معتمد من قبل باتريك كافرتى زمالات ما بعد الدكتوراه من جمعية التصلب المتعدد في كندا.

الجزء 1 : قبل انشاء التجريبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أسبوع واحد في وقت مبكر ، لم الذباب لتوليد اليرقة التي تعبر عن GFP تحت سيطرة أحد المروجين الدبقية محددة. لتجربتنا نحن تصور GFP المفتاحية مع تسلسل توطين النووية التي أعرب عنها في الخلايا الدبقية باستخدام عكس القطبية (الريبو) المروج (3 ، 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قسائم تغطية ما لا يقل عن يوم واحد في وقت مبكر عن طريق نقع 18 ملم زلات تغطية الجولة لمدة 10 دقيقة في 1 ٪ بولي - L - حل ليسين والهواء الجاف بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل التجربة ، وتنظيف الغرفة Chamlide ثقافة مكونات المغناطيسي عن طريق نقع بين عشية وضحاها في الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التجربة ، وإعداد مستنبت بإضافة مصل بقري جنيني ، والحل البنسلين الستربتوميسين ، والانسولين الى 10 مل من المتوسط ​​شنايدر باستخدام تقنية الحشرة العقيم. تركيزات العمل هي : 1X مصل بقري جنيني ؛ 100U/ml البنسلين ؛ الستربتوميسين 0.1mg/ml ؛ و 0.2 ملغ / مل الانسولين في المتوسط ​​شنايدر الحشرات (معدلة من (5)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للغرفة الثقافة في الهواء الجاف في زنزانة هود الثقافة. يغسل الايثانول المتبقية من الغرفة الثقافة عن طريق الشطف مع مستنبت المعدة. </li></ol> الجزء 2 : تشريح للمجمع العين والدماغ ذبابة الفاكهة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد اليرقة الثالثة طور مرحلي تجول من جانب قنينة يطير وضعها في قطرة من مستنبت المبردة على طبق بتري على الجليد لعدة دقائق. تقشعر لها الأبدان اليرقة ينصح لإبطاء تقلصات الجسم تحوي لسهولة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان اليرقة المبردة في قطرة من مستنبت على طبق المغلفة Sylgard تشريح تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح تحت المجهر ، واستخدام زوج من ملقط دومون غرامة لنتشبث اليرقة حوالي ثلث الطريق من النهاية الخلفية. انتظر حتى يقذف خطاطيف اليرقة فمه من نهاية الأمامي. فهم الفم السنانير مع الزوج الثاني من ملقط على امتداد كامل. تشريح اليرقة ، وسحب ببطء أزواج اثنين من الملقط في اتجاهين متعاكسين. مجمع العين والدماغ ، جنبا إلى جنب مع الغدد اللعابية ، والهيئات الدهون ، والأنسجة تخيلي ، وسوف تسحب بعيدا عن الجسم اليرقات. لا سحب السنانير الفم جدا إلا أنها سرعان ما سوف المسيل للدموع قبالة مجمع العين والدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم بعيدا الغدد اللعابية ، والهيئات الدهون ، وأقراص تخيلي باستخدام مقص المقص غاية في الدقة. وسيتم إرفاق نصفي الدماغ والعين إلى أقراص الحبل البطني العصب والسنانير الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان غطاء 18 مم زلة على شريحة زجاجية. ترك حافة واحدة من زلة تغطية تتدلى على حافة الشريحة من أجل التقاط ما يصل في وقت لاحق لتغطية زلة. إضافة قطرة من مستنبت على قسيمة 18 مم غطاء. نقل مجمع العين والدماغ المتوسط ​​في الثقافة عن طريق استيعاب السنانير الفم بالملقط. لا فهم مجمع العين والدماغ مباشرة مع ملقط أو سوف تلف الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص تشريح غرامة ، وتقليم قبالة مصب السنانير من مجمع العين والدماغ وتجاهل. إزالة السنانير الفم المهم للتصوير العيش كما السنانير الفم ستواصل عقد في المتوسط ​​مما تسبب في نسيج الثقافة للتحرك خلال الفحص المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الهجرة الدبقية داخل القرص تخيلي العين ، وقطع بعناية ساق البصرية ، والأنسجة الرقيقة التي تربط الدماغ والعين القرص ودفع بعيدا أو تجاهل الدماغ (انظر الشكل 1A). لتصور الدبقية داخل ساق البصرية ، ويترك الدماغ ، وساق البصرية ، وقرص تخيلي العين سليمة (انظر الشكل 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقط ساترة باستخدام ملقط ورسم دائرة حول الأنسجة تحت المصالح مع علامة دائمة. هذه الحلقة سوف تساعد في تحديد مكان وجود الأنسجة للفحص المجهري في الجزء 4. </li></ol> الجزء 3 : تركيب القرص العين تخيلي في غرفة الثقافة المغناطيسي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط ، فهم على حافة اعدام ساترة. نقل إلى لوحة ساترة السفلي من الغرفة المغناطيسي Chamlide دون الإخلال في نسيج الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع السيليكون يا الدائري على الجسم الرئيسي للغرفة Chamlide. تثبيت الجسم الرئيسي في أعلى لوحة أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مستنبت ببطء الى قاعة المحكمة. لا إضافة مستنبت بسرعة كبيرة جدا أو سيتم بالانزعاج الأنسجة من الاهتمام. لا تملأ تماما الغرفة للسماح لتبادل الغاز تحت الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان برفق غطاء غير مرئي في أعلى الغرفة Chamlide. </li></ol> الجزء 4 : التصور ترحيل الخلايا الدبقية في القرص العين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان قاعة الثقافة في مرحلة المجهر مبائر أو مضان. تحديد موقع العينة باستخدام الدائرة على ساترة كمرجع على التكبير منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على عينة باستخدام عدسة 40X. تسمح الأنسجة لتترسب على ساترة. التقاط الصور من القرص البصري للعين أو ساق في كل 10 ساعة على مدى 15min 3-4. قد الأنسجة نشل والانتقال من التركيز. وسوف تركز النسيج يدويا قبل التقاط الصورة تخفيف الهو المشكلة. </li></ol> الجزء 5 : نتائج الممثل : بروتوكول يسمح لنا القيام بشكل صحيح ، نحن لجمع سلسلة من الصور من GFP الموسومة الخلايا الدبقية التي هاجرت من السويقة البصرية في العين تخيلي القرص (الشكل 1 دينار بحريني). بينما يعيش التصوير لمدة 60 دقيقة كانت كافية لمراقبة التغيرات في مواقف نوى الدبقية داخل قرص نوع العين البرية تخيلي ، نوى الدبقية في متحولة عن الجينات اللازمة لخلايا الدبقية الهجرة فشلت تماما للخروج من السويقة البصرية (السهام الشكل 1 FH). لدينا مثقف العين والدماغ مجمعات لفترات ما دام 240 دقيقة قبل رصد تدهور الأنسجة المستزرعة. بعد نقطة من الوقت 240 دقيقة نبدأ لمراقبة الخلايا GFP إيجابية في الأجلين المتوسط ​​الثقافة المحيطة مثقف العين والدماغ مجمعات (السهم الشكل 2 C). بالإضافة إلى ذلك سيتم في GFP تتراكم في البقع المنتشرة في جميع أنحاء الأنسجة مما يشير إلى انهيار سلامة الأنسجة. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> الشكل 1 : تصوير مباشر من GFP الموسومة نوى الدبقية في نوع البرية النامية والنظم البصرية متحولة. A ، E) الصور التي يتم التقاطها باستخدام الفرق المقابل تدخل (DIC) المجهري البرية من نوع المثقف ومتحولة العين تخيلي أقراص (ED). في نوع البرية ، ولدت في الخلايا الدبقية وترحيل من ساق البصرية (OS) في قرص العين. تمت إزالة المخ لتسهيل التسوية والتصوير من القرص العين تخيلي. دينار بحريني) المجهري الإسفار من القرص نوع العين مثقف البرية تخيلي في الفقرة (أ) عند 0 يكشف عن 30 ، و 60 نقطة الوقت دقيقة ، GFP الموسومة نوى الدبقية ترحيل داخل القرص العين. FH) المجهري الإسفار لمجمع العين والدماغ في متحولة (E) في 0 ، 30 ، 60 نقطة والوقت دقيقة يدل على توقف GFP الموسومة نوى الدبقية داخل السويقة البصرية (السهم). وقد تركت الدماغ (BR) تعلق على ساق البصرية لتسهيل تصوير الدبقية داخل ساق. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> الشكل 2 : تصوير مباشر من GFP الموسومة الأغشية الدبقية في قرص نوع العين البرية تخيلي. لقد نجحنا في تربيتها العين والدماغ مجمعات لمدة 240 دقيقة الفترات. الأنسجة مثقف أطول من 240 دقيقة تبدأ لكسر. المتوسط ​​الثقافة المحيطة القرص العين تخيلي (ED) ، السويقة البصرية (OS) ، والفص الدماغ (BR) عند 0 (أ) و 150 دقيقة (B) ، مقارنة ب 300 مرة في الدقيقة نقطة (C) ، هي حرة من GFP إيجابية الخلايا المشار إليها بواسطة سهم.

<ol>
	<li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells.">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li><li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+migration+in+the+eye+disc.">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster.">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في هذا البروتوكول وصفنا مراقبة الهجرة الخلايا الدبقية إلى القرص العين تخيلي باستخدام المجهر العيش. في مثالنا اكتب البرية (الشكل 1 م) ، استخدمنا علامة GFP النووية لمراقبة حركة الخلايا الدبقية في القرص العين على مدى ساعة واحدة. في متحولة عن الجينات المطلوبة للمرشح ل...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Poly-L-lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider's Insect Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0146</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4458</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin solution from bovine pancreas</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chamlide Magnetic chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Live cell Instrument</td>
<td>CM-R-10</td>
<td>35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultra fine clipper scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine scientific tools</td>
<td>15200-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 forceps</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine scientific tools</td>
<td>11251-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of glial cell migration in the drosophila eye imaginal disc

يجب أن الخلايا الدبقية كل من الفقاريات واللافقاريات الكائنات على الهجرة الى مناطق الهدف النهائي من أجل ensheath ودعم الخلايا العصبية المرتبطة بها. بينما أحرز التقدم الذي أحرز مؤخرا لوصف الهجرة حية من خلايا الدبقية في الجناح العذراء النامية (1) ، ودراسات<em&gt; ذبابة الفاكهة</emوقد شملت&gt; الهجرة الخلية الدبقية عادة فحص الأنسجة الثابتة. تحليل مجهري للخلايا حية متحركة يوفر القدرة على دراسة السلوك الخلوية في جميع مراحل عملية الهجرة ، بما في ذلك تحديد سعر والتغيرات في اتجاه النمو. يقترن استخدام الأدوات الوراثية ، ويمكن استخدام التصوير العيش لتحديد أدوار أكثر دقة لجينات معينة في عملية التنمية. العمل السابقة Silies<em&gt; وآخرون.</emوقد وصفت&gt; (2) هجرة الدبقية مصدره السويقة البصرية ، وهو الهيكل الذي يربط بين العين والدماغ النامي ، في قرص تخيلي في أنسجة العين الثابتة. نحن هنا الخطوط العريضة لبروتوكول لدراسة الهجرة حية من خلايا الدبقية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين تخيلي. علينا أن نستفيد من خط ذبابة الفاكهة التي تعبر عن GFP في الدبقية النامية لمتابعة تطور الخلايا الدبقية في نوع الحيوانات البرية ومتحولة.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc at JoVE.com

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة الهجرة من الخلايا الدبقية في عين ذبابة الفاكهة النامية باستخدام التحليل المجهري مع الخلايا الحية المقترنة GFP الدبقية المفتاحية.

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

live-imaging-glial-cell-migration-drosophila-eye-imaginal

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  University of British Columbia - UBC. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة الهجرة من الخلايا الدبقية في عين ذبابة الفاكهة النامية باستخدام التحليل المجهري مع الخلايا الحية المقترنة GFP الدبقية المفتاحية.

Video: Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

تشريح أقراص تخيلي من يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي 3

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

تصور لايف ذبابة الفاكهة الدبقية العصبية والعضلية ، تقاطع مع الأصباغ نيون

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

تشريح وتركيب<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء أقراص العين

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...