteriana. En este contexto, se puede utilizar potencialmente para identificar factores bacterianos implicados en el proceso de despertar del estado VBNC a través del cribado de mutantes bacterianos individuales o a escala de todo el genoma mediante el empleo de una biblioteca mixta (por ejemplo, biblioteca de mutantes de transposones).

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879	Prepare stock solution at 30 mM in DMSO. Aliquot and store at −20 °C.
Benchtop centrifuge, 24 tubes 1.5–2 mL	Eppendorf
Biosafety cabinet, class II
Brain heart infusion (BHI) agar	BD	248130
Brain heart infusion (BHI) broth	BD	237500
Cell culture flasks, 25 cm2 (T25), vented cap
Centrifuge tubes, 15 mL	Sarstedt
Deionised water			To fill water reservoir of egg incubator
Dissection scissors, pointed ends
Dissection tweezers, curved + serrated ends
Egg candler	FIEM (Guanzate, IT)	IM35
Egg incubator (MG 244 Mercurius SH)	FIEM (Guanzate, IT)	SH244AD	Capacity for 144 chicken eggs (rocking trays) + 100 (hatching tray)
Eggs, fertilized	PFIE (INRAE Val-de-Loire, FR)		From white Leghorn chickens, raised in specific pathogen-free conditions
Ethyl alcohol, 70% (v/v)
Flow cytometer (CytoFLEX S)	Beckman Coulter	V0-B2-Y4-R0
Heating block (95 °C)
Incubator (37 °C)			For growth of bacteria on agar plates
Incubator w/ shaking (37 °C, 200 rpm)	INFORS-HT		For growth of liquid bacterial cultures
Inoculation loops
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf
Microtiter plates w/ lid, 96-well, transparent	Greiner		To prepare serial dilutions and analyze samples in flow cytometer
Mineral water			Autoclaved (121 °C, 20 min) and sterile-filtered (0.2 µm)
Needle, hypodermic, 18G	Terumo	AN1838R1	Dimensions: 1.2 × 38 mm
Needle, hypodermic, 25G	Terumo	AN2516R1	Dimensions: 0.5 × 16 mm
Petri dishes, 10 cm ø	Greiner		For preparation of BHI agar plates and processing of chicken embryos
Phosphate buffered saline (PBS), 1X	Gibco	14190
Plate spreaders
Serological pipettes, disposable, 5 + 10 + 25 mL
Spectrophotometer (UV-Vis) + cuvettes 1 mL
Stickers, round, colored (Tough-Spots)	Dutscher		Dimensions: 9.5 mm ø
Syringe, Luer slip, 1 mL	Terumo
Tissue homogenizer	IKA		ULTRA-TURRAX T25 disperser + S25N 8G dispersion tool
Vacuum pump