ونحن ممتنون لتشون لان هسو ويو تشي يانغ لإعداد الطعام يطير والحفاظ على الأسهم ذبابة، وسو بينغ لي و إمب التصوير الأساسية لمساعدتهم مع المجهر متحد البؤر. وقد دعمت هذه الدراسة من المنح إلى يهس (نسك 101-2321-B-001 -004، نسك 100-2321-B-001 -012، نسك 102-2321-B-001 -002، موست 103-2311-B-001 -035 -MY3) من المجلس الوطني للعلوم ووزارة العلوم والتكنولوجيا في جمهورية الصين.

إعداد 1. ما قبل التجريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض الطيران التي تعبر عن النووي البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت mδ0.5-GAL4 والثقافة عند 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكروويف 0.7 غرام من الاسعار المنخفضة للذوبان الاغاروز في 10 مل من المالحة الفوسفات مخزنة-1X (PBS) حتى يذوب تماما agarose. حافظ على 0.7٪ هلام انصهار منخفضة في الحاضنة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جميع المعدات، بما في ذلك ملقط، مقص، 42 ملم coverslips س 0.17 ملم، 9 جيدا لوحة بقعة الزجاج، وغرفة الثقافة المغناطيسي، مع 70٪ من الإيثانول لأكثر من 12 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مستنبت 3: متوسط ذبابة الفاكهة شنايدر تستكمل مع 2٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 0.5٪ البنسلين ستربتومايسين، و 1.25 ملغ / مل الانسولين. لتجنب التلوث، وإعداد المتوسطة في غطاء ثقافة الخلية. تخزين مستنبت مستعد في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون شهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف منصة التشريح ومجرب &quot;يدي مع الايثانول 70٪ قبل البدء في تشريح. </li></ol> تشريح 2. القرص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف جميع المعدات من 70٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد اليرقة الطور الثالث من قارورة ذبابة. لتجنب التلوث من القارورة الطيران، وغسل يرقة في برنامج تلفزيوني 1X 3X لإزالة النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح اليرقة تنظيفها في 1 مل من مستنبت (في RT) في 9 جيدا الزجاج لوحة بقعة تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم اليرقة مع زوج من الملقط في حوالي ثلث الطريق من نهاية الخلفي وملقط آخر في ربط الفم. سحب الملقط في اتجاهين متعاكسين للافراج عن الأنسجة الداخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغدد اللعابية، الدهون في الجسم، وبشرة من مجمع العين والدماغ تعلق على ربط الفم. إذا لا تزال تعلق على الحبل العصبي البطني، وقطع بعيدا مع المقص. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج واحد من ملقط لفهم ورطتها الفم وزوج واحد من ملقط لإزالة قطعة من الأنسجة التي شاركnnects العقول وأقراص العين في الجزء الظهري. ملاحظة: إذا لم تتم إزالة هذا النسيج، وأقراص العين antennal اثنين تكون قريبة من بعضها البعض والدماغ. فإن أقراص العين ثم لا الاستلقاء على ساترة لهذا النسيج، والدماغ، والقرص العين antennal ستشكل مثلث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير مجمع كامل للموقف بطني-التصاعدي. إزالة خيوط الذي يربط ربط أو القرص إلى الدماغ. ملاحظة: إذا لم يتم إزالة خيوط، فإن القرص العين antennal انقسم الى اثنين من قطعة عند إزالة ربط الفم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ربط الفم. والحرص على عدم تلف القرص العين أثناء العملية. ملاحظة: قرص العين هو الآن مجانا على المديين المتوسط ​​وتوصيل فقط إلى الدماغ عن طريق ساق البصرية. </li></ol></li></ol> 3. تركيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف وتجميع مكونات غرفة مع 42 مم × 0.17 مم ساترة. إرفاق طبقة مزدوجة من O-خواتم إلى مركز الغطاء زلة لعقد عشرالبريد الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرفة تجميع مع ساترة. وضع 42 مم × 0.17 مم ساترة على متقبل المرحلة. وضع السيليكون يا الدائري على غلاف زلة. وضع قاعدة. قفل خزانة الختم ووضع الغطاء (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية مجمع العين والدماغ تشريح لمركز O-حلقة باستخدام micropipette 20 ميكرولتر مع طرف 10-200 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة معظم المتوسطة وإضافة 12 ميكرولتر من 0.7٪ الاغاروز ذوبان منخفضة (عند 37 درجة مئوية) للعينة. ملاحظة: إن موقف القرص العين يمكن أن تتغير مع ملقط قبل التصلب من الاغاروز. فإن الاغاروز يصلب خلال 5 دقائق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من مستنبت في درجة حرارة الغرفة إلى مركز O-حلقة. كل حلقة O-يمكن تحميل ما يصل إلى 4 عينات. تأكد من أن الاغاروز يتم لصقها إلى O-عصابة لتجنب الانجراف من العينة. ملاحظة: لا تهوية أو تداول متوسطة أمر ضروري. </li></ol></li></ol>4. متحد البؤر المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الغرفة على مرحلة مجهر متحد البؤر مقلوب لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن درجة الحرارة. وهذا يمكن منع Z-محور الانحراف أثناء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التصوير الحي على المدى الطويل، والتحقق ما إذا كانت الأنسجة سليمة من قبل التفاضلية المجهري تدخل التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب الضيائية، واستخدام قوة الليزر أقل من 2 ميغاواط. استخدام هدفا 40X للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على 62 ميكرومتر الصور Z-المكدس في 12 دقيقة في الفترة الفاصلة البصرية من 1 ميكرون. الحصول على 40 دورات المسح على ما مجموعه 10 ساعة. تأكد من أن كل دورة تتضمن 12 دقيقة من التصوير و 3 دقائق من الراحة. </li></ol>

<ol>
	<li>Cohen, S. M., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+disc+development.">Imaginal disc development.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 2, 747-842 (1993).</li><li>Auerbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+legs,+wings+and+halteres+in+wild+type+and+some+mutant+strains+of+Drosophila+melanogaster.">The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster.</a> Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila Melanogaster. , 1277-1316 (1993).</li><li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila.">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li><li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye.">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li><li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions.">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li><li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK/Pnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe/AF6.">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li><li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster.">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+differentiation+in+Drosophila.">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, ., Wittbrodt, F., J, E. H., Stelzer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway.">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae.">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li><li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc.">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li><li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs.">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li><li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis.">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li><li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila.">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li><li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro.">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

في هذه الدراسة، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لعلى المدى الطويل تجربة التصوير مباشرة على أقراص تخيلي ذبابة الفاكهة. قضينا الكثير من الوقت في ممارسة تشريح دقيق لتجنب الضرر القرص والسماح للمرفق من القرص بالقرب لل coverslips. حاولنا بولي-L-ليسين (PLL) وانخفاض ذوبان الاغاروز لعقد الأنسجة. في النهاية، أظهر الاغاروز ذوبان منخفضة قدرة أفضل على عقد الأنسجة. وعلى الرغم من استخدام القرص العين فقط في هذه الورقة لإثبات وقوع العادي للتمايز مبصرة والتناوب ommatidial خلال 10 ساعة فترة التصوير الحي، ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة على قرص واحد آخر على الأقل، القرص الجناح، كما هو موضح في دراسة سابقة 3. وعلاوة على ذلك، وإعداد مستنبت والإعداد والتصوير الحية هي بسيطة ولا تتطلب تهوية أو تداول المتوسط. تصوير حي المستمر يمكن أن توفر تسلسل زمني واضح لعشية البيولوجيةاليلة. في تقريرنا السابق من التمايز الدبقية والهجرة في القرص العين، قدمنا دليل مباشر على أن الدبقية التفاف تفرق من الدبقية الموجودة بعد الهجرة إلى الجزء الأمامي من القرص العين 3. على المدى الطويل ثقافة فيفو السابقين تسمح لوضع العلامات تنشيط ليزر معين من الخلايا، مثل الصور وتحويل البروتين الفلوري Kaede الذي، لمتابعة تصرفاتهم 3. كما يمكن أن تستوعب اختبار المواد الكيميائية التي تضاف مباشرة إلى مستنبت. وبالتالي، يمكن استخدامه كمنصة فحص المخدرات. منذ بعض عملية ديناميكية تحدث في غضون دقائق أو ثواني، مطلوب قرار زمنية عالية. لتعزيز القرار الزماني، وعلى ضوء ورقة المجهري 15، 16 أو الغزل القرص المجهري 17 قد يكون خيارا جيدا. حالة الثقافة الحالية ليست مثالية. أنه لا يدعم نمو القرص. خلية صويدعم roliferation فقط لمدة تصل إلى 12 ساعة 3. بعد 12 ساعة في الثقافة فيفو السابقين، فإن معدل التمايز مبصرة يبدأ في الانخفاض 3. قد يكون هذا بسبب عدم وجود بعض العناصر الغذائية أو الهرمونات. لأن الفرق كبير في هذا مستنبت هو تركيز عال من الأنسولين، قد يكون الأنسولين الثدييات جزئيا محاكاة وظيفة الببتيد الذي يشبه الانسولين الذاتية. إضافة استخراج ذبابة، والحشرات طرهالوز السكر في الدم، وتركيز مختلف من هرمون طرح الريش 20 hydroxyecdysone، لم تكن مفيدة 3. ومع ذلك، فإن الفترة الثقافة 12-18 ساعة كافية لدراسة العديد من العمليات التنموية. وقد تم مقارنة طرق زراعة بديلة لزراعة أقراص تخيلي اليرقات 3، ويوفر لدينا زراعة والتصوير شرط أطول نافذة الوقت، ومعظم الوضوح للتصوير الحي. على الرغم من أن أقراص داخل اليرقات الحية والشرانق يمكن تصوير مباشرة18، 19، 20، 21، 22، نافذة قرار والوقت للملاحظات محدودة. اليرقات في وقت متأخر وأقراص العذراء يمكن تربيتها لفترة طويلة 23 و 24، ولكن أقراص الخضوع التشكل كبير. للاستفادة من وأقراص اليرقات 2D مسطحة، لدينا طريقة زراعة والتصوير هو الحل الأفضل حتى الآن.

وكانت ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي اليرقات نظام تجريبي يفضل لدراسة مجموعة واسعة من الآليات البيولوجية. هذه الأقراص المنغلفة من ظهارة الجنينية وتصبح الهياكل الكيس مثل بنتها طبقتين الظهارية، Peripodial الظهارة (PE) والقرص المناسب (DP) 1 و 2. الخلايا قرص تخيلي تتكاثر وتتمايز تدريجيا خلال مراحل اليرقات والعذارى وتطوير في نهاية المطاف في هياكل الجسم الكبار. نظرا لهيكل من طبقتين مسطح وبسيط للأقراص تخيلي، فهي سهلة لمراقبة عند تشريح من اليرقات. ومع ذلك، على الرغم من عدة جهود من قبل العديد من الجماعات، لم تكن الطرق الحالية للثقافة على المدى الطويل من أقراص تخيلي مرضية. لقد وضعت مؤخرا طريقة الثقافة التي يمكن أن تحافظ على التطور الطبيعي للأقراص تخيلي متعددة لمدة تصل إلى 18 ساعة والتي تتيح التصوير الحي 3 </sتصل&gt;. طريقة الثقافة يمكن أن تدعم تمايز الخلايا والهجرة، ولكنها يمكن أن تدعم تكاثر الخلايا لساعة فقط 7-12 ولا يمكن دعم نمو القرص. والفرق الرئيسي في مستنبت هو تركيز عال من الانسولين 3. طريقة بسيطة، وليس هناك حاجة تهوية خاصة أو تداول المتوسط. واحدة من أفضل أقراص تخيلي مدروسة هو القرص العين antennal. هو مبني على العين ذبابة الفاكهة تتكون من حوالي 800 ommatidia. وتتألف كل مقيلة من ثماني خلايا مستقبلة للضوء (R1-R8). في القرص العين اليرقات، وخلايا مستقبلة للضوء نفرق عقب مرور تخلقية الشق (MF)، التي تجتاح عبر القرص العين من الخلفية إلى الأمامية 4 و 5. المستقبلات الضوئية في مقيلة تفرق في التسلسل، بدءا R8، يليه R2 / R5، R3 / R4، R1 / R6، وR7 6. وommatidia في ظهري وهاءنصفين ntral من القرص العين الخضوع لدوران 90 درجة في اتجاهين متعاكسين، مما أدى إلى شرليتي المعاكس 7 و 8. تحدث عملية تناوب على مرحلتين: أولا، يبدأ 45 درجة دوران في واكتمال في الصف السادس ommatidia وراء MF. اكتمال الثاني 45 درجة دوران بنحو التوالي 16 9 و 10. هذه الدراسة تستخدم دوران ommatidial، والتي تمثلت في R3 / 4 محددة 11 mδ0.5-Ga4، للتدليل على التمايز وديناميات الخلوية العادية التي يمكن ملاحظتها من خلال هذا الأسلوب للثقافة ويعيش صورة القرص العين.

<table><tbody><tr><td>Low-melting agarose</td><td>AMRESCO&amp;nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm cover slips&amp;nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Culture chamber&amp;nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 Cell Cultivation System</td></tr><tr><td>40X objective</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fly strain:nls.GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

يوفر التصوير الحي القدرة على تتبع باستمرار العمليات الخلوية والتنموية ديناميكية في الوقت الحقيقي. وقد استخدمت ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي اليرقات لدراسة العديد من العمليات البيولوجية، مثل تكاثر الخلايا، والتمايز، والنمو، والهجرة، وموت الخلايا المبرمج، والمنافسة، مما يشير الى خلية خلية، وتشكيل الحدود المجزئ. ومع ذلك، لم تكن طرق على المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لأقراص تخيلي مرضية، على الرغم من الكثير من الجهود. مؤخرا، قمنا بتطوير طريقة لعلى المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لأقراص تخيلي لمدة تصل إلى 18 ساعة. بالإضافة إلى استخدام تركيز الأنسولين عالية في مستنبت، تم استخدام الاغاروز ذوبان منخفضة أيضا إلى تضمين القرص لمنعها من الانجراف خلال فترة التصوير. يستخدم هذا التقرير أقراص العين antennal كمثال على ذلك. وأعقب مبصرة R3 / 4 محددة التعبير mδ0.5-Ga4 لإثبات أن مبصرة مختلفاtiation والتناوب ommatidial يمكن ملاحظتها خلال 10 ساعة فترة التصوير الحي. هذا هو بروتوكول تفصيلا واصفا هذه الطريقة البسيطة.

<html> في هذا المثال، وصفت خلايا مستقبلة للضوء R3 / R4 مع mδ0.5-Ga4 لمراقبة مبصرة التمايز. mδ0.5-Ga4 يدفع تعبير قوي في R4 والتعبير الأضعف في R3 11، مما يجعلها علامة ممتازة للR3 وR4، فضلا عن عملية التناوب ommatidial. في الفيلم 1، وصفت R3 وR4 مع GFP. في بداية 10 ساعة جلسة الحية التصوير، وكانت هناك 8 صفوف من كتل ommatidial (الشكل 2A وفيلم 1) و 14 صفوف من كتل ommatidial في نهاية (الشكل 2B). وكان معدل التمايز ommatidial 1.67 ساعة لكل صف واحد، وهو ما يقارب نسبة 1.5-2 ح / الصف في الجسم الحي في أقراص 7، 8، 9، 10، 11،الصورة = &quot;XREF&quot;&gt; 12 و 13 و 14. على أساس المواقف النسبية للR3 وR4، حدث دوران ommatidial في القرص مثقف خارج الحي خلال التصوير الحي (الشكل 2A، A &#39;&#39;، B، و B &#39;&#39;). وصفت كتلة R3 / R4 واحدة مع كرة بيضاء في الإطار الأول من فيلم 2. في البداية، محور R3 / R4 يبدو أن عمودي على خط الاستواء (الشكل 2C وفيلم 2). ومن ثم يبدو لتدوير 15 درجة و 30 درجة مئوية، و 45 درجة في 3 (الشكل 2C)، 6 (الشكل 2C &#39;&#39;)، و 9 (الشكل 2C &#39;&#39; &#39;) ساعة، على التوالي. وتشير هذه البيانات إلى أن هذه الطريقة يمكن الحفاظ مبصرة التمايز خلال التصوير الحي 10 ساعة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> فيقوري 1: الرسم التخطيطي للجمعية الغرفة. الرسم التخطيطي للتجمع الغرفة: ( 1 ) وضع طبقة مزدوجة o- حلقة ساترة المرفقة على المرحلة متقبل. ( 2 ) ضع السليكون o الدائري على زلة الغطاء. ( 3 ) ضع القاعدة. ( 4 ) قفل خزانة الختم. ( 5 ) تحميل العينة في وسط حلقة O ووضع الغطاء. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> الشكل 2: التصوير لايف من R3 / R4 التمايز والتناوب. R3 / R4 المسمى مع Mδ0.5-Gal4 معربا عن شكل غفب النووي خلال 10 ساعة من التصوير الحي. تم التقاط جميع الأرقام من الفيلم 1 . ( A ) صورة اتخذت في البداية. ( <strong<html> &gt; A-A &quot;) الصورة الموسع من المنطقة المحاصرة على اليسار ( A &#39; ) والحق ( A&quot; ). ( ب ) الصورة التي اتخذت في نهاية فترة 10 ساعة. ( B&#39;-B &quot; ) الصورة الموسع من المنطقة المحاصرة على اليسار ( B &#39; ) والحق ( B&quot; ). ( سيسي &#39;&#39; &#39; ) ويتبع زوج واحد R3 / R4 (ملحوظ بالسهم في A&#39;) من خلال الوقت لإظهار دوران الزوج R3 / R4. الحانات مقياس = 15 ميكرون، 10 ميكرون، و 5 ميكرون في A، B، و C، على التوالي. جميع الأرقام هي أقصى كثافة Z- التوقعات. يظهر الجدول الزمني في h: مين. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="فيلم 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> فيلم 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi &quot;تارجيت =&quot; _ بلانك &quot;&gt; الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيلم. <img alt="فيلم 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> فيلم 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيلم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc at JoVE.com

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لعلى المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لقرص تخيلي ذبابة الفاكهة. وهو يدل التمايز مبصرة والتناوب ommatidial في غضون فترة 10 ساعة من التصوير المباشر لقرص العين. بروتوكول بسيط ولا يتطلب الإعداد مكلفة.

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K Views.  National Yang-Ming University.  يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لعلى المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لقرص تخيلي ذبابة الفاكهة. وهو يدل التمايز مبصرة والتناوب ommatidial في غضون فترة 10 ساعة من التصوير المباشر لقرص العين. بروتوكول بسيط ولا يتطلب ال...

Video: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biology

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

إعداد وتطوير الكبار ذبابة الفاكهة الأمخاخ والشبكية للتصوير لايف

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

<meta charset="utf8"></head><body>تصوير حي ممتد لذبابة الفاكهة مورفوتكوين الساق العذراء بدون الحفرة

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: الكشف عن الهياكل الظهارية الديناميكية أثناء تطور ذبابة الفاكهة

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

تصوير حي طويل الأمد لتطور الساق ذبابة الفاكهة بعد إزالة الحفرة

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

طويلة الأجل تصوير لايف

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

يعيش التصوير لل

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة

إعداد وتطوير الكبار ذبابة الفاكهة الأمخاخ والشبكية للتصوير لايف

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

تصوير حي طويل الأمد لتطور الساق ذبابة الفاكهة بعد إزالة الحفرة

تصوير حي طويل الأمد لتطور الساق ذبابة الفاكهة بعد إزالة الحفرة

تصوير حي طويل الأمد لتطور الساق ذبابة الفاكهة بعد إزالة الحفرة

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار