Куриный эмбрион как модель in vivo для оживления жизнеспособных, но не поддающихся культивированию патогенов

Резюме

Этот метод демонстрирует куриный эмбрион как простую и экономически эффективную модель in vivo для оживления бактериального патогена L. monocytogenes из жизнеспособного, но некультивируемого (VBNC) состояния и с потенциальным дальнейшим использованием в понимании механизмов бактериального покоя.

Аннотация

Куриный эмбрион стал популярной моделью in vivo с все более широким применением в биомедицинских исследованиях благодаря своей простоте, доступности и адаптивности при изучении различных биологических явлений. Эта модель была использована для исследования патогенности микроорганизмов и становится полезным инструментом для изучения бактериального покоя. Жизнеспособное, но некультивируемое состояние (VBNC) — это спящее состояние, в котором бактерии становятся метаболически спокойными и устойчивыми к культивированию, чтобы сохранить свою жизнеспособность в суровых условиях. При благоприятных условиях бактерии VBNC могут возвращаться в метаболически активное и культивируемое состояние. Бактериальные патогены, которые переходят в состояние VBNC, такие как Listeria monocytogenes, вызывающий пищевой листериоз, представляют собой проблему общественного здравоохранения, поскольку они ускользают от обнаружения обычными методами, зависящими от роста, и могут восстановить свою вирулентность после оживления. Это требует лучшего понимания условий и механизмов, способствующих возрождению возбудителей VBNC. Представленный здесь метод демонстрирует куриный эмбрион в качестве эффективной модели in vivo для реанимации VBNC L. monocytogenes обратно в культивируемый статус. В тех случаях, когда попытки возрождения in vitro , в основном основанные на восполнении питательных веществ, оказались непродуктивными, этот протокол успешно способствует реактивации форм VBNC L. monocytogenes с дефицитом клеточной стенки, образующихся при голодании в минеральной воде. Важно отметить, что полученные результаты подчеркивают потребность эмбриона в реанимации VBNC L. monocytogenes, что указывает на важную роль эмбриоассоциированных факторов в этом процессе. Другие потенциальные применения этого метода включают скрининг и идентификацию бактериальных факторов, участвующих в механизмах оживления состояния VBNC. Таким образом, эта модель может дать представление о молекулярной работе бактериального покоя, знание которого имеет решающее значение для снижения рисков для здоровья населения, связанных с неопределяемыми патогенами.

Введение

В поисках альтернативных исследовательских моделей in vivo, с меньшими сопутствующими затратами и логистическими и этическими соображениями, куриный эмбрион быстро стал одной из наиболее применимых, управляемых и воспроизводимых модельных систем in vivo ^{позвоночных.} По сравнению с другими животными моделями, такими как грызуны и кролики, оплодотворенные куриные яйца недороги в получении и не требуют сложной логистики для их развития. Кроме того, размер куриного яйца позволяет обрабатывать множество эмбрионов параллельно, поддерживая надежное количество экспериментальных тестовых условий/групп и повторений. Короткая продолжительность эмбриогенеза (21 день) и простота доступа и наблюдения за эмбрионом и связанными с ним структурами в любой точке периода развития делают эту модель полезной в различных областях, таких как биология развития (например, формирование сердца и мозга)^3,4 и фармакология (тестирование активности, доставки и токсичности лекарственного средства)^{1,5. 6}. Кроме того, незрелая иммунная система куриного эмбриона делает его подходящей системой для иммунологических исследований^{и подходов}, связанных с исследованиями рака. Важно отметить, что из-за эмбриональной природы этой модели, которая приобретает зрелую ноцицептивную систему только к 13-14 дню^{развития,} исследовательские приложения, проводимые в эти сроки, не ограничены юридическими и этическими^{проблемами.}

Модель куриного эмбриона также широко используется для изучения патогенности микробов, вызывающих заболевания у людей и других млекопитающих. Действительно, многочисленные исследования изучали и валидировали эту модель для изучения вирулентности простейших (например, Neospora caninum, Eimeria tenella, Cryptosporidium spp.)^9,10,11, грибковые (например, Candida albicans, Aspergillus fumigatus)^12,13 и виды бактерий (например, Enterococcus spp., Salmonella enterica, Francisella spp., Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus)^10, 14,15,16,17,18,19,20,21,22^, а также для проверки терапевтического эффекта антимикробных соединений ^17,23.

Микроорганизмы, подобные упомянутым выше, часто подвергаются воздействию стрессовых стимулов в окружающей среде и поэтому развили стратегии преодоления стресса, чтобы переносить потенциально вредные/смертельные ситуации. Некоторые виды бактерий могут производить высокоустойчивые и метаболически спящие структуры, называемые эндоспорами, которые сохраняют клеточную и генетическую целостность в условиях жестких ограничений окружающей среды. Если сложиться благоприятные условия окружающей среды, эндоспоры могут регенерировать в жизнеспособные активные клетки путем прорастания^. Неспоруляющие бактерии, однако, могут входить в альтернативное метаболически спящее состояние, называемое жизнеспособными, но некультивируемыми (VBNC), основным фенотипическим признаком которого является потеря культивируемости в^{обычных питательных} средах. Учитывая, что большая часть из > 100 видов бактерий, которые, как сообщается, входят в состояние VBNC, являются патогенными для человека и других животных²⁶, и что патогены VBNC могут возвращаться в метаболически активное и вирулентное состояние^25,26, неспособность традиционных методов, основанных на росте, обнаруживать патогены VBNC является проблемой общественного здравоохранения. Сигналы окружающей среды, а также молекулярные и физиологические механизмы, управляющие этим процессом оживления, еще не до конца изучены и могут варьироваться в зависимости от вида микробов и стресса, вызывающего состояние VBNC.

Исследователи воспользовались особенностями модели куриного эмбриона для изучения способности бактериальных патогенов к возрождению in vivo в состоянии VBNC. Изоляты C. jejuni человеческого происхождения, доведенные до состояния VBNC из-за недостатка питательных веществ в воде, восстановили свою культивируемость и вирулентность в клетках человека после пассажа в эмбрионированные куриные яйца²⁷. Аналогичным образом, сообщалось об успешных попытках вернуть состояние VBNC и для других патогенов, таких как Edwardsiella tarda²⁸, Legionella pneumophila²⁹ и L. monocytogenes³⁰.

Недавно мы сообщали, что когда L. monocytogenes вводится в состояние VBNC путем голодания в минеральной воде, он переходит из палочковидной клетки в коккоидную. Мы выявили, что эта морфологическая трансформация вызвана кумулятивным повреждением клеточной стенки, приводящим к ее полному выпадению бактерией, которая затем приобретает сферическую клеточную форму³¹ с дефицитом клеточной стенки. Наши безуспешные попытки реанимировать эти безстеночные формы VBNC L. monocytogenes in vitro с использованием подходов к восполнению питательных веществ привели нас к исследованию их потенциального спасения in vivo. Учитывая его перспективное использование с L. monocytogenes³⁰, мы выбрали для этой задачи модель куриного эмбриона. Полученные результаты подтвердили способность системы эмбрионированных куриных яиц способствовать восстановлению VBNC L. monocytogenes с дефицитом клеточной стенки до активного культивируемого состояния³¹.

В данной статье мы предоставляем подробный протокол, позволяющий in vivo реанимировать L. monocytogenes из спящего состояния VBNC путем воздействия на среду эмбрионированных куриных яиц. Мы описываем подготовку и мониторинг куриных яиц и бактерий VBNC, инокуляцию яиц, обработку эмбрионированных и неэмбрионированных яиц, а также оценку культивируемой бактериальной нагрузки для оценки эффективности реанимации клеток VBNC. Полученные результаты подтверждают, что куриный эмбрион является простой, экономически эффективной и подходящей моделью для понимания механизмов, управляющих различными аспектами микробной жизни, такими как бактериальный период. Эта система in vivo может быть дополнительно изучена для изучения вклада отдельных бактериальных генов в процесс воскрешения.

протокол

Настоящий протокол соответствует применимым французским (Декрет No 2013-118) и европейским (Директива 2010/63/ЕС) рекомендациям по использованию животных в научных исследованиях. Кроме того, в соответствии с французским законодательством (Декрет No 2020-274) этот протокол не связан с этическими ограничениями, поскольку все эксперименты с куриными эмбрионами проводятся и завершаются до последнего третьего периода эмбриогенеза (т.е. до 14-го дня).

1. Подготовка бактерий VBNC

1. Перенесите штаммы бактерий из запасов глицерина (хранящихся при температуре −80 °C) на агаровую среду для инфузии сердца мозга (BHI) с помощью петель инокуляции. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C для получения изолированных колоний.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости дополните агаровую среду антибиотиком (антибиотиками), к которому штамм (штаммы) обладает устойчивостью (либо естественным путем, либо путем генетической модификации).
2. Для каждого штамма приготовьте 2-3 пробирки с 5 мл бульона BHI и используйте петлю инокуляции для инокуляции 2-3 колоний. Инкубируйте культуры в течение ночи при температуре 37 °C с перемешиванием (200 об/мин) для выращивания бактерий до стационарной фазы. Каждая из этих культур будет использована для получения независимых биологических реплик бактериальных суспензий VBNC.
3. Разведите каждую культуру в соотношении 1:10 в бульоне BHI и измерьте оптическую плотность в спектрофотометре на длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀). Значение OD₆₀₀ для оптимально выращенных культур стационарной фазы Listeria monocytogenes колеблется от 2 до 4. Это соответствует концентрации бактерий 2-4 x 10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл.
4. Гранулируйте 1 мл бактериальной культуры в микропробирке объемом 1,5 мл центрифугированием при 6000 х г в течение 2 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл автоклавированной и отфильтрованной минеральной воды.
5. Тщательно промойте бактерии, повторив шаг 1.4 три раза. Это обеспечивает полное удаление питательных веществ питательной среды, которые в противном случае задержали бы образование бактерий VBNC.
6. Бактериальные суспензии готовят в исходной концентрации 10⁶ КОЕ/мл путем добавления 30 мкл промытых бактерий в колбы для клеточных культур Т25, содержащие 30 мл минеральной воды.
7. Смешайте суспензии с помощью серологической пипетки. Храните их при комнатной температуре, при статическом (колба в вертикальном положении) и при тусклом освещении.

2. Мониторинг образования бактерий VBNC

1. Определяем пригодную для культивирования популяцию в бактериальных суспензиях в^1-й день (сразу после приготовления), а затем еженедельно, как описано ниже.
   1. Готовьте 10-кратные серийные разведения бактериальной суспензии ВБНК в минеральной воде (от ^10-1 до ^10-3 разведений). Планшет 100 мкл неразбавленной суспензии и каждого разведения, в двух экземплярах, на агар BHI и инкубировать в течение ночи при 37°С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда культивируемость приближается < 1 КОЕ/мл, следует нанести больший объем (0,5-2 мл) неразбавленной суспензии для подтверждения наличия/отсутствия культивируемых бактерий.
   2. Рассчитайте концентрацию культивируемых бактерий следующим образом:
      концентрация культивируемых бактерий (КОЕ/мл) = (среднее число колоний х коэффициент разбавления пробы) / объем осажденного образца (в мл).
2. Определяйте жизнеспособную популяцию в бактериальных суспензиях в^1-й день (сразу после приготовления), а затем еженедельно, как описано ниже.
   1. Инкубируют образец бактериальной суспензии (т.е. в концентрации около 10⁶ клеток/мл) с красителем жизнеспособности 5(6)-карбоксифлуоресцеина диацетата (CFDA) в конечной концентрации 30 мкМ в течение 30 мин в темноте. Кроме того, подготовьте образец без CFDA (контроль без окрашивания) и образец, обработанный при температуре 95 °C в течение 30 минут перед инкубацией с помощью CFDA (контроль нежизнеспособных/мертвых клеток).
   2. Анализируйте образцы в проточном цитометре, оснащенном возбуждающим лазером с длиной волны 488 нм и детектором излучения CFDA с длиной волны 520 нм. Для статистической надежности регистрируйте примерно 1 x 10⁵ бактериальных событий на образец (это соответствует объему образца 10-100 мкл) со скоростью потока не менее 30 мкл/мин.
   3. Используйте неокрашенный образец для поиска и гейтирования событий, связанных с бактериями, на графике прямого рассеяния (FSC) в логарифмическом масштабе в зависимости от бокового рассеяния (SSC). Нанесите график затворенных бактериальных событий на флуоресцентной гистограмме CFDA в логарифмическом масштабе и используйте образцы неокрашенных и нежизнеспособных/мертвых клеток, чтобы отличить жизнеспособные (CFDA-положительные) от нежизнеспособных (CFDA-отрицательных) популяций.
   4. Рассчитать концентрацию жизнеспособных бактерий можно следующим образом:
      концентрация жизнеспособных бактерий (клеток/мл) = среднее количество CFDA-положительных событий в полученном образце / объеме приобретенного образца (в мл)
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от модели цитометра, количественное определение клеток может потребовать использования проточной цитометрии со счетом шариков.

3. Инкубация яиц

1. После получения от поставщика дайте оплодотворенным яйцам разместиться при комнатной температуре до следующего дня.
2. Тем временем наполните резервуар для воды инкубатора для яиц деионизированной водой и включите питание. Установите температуру 37,7 °C и максимальную относительную влажность 47%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В наших руках яйца инкубируются при относительной влажности в диапазоне 38%-42%, без видимого влияния на ожидаемую скорость эмбриогенеза и успех.
3. Перенесите яйца в инкубатор, чтобы инициировать эмбриогенез. Расположите их на лотке (лотках) инкубатора воздушным карманом вверх (т. е. заостренным концом вниз).
4. Инкубировать яйца в течение 6 дней. Через 4 дня отличите живые эмбриональные яйца от мертвых или неэмбрионавших яиц с помощью миражирования.
   1. Поместите яйцо под/над сильным источником света (свечом), чтобы осветить интерьер и визуально различить его содержимое. Через 3 или 4 дня инкубации у живых эмбриональных яиц появляется сеть кровеносных сосудов, расширяющихся вниз от воздушного кармана. Эта сеть выглядит свернутой и дезорганизованной в мертвых эмбриональных яйцеклетках и полностью отсутствует в яйцеклетках, которые не смогли начать эмбриогенез. Если живой эмбрион виден, он может даже демонстрировать подергивающие движения (Рисунок 1).

4. Подготовка яиц к посеву

1. В день прививки просвечивайте яйца, чтобы определить доступное количество жизнеспособных эмбрионированных и неэмбрионированных яиц. Определите неэмбриональные яйцеклетки (около 10-20% от общего числа) и любые яйцеклетки с мертвыми эмбрионами, как описано в шаге 3.4. Последние следует утилизировать в соответствии с организационными рекомендациями по утилизации биологических отходов.
2. Отметьте место инъекции на скорлупе яйца на высоте 2-5 мм над границей воздушного кармана (рисунок 2A). Продезинфицируйте эту область, протерев папиросной бумагой, смоченной в 70% этаноле (v/v).
3. С помощью иглы 18G осторожно сделайте прокол вмятины на оболочке в месте инъекции, не прокалывая мембрану оболочки (рисунок 2В). Продезинфицируйте место инъекции папиросной бумагой, смоченной на 70% (v/v) этанолом.

5. Посев яиц

1. Вставьте иглу 25G (0,5 мм x 16 мм) в шприц объемом 1 мл и заполните его бактериальной суспензией VBNC. При необходимости удалите прилипшие к внутренней стенке шприца пузырьки воздуха, щелкнув по ней пальцем.
2. Проводите инокуляцию только минеральной водой или суспензией L. monocytogenes (5 x 10³ КОЕ/мл), выращенной в течение ночи в бульоне BHI, в качестве контрольных условий для стерильности и роста, полученных из культивируемых бактерий, соответственно.
3. Введите иглу через проколотую оболочку в месте инъекции и введите ее до упора, под перпендикулярным углом, пока основание иглы не коснется поверхности оболочки (Рисунок 2C). При этом кончик иглы позиционируется для доставки содержимого шприца в аллантоисную полость (в эмбрионированных яйцах) или в белок (в неэмбрионированных яйцах).
4. Осторожно и медленно введите 100 μл инокулюма. Держите угол наклона иглы как можно более неподвижным, находясь внутри эмбриона, чтобы не нанести эмбриону смертельных травм.
5. Осторожно и медленно извлеките иглу и закройте место инъекции круглой наклейкой, чтобы закрыть место введения инокуляции. Для удобства и наглядности используйте наклейки с разным цветом для каждого состояния/группы яиц.
6. Верните привитые яйца в инкубатор еще на 2 дня. Следите за тем, чтобы яйца с развивающимися эмбрионами не находились вне инкубатора (или при температуре ниже 37,7 °C) более 30 минут. При необходимости проводите инокуляцию партиями.

6. Оценка наличия культивируемых клеток в образцах для посева

1. Диспонируйте 100 мкл бактериальной суспензии VBNC в несколько лунок 96-луночного микропланшета. Рассчитайте Количество лунок ≥ 2 x количество инокулированных (зародышевых + неэмбрионированных) яиц.
2. При использовании контрольных условий, указанных в шаге 5.2, распределите по 100 мкл каждого инокулюма (т.е. минеральной воды или культивируемых бактерий) по меньшей мере в три лунки в одном и том же 96-луночном микропланшете.
3. С помощью многоканальной пипетки добавьте по 100 мкл среды BHI в каждую из лунок, подготовленных на предыдущих двух этапах.
4. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в статических условиях, чтобы стимулировать рост бактерий в лунках, содержащих культивируемые бактерии. В зависимости от присутствия культивируемых бактерий и скорости их повторного роста в этих условиях, может потребоваться один или несколько дней инкубации для полного выявления лунок, содержащих культивируемые бактерии.
5. Для каждого инокулята визуально осмотрите и подсчитайте количество лунок, получивших положительные и отрицательные оценки на рост бактерий.

7. Мониторинг жизнеспособности эмбрионов

1. На следующий день после прививки подсвечивайте зародыши яйцеклеток, чтобы проверить их летальность.
2. Отложите яйца с мертвыми эмбрионами и выбросьте их в соответствии с институциональными рекомендациями по утилизации инфицированных биологических отходов.

8. Обработка эмбриональных яйцеклеток

1. Извлеките эмбриональные яйца из инкубатора и проведите свечу, чтобы проверить летальность эмбрионов. Отбраковывайте мертвые эмбрионы и не учитывайте их в итоговых результатах.
2. Снимите наклейку с яйца и продезинфицируйте верхний конец скорлупы (закрывающий воздушный карман) папиросной бумагой, смоченной на 70% (v/v) этанолом.
3. С помощью чистых ножниц для препарирования разрежьте оболочку в месте инъекции, чтобы обнажить воздушный карман. С помощью чистого пинцета для рассечения разорвите внутреннюю мембрану скорлупы, которая отделяет воздушный карман от остальной части яйца.
4. Осторожно высыпьте содержимое яйца в стерильную чашку Петри. С помощью пинцета изолируйте и перенесите эмбрион на новую чашку Петри. При необходимости промойте эмбрион стерильным PBS.
5. Перенесите эмбрион в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл стерильного PBS. Диссоциируйте эмбрион с помощью гомогенизатора (скорость: 10 000 об/мин). Очищайте наконечник диспергирующего инструмента между каждой гомогенизацией, последовательно пропуская его в стерильный PBS, 70% (v/v) этанол и снова стерильный PBS.
6. Пластина 500 мкл гомогената эмбриона на агаре BHI. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение ночи (или дольше, если это необходимо).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В необязательном варианте могут быть нанесены серийные разведения гомогената в случае, если в неразбавленном гомогенате ожидается повышенное количество КОЕ (т.е. > 300).
7. Для каждой группы инокуляции подсчитайте количество яйцеклеток, получивших положительный и отрицательный результат роста L. monocytogenes на агаровых пластинах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на асептические условия, в которых проводится экстракция и гомогенизация эмбрионов, использование неселективной агаровой среды для осаждения гомогенатов эмбрионов влечет за собой риск роста загрязняющих веществ. Использование питательной среды, специфичной для рода/вида, или добавление селективного антибиотика (к которому устойчив только тестируемый штамм бактерий) может уменьшить или предотвратить такое загрязнение.

9. Переработка неэмбрионированных яйцеклеток

1. Извлеките из инкубатора неэмбрионированные яйца. Повторите шаги 8.2 и 8.3, чтобы получить доступ к яичному белку.
2. С помощью микропипетки соберите 500 μл белка и распределите непосредственно по агару BHI. При необходимости инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение ночи или дольше.
3. Для каждой группы инокуляции подсчитайте количество яйцеклеток, получивших положительный результат на рост L. monocytogenes на агаровых пластинах.

Результаты

Чтобы проверить потенциал модели куриного эмбриона для оживления форм VBNC L. monocytogenes с дефицитом клеточной стенки, полученных при голодании в минеральной воде, было важно сопоставить время приготовления бактериального инокулята VBNC (≥ 28 дней) с временем приготовления бактериального инокулята VBNC (28 дней) с временем приготовления эмбриональных яиц (6 дней). Таким образом, реплицированные суспензии L. monocytogenes устанавливали в концентрации 1 x 10⁶ КОЕ/мл в минеральной воде за 28 дней до планируемого дня инокуляции яиц. Было показано, что эта исходная бактериальная концентрация приводит к желаемой остаточной культивируемости <1 КОЕ/мл через 28 дней³¹ года. Окончательная проверка культивируемости бактериальных клеток и уровней жизнеспособности суспензий привела к выбору инокулума VBNC L. monocytogenes, содержащего 1 x 10⁶ жизнеспособных клеток и 0,5 культивируемых клеток на мл. Для экспериментов 100 мкл этого инокулюма (т.е. 1 x 10⁵ жизнеспособных клеток и < 0,1 КОЕ) доставляли в группы эмбрионированных и неэмбрионированных яйцеклеток. Контрольные группы готовили параллельно путем введения эмбрионированных и неэмбрионированных яиц в одинаковую дозу минеральной воды или суспензии L. monocytogenes 5 x 10³ КОЕ/мл, выращенной за ночь в бульоне BHI.

Через 2 дня после инокуляции яйцеклетки обрабатывали для оценки наличия культивируемых L. monocytogenes. Как и ожидалось, не было восстановлено бактериального роста из яиц контрольной группы стерильности, которым вводили минеральную воду, в то время как 100% яиц контрольной группы, обработанных культивируемыми L. monocytogenes , показали положительный рост на агаровых средах (табл. 1). Важно отметить, что все эмбрионы, извлеченные из яиц, инокулированных бактериями VBNC, дали начало росту L. monocytogenes на пластине, в отличие от его полного отсутствия на каждой пластине, спреде с содержимым неэмбрионированной яйцеклетки, введенной теми же бактериями VBNC (табл. 1). Этот результат подчеркивает потребность куриного эмбриона в процессе пробуждения VBNC L. monocytogenes, о чем сообщалось ранее³⁰.

Чтобы определить вероятность того, что рост L. monocytogenes , полученный из эмбриональных яйцеклеток, введенных бактериями VBNC, происходит в результате истинного восстановления клеток VBNC, а не в результате повторного роста затянувшихся культивируемых клеток, необходимо сравнить частоту доз инокулюта, вызывающих рост бактерий до и после пассажа яйцеклеток. Для получения первого многократные дозы по 100 мкл бактериального инокулята VBNC смешивали с BHI, богатой питательными веществами средой, которая не поддерживает возрождение VBNC L. monocytogenes ³², в 96-луночном планшете и инкубировали при 37 °C. Частота 9,5% инокулированных лунок BHI с положительным результатом на рост бактерий (8 из 84) значительно отличалась (точный тест Фишера, p = 1,6 × 10⁻¹⁷) от 100% частоты яиц, демонстрирующих выздоровевшие культивируемые бактерии (табл. 1). Это существенное и статистически значимое различие убедительно указывает на то, что рост L. monocytogenes, восстановленный из эмбриональных яйцеклеток, был в значительной степени обусловлен реактивацией бактерий VBNC. Кроме того, в отличие от своих вегетативных форм, VBNC L. monocytogenes не смог возродиться в неэмбрионированных яйцеклетках, что подтверждает, что оживление клеток VBNC в эмбриональных яйцеклетках не связано с остаточными культивируемыми бактериями в посевном материале.

Рисунок 1: Различение неэмбрионализованных, мертвых эмбрионированных и живых эмбрионированных куриных яиц с помощью миражирования. Статус эмбриогенеза определяют путем освещения яйцеклетки источником света (свечником для яиц) с близкого расстояния. Яйцеклетки, содержащие развивающийся живой эмбрион (видимый или невидимый), имеют сильную сеть кровеносных сосудов, расширяющихся вниз из воздушного кармана. Эта сеть выглядит свернутой и дезорганизованной в яйцеклетках с мертвыми эмбрионами и полностью отсутствует в яйцеклетках, которые не смогли начать эмбриогенез. Создано в BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Подготовка яйца к инокуляции. (А) Место инъекции маркируется в точке на 2-5 мм выше границы воздушного кармана, как видно с помощью миражирования. (В) Оболочка в месте инъекции прокалывается с помощью кончика иглы 18G без прокалывания наружной мембраны оболочки. (C) Инокулюм вводят через иглу 25G (0,5 мм x 16 мм) в аллантоисную жидкость в эмбрионированных яйцах или в белок в неэмбрионированные яйца. Создано в BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Прививочный материал	Культурабельность до выхода яйцаиз яйца	Культивируемость после прохождения яйцеклеткиb
		Зародыши яйцеклеток	p-значениеc	Неэмбриональные яйцеклетки	p-значениеd
Минеральная вода	0/3 (0%)	0/10 (0%)	>0,999	0/10 (0%)	>0,999
VBNC Lm	8/84 (9.52%)	24/24 (100%)	1.63Э-17	0/18 (0%)	0.344
Культивируемый Lm	3/3 (100%)	8/8 (100%)	>0,999	2/2 (100%)	>0,999
aКоличество лунок BHI с ростом бактерий/Количество инокулированных лунок BHI.
ВКоличество яиц с ростом бактерий/Количество привитых яиц.
сСравнение культивируемости до и после пассажа в эмбриональных яйцах (двусторонний точный тест Фишера).
dСравнение культивируемости до и после пассажа у неэмбрионированных яиц (двусторонний точный тест Фишера).

Таблица 1: VBNC L. monocytogenes возвращается к культивируемому состоянию после пассажа в эмбрионированных куриных яйцах. Эмбрионированные и неэмбрионированные куриные яйца (6 дней) инокулировали только 100 мкл минеральной воды или суспензиями минеральной воды VBNC (1 x 10⁴ клеток, 28 дней) или культивируемыми (500 клеток) L. monocytogenes. Через 2 дня эмбрионы (или белки в неэмбрионированных яйцеклетках) восстанавливали и наносили на BHI-агар для оценки наличия культивируемых L. monocytogenes. Частоту культивируемых клеток, присутствующих в инокуляционной дозе перед прохождением яйца, определяли путем смешивания 100 мкл каждой суспензии с бульоном BHI в нескольких лунках 96-луночного микропланшета и подсчета количества лунок с бактериальным ростом после инкубации при 37 °С. Статистическая значимость была рассчитана с использованием точного двуххвостого критерия Фишера, при этом p-значения ≥ 0,05 считались незначимыми. Эта таблица была воспроизведена из³¹.

Обсуждение

Риски для здоровья населения и экономики, связанные с жизнеспособными, но некультивируемыми (VBNC) формами бактериальных патогенов, являются следствием их способности уклоняться от обнаружения традиционными методами, основанными на росте микроорганизмов, а также их толерантности/нечувствительности к большинству противомикробных препаратов, используемых в клинических условиях и пищевой промышленности^26,33. В связи с этим необходимо срочно найти исследовательские инструменты и модели, чтобы лучше понять механизмы, управляющие переходом, поддержанием и оживлением бактериальных клеток в состоянии VBNC.

Во многих аспектах куриный эмбрион является выгодной альтернативой более традиционным моделям исследований млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика). Технически более практично работать с яйцекладущим организмом, так как его эмбриональное развитие происходит быстро и происходит внешне и независимо от прародителя. Важно отметить, что финансовое и логистическое бремя, связанное с производством, содержанием и содержанием куриных яиц и эмбрионов, заметно ниже. Кроме того, легкость получения больших чисел позволяет проводить параллельное тестирование нескольких экспериментальных условий и/или повторений и генерировать всесторонние и статистически надежные данные. Хотя модели, не относящиеся к млекопитающим, такие как рыбы или нематоды, могут обеспечить аналогичные преимущества, куриный эмбрион, как теплокровное позвоночное, эволюционно ближе к человеку и, таким образом, является лучшей исследовательской моделью в таких областях, как иммунология, моделирование заболеваний, развитие и токсикология. С эмбриональными моделями также проще работать с этической точки зрения, особенно в течение первых двух третей развития, когда зрелая ноцицептивная система еще^{не сформировалась}. Это короткое временное окно удобно для приложений, требующих быстрого выполнения (например, тестирование лекарств¹), но может создавать ограничения для анализов, продолжающихся на более поздних стадиях эмбриогенеза или даже после вылупления (например, исследования развития и поведения). Отсутствие адаптивной иммунной системы также делает куриный эмбрион полезным исследовательским инструментом в таких областях, как взаимодействие хозяина и патогена и биология^рака.

Куриный эмбрион широко использовался в изучении микробной вирулентности 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, но умеренно в качестве модели для возрождения патогенов VBNC 27,28,29,30. Здесь мы предоставили подробное методологическое описание того, как эта система in vivo может быть успешно использована для спасения VBNC L. monocytogenes.

Критическим моментом, который следует учитывать в этом методе, является вопрос об остаточном присутствии культивируемых клеток и их потенциале подавлять истинное возрождение клеток VBNC. Ограничения метода производства клеток VBNC для решения этой проблемы (уровни чистоты клеток VBNC в сочетании с исходной концентрацией бактерий) вызывают необходимость использования альтернативных подходов для полного устранения загрязняющих культивируемых клеток или снижения их до незначительного уровня. Такие подходы могут включать, например, нейтрализацию/уничтожение противомикробными препаратами, нацеленными исключительно на культивируемые клетки. В качестве альтернативы, физическое удаление культивируемой клеточной популяции может быть достигнуто на основе уникальных морфофизиологических характеристик (например, формы клетки, поверхностных или цитоплазматических структур или молекул) с помощью проточной цитометрии. Этот подход имеет дополнительное преимущество, позволяющее выделять/очищать субпопуляции клеток VBNC с разным возрастом (т.е. сформированных в разные моменты времени), которые также могут быть проверены в ovo на их способность к возрождению.

Другие моменты этого метода, требующие внимания, включают осторожное обращение с эмбрионированными яйцеклетками, особенно во время и сразу после инъекции (чтобы избежать непреднамеренной травмы, связанной с иглой, или летальности), а также стремление сократить время манипуляций за пределами оптимальной температуры инкубации. Кроме того, несмотря на асептические условия, в которых должно выполняться извлечение, обработка и осаждение эмбрионов, нежелательный микробный рост на агаровых пластинах все же может происходить. Эта проблема может быть решена путем использования агаровых сред с рецептурой (базальной композицией и/или добавками), селективной для интересующего вида бактерий, или путем использования штамма, обладающего устойчивостью к данному антибиотику.

Эта работа демонстрирует куриный эмбрион как простую, но мощную и экономически эффективную модель in vivo для исследования механистических аспектов бактериального покоя. В этом контексте он потенциально может быть использован для идентификации бактериальных факторов, участвующих в процессе пробуждения состояния VBNC, путем скрининга отдельных бактериальных мутантов или в масштабе всего генома с использованием смешанной библиотеки (например, библиотеки транспозонных мутантов).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879	Prepare stock solution at 30 mM in DMSO. Aliquot and store at −20 °C.
Benchtop centrifuge, 24 tubes 1.5–2 mL	Eppendorf
Biosafety cabinet, class II
Brain heart infusion (BHI) agar	BD	248130
Brain heart infusion (BHI) broth	BD	237500
Cell culture flasks, 25 cm2 (T25), vented cap
Centrifuge tubes, 15 mL	Sarstedt
Deionised water			To fill water reservoir of egg incubator
Dissection scissors, pointed ends
Dissection tweezers, curved + serrated ends
Egg candler	FIEM (Guanzate, IT)	IM35
Egg incubator (MG 244 Mercurius SH)	FIEM (Guanzate, IT)	SH244AD	Capacity for 144 chicken eggs (rocking trays) + 100 (hatching tray)
Eggs, fertilized	PFIE (INRAE Val-de-Loire, FR)		From white Leghorn chickens, raised in specific pathogen-free conditions
Ethyl alcohol, 70% (v/v)
Flow cytometer (CytoFLEX S)	Beckman Coulter	V0-B2-Y4-R0
Heating block (95 °C)
Incubator (37 °C)			For growth of bacteria on agar plates
Incubator w/ shaking (37 °C, 200 rpm)	INFORS-HT		For growth of liquid bacterial cultures
Inoculation loops
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf
Microtiter plates w/ lid, 96-well, transparent	Greiner		To prepare serial dilutions and analyze samples in flow cytometer
Mineral water			Autoclaved (121 °C, 20 min) and sterile-filtered (0.2 µm)
Needle, hypodermic, 18G	Terumo	AN1838R1	Dimensions: 1.2 × 38 mm
Needle, hypodermic, 25G	Terumo	AN2516R1	Dimensions: 0.5 × 16 mm
Petri dishes, 10 cm ø	Greiner		For preparation of BHI agar plates and processing of chicken embryos
Phosphate buffered saline (PBS), 1X	Gibco	14190
Plate spreaders
Serological pipettes, disposable, 5 + 10 + 25 mL
Spectrophotometer (UV-Vis) + cuvettes 1 mL
Stickers, round, colored (Tough-Spots)	Dutscher		Dimensions: 9.5 mm ø
Syringe, Luer slip, 1 mL	Terumo
Tissue homogenizer	IKA		ULTRA-TURRAX T25 disperser + S25N 8G dispersion tool
Vacuum pump