ESB يقر تمويل من جائزة مدير المعاهد الوطنية للصحة ومبتكر جديد (DP2 OD002002 - 01) ، NIH التحدي المنح 1RC1MH088182 - 01 ، NIH جراند فرص المنح 1RC2DE020919 - 01 ، NIH 1R01NS067199 - 01 ، جبهة الخلاص الوطني (0835878 و 0848804) ، وجائزة ماكغفرن Neurotechnology معهد برنامج وزارة الدفاع ، NARSAD ، ومؤسسة ألفريد بي سلون ، وجيري مارج بورنيت ، وجائزة بحوث SFN للإبداع في العلوم العصبية ، وسائل الإعلام مختبر معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، ومؤسسة Benesse ، وحاء كولتر والاس مؤسسة.

<ol>
	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

وكانت جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لحيوانات المختبر والتي وافق عليها رعاية الحيوان ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا استخدام وجان السلامة الأحيائية.

في السنوات الأخيرة ، ومكنت عددا من راثيا ترميز المحسسات الضوئية إلى تنشيط الخلايا العصبية وإسكاتها في الجسم الحي بطريقة دقيقة ، زمنيا ، ردا على نبضات قصيرة من الضوء (على سبيل المثال ، 1،4،5،6،7،8 ، 11). وهناك طريقة أساسية مع الخلايا العصبية التي جرت توعية الضوء في المخ لدى الثدييات ، هو عن طريق الفيروسات مثل lentiviruses والغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) ، والتي يمكن تقديم الجينات ترميز opsins لأدمغة الحيوانات تتراوح من الفئران إلى القرود ، في آمنة ودائمة أزياء (على سبيل المثال ، 2،9،10). فيروسات تسمح أسرع فترة زمنية من القيام المعدلة وراثيا ، وخاصة بالنسبة للكائنات الحية التي ليست نموذجية وراثية مثل الفئران والقرود ، وربما تمكن opsins مستويات التعبير العالية التي قد لا يكون ممكنا في سيناريوهات المعدلة وراثيا. هنا نظهر مجموعة حاقن موازية قادرة على خلق ، في فترة زمنية سريعة &quot;على مستوى الدوائر المعدلة وراثيا&quot; ، مما يمكن من الهياكل الدماغ بأكمله 3 الابعاد تستهدف فيروسي مع الجينات ، في خطوة واحدة جراحية. الصفيف تضم حاقن مضخات التشريد واحد أو أكثر من أن كل مجموعة من محرك الحقن ، كل منها تغذي السيليكا تنصهر - بوليميد / الشعرية عبر موصل الضغط العالي للملوحة. الشعيرات الدموية والحجم ، وإدراجه في ذلك الحين ، الأماكن المطلوبة التي حددها العرف الطحن لوحة المواقع المجسم ، وبالتالي السماح ليتم تسليمها الفيروسات أو الكواشف الأخرى لمجموعة المرجوة من مناطق الدماغ. لاستخدام الجهاز ، جراح يملأ أولا الفرعي fluidic تماما مع النفط ، backfills الشعيرات الدموية مع الفيروس ، وإدراج الجهاز في الدماغ ، وينفخ الكواشف ببطء (&lt;0.1 ميكرولتر / دقيقة). وسوف تمكن هذه التكنولوجيا طائفة واسعة من أنواع جديدة من التجارب ، مثل ميلي ثانية واحدة ، مقياس اغلاق التعقيد على شكل هياكل (مثل الحصين) في أوقات محددة أثناء السلوك ، تعطيل مؤقتا - الدقيق للهياكل الثنائية التي قد تعمل redundantly (مثل اللوزة اليمنى واليسرى) ، واضطراب من مناطق الدماغ منفصلة متعددة (على سبيل المثال ، والقيادة منطقتين متصلا من مرحلة دراسة كيفية التزامن عبر المنطقة يعتمد على النشاط داخل كل منطقة ، أو تحفيز المدخلات إلى المنطقة في الوقت الذي إسكات مجموعة فرعية من هذه الأهداف من أجل أن نفهم أي من عدة اهداف حاسمة للوساطة من آثار تلك المدخلات). لأدمغة كبيرة مثل تلك الموجودة في المدن الرئيسية ، والتي أثبتت لنا مؤخرا خلية نوع محدد التنشيط العصبي البصري 3 ، الاقلاق النشاط في منطقة سلوكيا ذات الصلة قد تتطلب وضع العلامات الفيروسية الهياكل الكبيرة والمعقدة. نلاحظ أنه يمكن استخدام موازية صفائف محقن لحقن أي ما يقرب من حمولة -- المخدرات ، neuromodulators ، العصبية ، أو خلايا من ذلك -- في أنماط 3 - D معقدة في الدماغ ، بطريقة دقيقة ، زمنيا. أخيرا ، من وجهة نظر متعدية ، فمن الممكن أن سرعة ، والعلاج الجيني للمرضى أو أجهزة مخصصة لتقديم الأدوية قد تكون سريعة صممت خصيصا لتتناسب وملفقة هندستها الدماغ الفردية ، ودعم علاجات جديدة لمجموعة متنوعة من الأمراض ، ومن المحتمل من خلال استخدام مراقبة الجزيئات الضوئية. وقد صممت هذه المصفوفات حاقن على وجه الدقة ، مكانيا وvolumetrically. في X - Y - والاتجاهات ، ويتم ذلك من خلال حفر ثقوب دقيقة جدا وضعها غير مكلفة باستخدام طاحونة صغيرة ، مع فتحات كبيرة بما يكفي لاحتواء عن طريق الحقن ، وذلك عن طريق الحقن التي تقام بالتوازي مع بعضها البعض ، وفي الدقيقة الموقع. في Z - الاتجاه ، يتم قطع طريق الحقن باستخدام جهاز التجسيمي ، والسماح لمستوى الدقة يعادل ذلك من الجراحة نفسها التجسيمي. دقة الحجمي ينبع من دقة مضخة هاملتون ، وكذلك بالقرب من الصفر ميتا حجم الموصلات ، وتكييفها من اللوني السائل ذات الضغط العالي (HPLC) الحقل. تتم عن طريق الحقن من الأنابيب الشعرية السيليكا تنصهر فيها ، والتي هي قوية وصلبة بما فيه الكفاية أنه يحافظ على الشكل الدقيق والمباعدة بين الولادات تحت الضغط ، دون أن يكون سمك الجدار أكبر من البدائل مثل cannulas الصلب. ويمكن بسهولة أن يتم اجراء تعديلات بسيطة على التكيف مع الصفيف حاقن موازية لمجموعة متنوعة من التجارب. على سبيل المثال ، إذا كان المطلوب أصغر حجم فيروس أو تباعد أكثر دقة ، يمكن استخدام أنابيب أصغر الشعرية ، جنبا إلى جنب مع أصغر قليلا المقابلة الحفر. قد تستخدم في المستقبل أجهزة ميكروفلويديك قنوات ومضخات ، لزيادة عدد الحقن بالتوازي مع ذلك ، للتقليل من حجم (تمكين ربما تكون مثل هذه الأجهزة المركبة على رؤوس الحيوانات ، بحرية التحرك).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

فهمنا من الدارات العصبية -- الطريقة التي توسط في العمليات الحسابية التي أيد الإحساس والفكر والعاطفة ، والعمل ، وكيف أنها معطوبة في الاضطرابات العصبية والنفسية -- وسوف يسهل كثيرا من التكنولوجيا لاستهداف الجينات بسرعة إلى 3 المعقدة -- الدوائر العصبية الأبعاد ، مما خلق السريع لل&quot;المعدلة وراثيا على مستوى الدوائر.&quot; وقد طورنا أساليب مؤخرا في الفيروسات التي ترميز البروتينات الحساسة للضوء يمكن توعية أنواع معينة من الخلايا لتنشيط مقياس ميلي ثانية واحدة ، وإسكات في الدماغ سليمة. نعرض هنا تصميم وتنفيذ مجموعة حاقن القادرة على إيصال الفيروسات (أو سوائل أخرى) لعشرات من نقاط محددة داخل الهيكل 3 الأبعاد للدماغ (<strong&gt; الشكل. 1A ، 1B</strong&gt;). الصفيف تضم حاقن مضخات التشريد واحد أو أكثر من أن كل مجموعة من محرك الحقن ، كل منها تغذي السيليكا تنصهر - بوليميد / الشعرية عبر موصل الضغط العالي للملوحة. الشعيرات الدموية والحجم ، وإدراجه في ذلك الحين ، الأماكن المطلوبة التي حددها العرف الطحن لوحة المواقع المجسم ، وبالتالي السماح ليتم تسليمها الفيروسات أو الكواشف الأخرى لمجموعة المرجوة من مناطق الدماغ. لاستخدام الجهاز ، جراح يملأ أولا الفرعي fluidic تماما مع النفط ، backfills الشعيرات الدموية مع الفيروس ، وإدراج الجهاز في الدماغ ، وينفخ الكواشف ببطء (&lt;0.1 microliters / دقيقة). طبيعة موازية للصفيف حاقن يسهل وضع العلامات السريع ودقيقة وقوية من الدوائر العصبية بأكملها مع الحمولات الفيروسية مثل الحساسية الضوئية لتمكين ضوء التنشيط وإسكات دوائر الدماغ محددة. جنبا إلى جنب مع غيرها من التقنيات ، مثل المصفوفات الألياف البصرية لإيصال الضوء إلى مجموعات المرجوة من مناطق الدماغ ، ونأمل في خلق الأدوات التي تمكن من منهجية التحقيق وظائف السببية العصبية في الدماغ سليمة. قد لا تفتح هذه التكنولوجيا فقط تصل إلى مثل هذه الأساليب المنهجية التي تركز على حلبة علم الأعصاب في الثدييات ، وتسهيل وضع العلامات على مناطق المخ في الحيوانات الكبيرة مثل الرئيسيات غير البشرية ، ولكن أيضا قد فتح طريقا السريرية متعدية لخلية محددة تحكم الاصطناعية البصرية ، قد الدقة التي تمكن من تحسين علاج اضطرابات الدماغ المستعصية. أخيرا ، قد مثل هذه الأجهزة كما هو موضح هنا على وجه التحديد في توقيت غير مناسب تسهيل تسليم fluidic حمولات أخرى مثل الخلايا الجذعية وكلاء الدوائية ، إلى 3 هياكل الأبعاد ، بطريقة بسهولة من قبل المستخدم للتخصيص.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits at JoVE.com

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

مراقبة وتحليل الدوائر العصبية<em&gt; في الجسم الحي</emو&gt; يتيسر من التكنولوجيا لتسليم فيروسات والكواشف الأخرى ليحدد 3 الابعاد المرجوة من مناطق الدماغ. نظهر مجموعة مخصصة حاقن fluidic تصنيع وتسليم فيروسي ترميز المحسسات الضوئية ، مما يمكن التلاعب البصرية للدوائر الدماغ المعقدة.

تحجيم Fluidic صالحة للحقن الفيروسية استهداف سليمة دوائر الدماغ 3 - D

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Views.  Massachusetts Institute of Technology. مراقبة وتحليل الدوائر العصبية في الجسم الحي يتيسر من التكنولوجيا لتسليم فيروسات والكواشف الأخرى ليحدد 3 الابعاد المرجوة من مناطق الدماغ. نظهر مجموعة مخصصة حاقن fluidic تصنيع وتسليم فيروسي ترميز المحسسات الضوئية ، مما يمكن التلاعب البصرية للدوائر الدماغ ?...

Video: Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

استهداف المنشآت الدماغ العميق مع Microinjections لتسليم المخدرات وناقلات فيروسية ، أو زرع الخلايا

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

توصيف نسيجية سليمة من الأجهزة بالغة الصغر زرع الدماغ والأنسجة المحيطة بها

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

تسجيل الكهربية في الدماغ سليمة من اسماك الزرد الكبار

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

التصوير 3-D وتحليل الخلايا العصبية المصابة<em&gt; في فيفو</em&gt; مع<em&gt; التوكسوبلازما</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

تعديل لColliculo-مهادية قشرية ماوس الدماغ شريحة، دمج الطباعة 3-D من مكونات الغرفة ومتعدد المقاييس التصوير الضوئي

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not represent the underlying cytoarchitectural and functional complexity of the affected individuals carrying suspected disease variants. Conventional 2-D models remain incomplete representations of in vivo-like structures and do not adequately capture the complexity of the brain. Thus, there is an emerging need for more 3-D hiPSC-based models that can better recapitulate the cellular interactions and functions seen in an in vivo system.
Here we report a protocol to develop a 3-D system from undifferentiated hiPSCs based on the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model mirrors aspects of a developing ventralized neocortex and allows for studies into functions integral to living neural cells and intact tissue such as migration, connectivity, communication, and maturation. Specifically, we demonstrate that the SFEBs using our protocol can be interrogated using physiologically relevant and high-content cell based assays such as calcium imaging, and multi-electrode array (MEA) recordings without cryosectioning. In the case of MEA recordings, we demonstrate that SFEBs increase both spike activity and network-level bursting activity during long-term culturing. This SFEB protocol provides a robust and scalable system for the study of developing network formation in a 3-D model that captures aspects of early cortical development.

Here we report a protocol to develop a three-dimensional (3-D) system from human induced-pluripotent stem cells (hiPSCs) called the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model can be used like an organotypic slice culture to model human cortical development and for the physiological interrogation of developing neural circuits.

تطوير هبسك المصل المشتقة الهيئات إمبريويد الحرة لاستجواب الثقافات الخلايا الجذعية 3-D باستخدام الفحوصات ذات الصلة فسيولوجيا

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

توليد الجيل من 3D الكولاجين القائم على Hydrogels لتحليل النمو المحوري والسلوك أثناء تطوير الجهاز العصبي

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

القياس الضوئي متعدد ألياف لتسجيل النشاط العصبي في الكائنات المتحركة بحريه

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...