פטריק Cafferty נתמך על ידי מענק דוקטורט מן האגודה לטרשת נפוצה בקנדה.

חלק 1: טרום הניסוי הגדרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבוע מראש, חבר זבובים ליצור זחל המבטאים GFP בשליטת היזם גליה ספציפי. לצורך ניסוי אנו דמיינו GFP מתוייגים עם רצף לוקליזציה גרעיני לידי ביטוי ותאי גלייה באמצעות קוטביות הפוכה (repo) מקדם (3, 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תלושי לכסות לפחות יום אחד מראש על ידי השריית 18 מ&quot;מ עגול תלושי לכסות במשך 10 דקות ב -1% פולי-L-ליזין פתרון אוויר יבש למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני הניסוי, לנקות תא Chamlide תרבות מגנטי על ידי השריית הרכיבים לילה אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי, להכין מדיום על ידי הוספת תרבות בסרום שור עוברית, פניצילין, סטרפטומיצין פתרון, אינסולין 10 מ&quot;ל של מדיום חרקים שניידר באמצעות הטכניקה aseptic. ריכוזי עובדים הם: 1X העובר שור בסרום; 100U/ml פניצילין, סטרפטומיצין 0.1mg/ml; ו 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אינסולין בינוני חרק של שניידר (שונה מ - (5)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר קאמרית תרבות לייבוש באוויר במנדף תרבית תאים. לשטוף אתנול שיורית מהאולם תרבות ע&quot;י שטיפה בינוני תרבות מוכנים. </li></ol> חלק 2: Dissection של המתחם תסיסנית העין למוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הזחל שלישי instar נדודים מהצד של הבקבוקון זבוב מקום טיפת בינוני תרבות מקורר על צלחת פטרי על קרח למשך מספר דקות. Chilling הזחל מומלץ להאט התכווצויות הגוף peristaltic על מנת להקל על דיסקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחל צונן בטיפת בינוני תרבות על צלחת מצופה Sylgard תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש זוג מלקחיים דומון בסדר בתקיפות לתפוס את הזחל כשליש הדרך מהקצה האחורי. המתן עד הזחל מוציא ווים פיו מסוף הקדמי. אחוז הפה קרסים עם זוג השני של מלקחיים על הרחבה מלאה. כדי לנתח את הזחל, לאט למשוך את שני זוגות מלקחיים בכיוונים מנוגדים. מתחם עין המוח, יחד עם בלוטות הרוק, גופים שומן, רקמת דמותי, ימשוך מהגוף הזחל. אל תמשוך הפה ווים מהר מדי אחרת הם יקרעו את מורכבות העין למוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך בלוטות הרוק, גופים שומן, דיסקים דמותי באמצעות אולטרה דק במספריים גוזז. שתי האונות של המוח העין דיסקים יצורף חוט העצב הגחון ווים הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 18 מ&quot;מ לכסות להחליק על גבי זכוכית נושאת. השאירו קצה אחד של להחליק את מכסה תלוי מעבר לקצה של השקופית כדי מאוחר יותר להרים את מכסה להחליק. הוסף טיפה של תרבות בינוני על גבי תלוש 18 מ&quot;מ מכסה. מעבירים את מורכבות העין אל המוח בינוני התרבות ידי אחיזה ווים הפה עם מלקחיים. אין להבין את מורכבות העין למוח ישירות עם מלקחיים או רקמת ייפגעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה בסדר, לקצץ את הפה ווים מתסביך העין למוח וזורקים. הסרת הווים הפה חשוב הדמיה לחיות כמו ווים הפה ימשיך החוזה במדיום תרבות גרימת רקמת לעבור במהלך במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש הגירה גליה בתוך הדיסק עין דמותי, בזהירות לחתוך את גבעול אופטיים, הרקמה הדקה שמחברת את המוח ואת הדיסק העין להרחיק או להשליך את המוח (ראה איור 1 א). כדי להמחיש גליה בתוך גבעול אופטיים, להשאיר את המוח, גבעול אופטיים, ואת הדיסק עין דמותי שלם (ראה איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את coverslip באמצעות מלקחיים לצייר עיגול מתחת סביב הרקמה של עניין עם סמן קבע. מעגל זה יהיה סיוע באיתור רקמה במיקרוסקופ בחלק 4. </li></ol> חלק 3: הרכבה הדיסק עין דמותי בתא תרבות מגנטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לתפוס את הקצה של coverslip תלוי. מעבירים את coverslip לצלחת התחתון של החדר המגנטי Chamlide מבלי להפריע את הרקמה בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את סיליקון O-Ring על הגוף העיקרי של החדר Chamlide. התקן את הגוף העיקרי על גבי צלחת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף בינוני תרבות לחדר. אל תוסיף את המדיום תרבות מהר מדי או רקמות של עניין יפריעו. לא לגמרי למלא את התא כדי לאפשר חילוף הגזים בחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום לכסות בעדינות בלתי נראה על גבי תא Chamlide. </li></ol> חלק 4: ויזואליזציה של תאים נודדים גליה דיסק העין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חדר תרבות על הבמה של מיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. אתר את המדגם באמצעות עיגול על coverslip כהתייחסות על בהגדלה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על מדגם באמצעות עדשה 40X. אפשר הרקמה להתיישב על coverslip. צלמו תמונות של הדיסק עין או גבעול אופטיים בכל 10-15min במשך 3-4 שעות. רקמות עשויה להתעוות ולהעביר את המיקוד. מיקוד ידני את הרקמה לפני לכידת תמונה שיקלו ההוא הבעיה. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: בביצוע נכון, פרוטוקול שלנו אפשרה לנו לאסוף סדרה של תמונות של ה-GFP-tagged ותאי גלייה כי היגרו גבעול אופטיים לתוך הדיסק עין דמותי (איור 1 BD). בעוד הדמיה לחיות לתקופה 60 דקות היה די כדי לצפות לשינויים בעמדות של גרעינים גליה בתוך דיסק עין הבר סוג דמותי, גרעינים גלייה מוטציה של הגן הכרחי נדידת תאים גליה נכשלה לחלוטין כדי לצאת גבעול אופטיים (חיצים איור 1 FH). יש לנו תרבות העין למוח מתחמי לתקופות עוד 240 דקות לפני התבוננות התדרדרות רקמת תרבותי. בעקבות נקודת זמן 240 דקות אנו מתחילים להתבונן בתאי ה-GFP חיובי בינוני התרבות הסובבת תרבותי העין למוח מתחמי (חץ איור 2 ג). ב-GFP בנוסף יהיה לצבור נקודות מפוזר בכל הרקמות מציע פירוט של רקמות שלמות. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> איור 1: הדמיה חיה של גרעינים GFP-tagged גליה בסוג בר בפיתוח מערכות ראייה מוטציה. A, E) תמונות שצולמו באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה של סוג בר תרבותי מוטציה העין דמותי דיסקים (ED). בסוג בטבע, ותאי גלייה נולדים ולהעביר מן גבעול אופטי (OS) לתוך דיסק העין. המוח הוסר כדי להקל על השטחת הדמיה של הדיסק עין דמותי. BD) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הדיסק עין בר תרבותי סוג דמותי ב (א) על 0, 30, 60 נקודות זמן דקה מגלה GFP-tagged גליה גרעינים נודדים בתוך הדיסק העין. FH) מיקרוסקופ פלואורסצנטי של המתחם העין למוח מוטנטי (ה) על 0, 30, 60 נקודות זמן דקה מדגים השתהות של גרעינים-GFP tagged גליה בתוך גבעול הראייה (חץ). המוח (BR) הושארה המצורפת גבעול הראייה לאפשר הדמיה של גליה בתוך גבעול. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> איור 2: הדמיה חיה של ה-GFP-tagged ממברנות גלייה דיסק עין הבר סוג דמותי. יש לנו תרבות בהצלחה את העין למוח מתחמי עבור 240 דקות תקופות. בתרבית רקמה יותר מ 240 דקות מתחיל להישבר. בינוני התרבות הסובבת את הדיסק עין דמותי (ED), גבעול אופטי (OS) האונה במוח (BR) ב 0 (א) ו - 150 דקות (ב), לעומת 300 דקות זמן נקודה (C), ללא תשלום ה-GFP חיובי תאים, שמסומן על ידי החץ.

<ol>
	<li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells.">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li><li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+migration+in+the+eye+disc.">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster.">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בפרוטוקול זה אנו מתארים תצפית של נדידת תאים גליה לתוך הדיסק עין דמותי חיים באמצעות מיקרוסקופ. בדוגמה שלנו סוג בר (איור 1 לספירה), השתמשנו סמן GFP גרעיני לצפות תנועת התא גליה דיסק העין במשך שעה אחת. בשנת מוטציה של הגן מועמד נדרש נדידת תאים גליה כיום תחת מחקר במעבדה שלנו, צפינו השתהות של גרעיני תאים גליה בתוך גבעול הראייה בתקופה של שעה (איור 1 EH). האסטרטגיה שלנו ניתן להתאים לדמיין פירוט של התנהגות הסלולר מוסדר על ידי הגנים שלנו של עניין. לדוגמה, קרום ממוקד מולקולת ה-GFP, כגון mCD8-GFP, ניתן לבטא גליה לחזות תהליכים תאיים. השימוש סמן מחויב קרום GFP יאפשר לנו לקבוע אם ותאי גלייה ב מוטנטים שלנו מסוגלים הארכת תהליכים תאיים כגון filopodia לתוך הדיסק העין. בדומה אקטין מתוייגים עם GFP או טובולין מתוייגים עם GFP יכול לבוא לידי ביטוי גליה המתפתח לדמיין שינויים cytoskeleton במהלך נדידת תאים גליה. בנוסף, בדיקת ה-GFP שכותרתו תאים בודדים גליה מוטציה ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ חיים (6). טכניקה זו תאפשר לנו בצורה מדויקת יותר לתאר את הדרישה הגן שלנו עניין בוויסות הגירה של תאים גליה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Poly-L-lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider's Insect Media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0146</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4458</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin solution from bovine pancreas</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chamlide Magnetic chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Live cell Instrument</td>
<td>CM-R-10</td>
<td>35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip</td>
</tr>
<tr>
<td>Ultra fine clipper scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine scientific tools</td>
<td>15200-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 forceps</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine scientific tools</td>
<td>11251-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of glial cell migration in the drosophila eye imaginal disc

ותאי גלייה של חוליות והן חסרי חוליות האורגניזמים חייבים לנדוד לאזורים היעד הסופי כדי ensheath ותמיכה נוירונים הקשורים. למרות ההתקדמות האחרונות נעשה כדי לתאר את ההגירה של תאים חיים גליה באגף גלמי פיתוח (1), מחקרים של<em&gt; תסיסנית</em&gt; נדידת תאים גליה יש מעורבים בדרך כלל בדיקה של רקמת קבוע. ניתוח מיקרוסקופי של תאים חיים ניעתי מציעה את היכולת לבחון את התנהגות הסלולר לאורך כל תהליך הנדידה, לרבות קביעת שיעור ושינויים בכיוון של צמיחה. יחד עם שימוש בכלים גנטיים, הדמיה חיה יכול לשמש כדי לקבוע תפקידים מדויקת יותר עבור גנים ספציפיים בתהליך של פיתוח. עבודות קודמות על ידי Silies<em&gt; Et al.</em&gt; (2) תיאר את ההגירה של גליה שמקורם גבעול הראייה, מבנה שמחבר את עין בפיתוח המוח, לתוך דיסק העין דמותי ברקמות קבוע. כאן אנו מתאר פרוטוקול לבחינת הגירה של תאים חיים אל גליה<em&gt; תסיסנית</em&gt; עין דמותי דיסק. אנו מנצלים את קו תסיסנית המבטא GFP ב גליה פיתוח לעקוב אחר התקדמות תא גלייה בסוג פראי בחיות מוטציה.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc at JoVE.com

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

live-imaging-glial-cell-migration-drosophila-eye-imaginal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Views.  University of British Columbia - UBC. כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

Video: Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד