ESB reconoce financiación Premio a la Innovación Nuevo Director del NIH (DP2 OD002002-01), NIH subvención-desafío 1RC1MH088182-01, NIH Gran oportunidades de becas 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, la NSF (0835878 y 0848804), el McGovern Instituto el Programa de Premios Neurotechnology , el Departamento de Defensa, NARSAD, la Fundación Alfred P. Sloan, Jerry y Marge Burnett, el Premio de Investigación SFN para la Innovación en Neurociencia, el Media Lab del MIT, la Fundación Benesse, y la Fundación Wallace H. Coulter.

1. La construcción de Clamp estereotáxica <ol><li> La pinza estereotáxica se usa para sujetar el conjunto inyector a la stereotax, de modo que los inyectores estén paralelos al brazo estereotáxica. </li><li> Cada laboratorio sólo necesita una pinza, a menos que se prevé que más de una cirugía puede llevarse a cabo de forma simultánea. En este caso, hacer el mismo número que el número máximo previsto de cirugías simultáneas. También puede ser recomendable hacer un extra, en caso de daños a la primera. </li><li> Para hacer la pinza estereotáxica, en primer lugar, un diámetro de 1,5 mm exterior (OD) cánula de acero se reduce a 2 pulgadas de largo, y uno de los extremos hacia abajo hasta que se Dremeled plana. </li><li> A continuación, una pequeña porción (aproximadamente 0,5 x 0,5 cm) se corta de PCB proto-board, para ser utilizado como separador. </li><li> Usando un cortador láser para asegurar que los recortes hechos son perpendiculares a la superficie del material, dos rectángulos iguales (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) se cortan de 1 / 8 &quot;láminas de acrílico, cada rectángulo que tiene dos agujeros circulares en esquinas opuestas del rectángulo. El primer agujero tiene un diámetro de 1,5 mm, y es lo suficientemente grande como para mantener la cánula de metal bien. El segundo agujero tiene un diámetro de 1 / 16 &quot;(fig. 1C). </li><li> La cánula de metal se inserta en el orificio de 1,5 mm de un rectángulo, y luego a través del agujero de 1,5 mm de la segunda. El extremo inferior de la cánula está alineado con la cara inferior del rectángulo inferior, adoptando la forma de un palo de hockey. </li><li> Manteniendo el separador firmemente sostiene, entre los dos rectángulos, esta estructura es unirse entre sí por el uso de pegamento caliente alrededor de los agujeros y cánula de 1,5 mm, teniendo cuidado de evitar pegar el separador de los rectángulos. Plastilina puede ser útil para mantener las cosas en este proceso. </li><li> Después de que el pegamento se haya secado, un tornillo de 1-72 se inserta en el orificio de 1 / 16 de la parte superior de los rectángulos. A continuación, una tuerca hexagonal 1-72 se enrosca en el extremo del tornillo de 1-72, y se aprieta. El tornillo y la tuerca que sujetan la abrazadera. </li><li> Para colocar la tuerca de la cara inferior del rectángulo de fondo, una pequeña cantidad de epoxi de 5 minutos se dejan caer por el borde de la tuerca hexagonal, sin permitir que el epoxi para entrar en los hilos de la tuerca hexagonal o tornillo. Cualquier arcilla se extrae, y se confirma que el separador puede ser sostenido firmemente en su lugar apretando el tornillo. </li></ol> 2. Preparación del sistema para la medida amplia de inyección: Hamilton bomba y stereotax <ol><li> El sistema de matriz de inyección pueden ser personalizados para casi cualquier conjunto de coordenadas en el cerebro. </li><li> El primer usuario localiza las coordenadas de los puntos de inyección deseada en un ratón (o de otras especies) atlas del cerebro, convirtiendo a las coordenadas utilizadas en los stereotax (en este caso, X, Y, y Z-coordenadas). El número de sitios de inyección (tres en las figuras 1A y 1B) en adelante se llamará k. </li><li> número k de 10 l jeringas Hamilton se colocan en una bomba de jeringa de inyección / retiro como este aparato de la Universidad de Harvard. </li><li> A continuación, tres metros de largo, pedazos de tubo de polietileno están firmemente adherido a la aguja de cada jeringa Hamilton. </li><li> Por cada pieza de tubo de polietileno, un F-252 tubos de manga Upchurch Científico se desliza sobre el extremo abierto y conectado a un adaptador de tubo P-627 con la tuerca y el casquillo incluye, además de Upchurch Científico. </li></ol> 3. La construcción de la matriz a medida inyector <ol><li> Cada matriz de inyección se adapta al conjunto de coordenadas que el usuario elija. Sin embargo, para conjuntos de coordenadas que sólo difieren en la traducción y / o rotación, la misma variedad de inyección se pueden utilizar. </li><li> Considerando sólo el X relativa y las coordenadas Y de los sitios de inyección, los agujeros k se perforan en un PCB proto-board de espesor 1 / 32 &quot;, con la misma distancia relativa. Estos agujeros son perforados con un molino de Modela mini y un .011&quot; de diámetro de broca de McMaster-Carr. Asegúrese de utilizar un ritmo lento de la perforación (Z-velocidad) para evitar la rotura o desgaste de la broca. Antes de retirar la placa de la planta, un rectángulo es perforado alrededor de los agujeros pequeños, con una broca de mayor diámetro de 1 / 32 &quot;, para evitar el uso de la más pequeña del Código para la fábrica de Mini se puede generar fácilmente utilizando MATLAB;. Muestras código se proporciona en los siguientes archivos. <ol class="lroman"><li> generate.m - código de MATLAB para generar código Modela de coordenadas deseadas </li><li> holes_ex.rml - Modela el código de patrón de timbre de perforación (ocho agujeros) en el proto-board </li><li> outline_ex.rml - Modela el código de rectángulo alrededor de los agujeros de perforación </li></ol></li><li> 245 m OD/100 micras de diámetro interior (ID) tubo capilar de sílice fundida, disponible en las tecnologías de Polymicro, se corta en número k de 3 pedazos de una pulgada. Estos comprenden los inyectores individuales. Una pieza desechable de tubos capilares se asomó a través decada uno de los agujeros, para limpiar los residuos sin obstruir los inyectores real. Los inyectores se inserta a mitad de camino en cada agujero, de modo que se mantienen firmes y paralelas entre sí. Los inyectores son epóxico a la junta, que forman la estructura de la matriz del inyector. Todo lo que queda es ajustar los inyectores a la longitud correcta. </li><li> La matriz de inyección se une a la pinza estereotáxica mediante la colocación de una esquina de la proto-board entre los rectángulos de acrílico, y luego apretando el tornillo de la abrazadera estereotáxica. A continuación, la cánula metálica de la abrazadera se une a la stereotax, utilizando el mecanismo de fijación de la stereotax. </li><li> Todos los siguientes se realiza bajo un microscopio. Para uno de los inyectores exterior (es decir, que puede ser abordado desde el lado con un borde recto, sin chocar con alguno de los inyectores de otro tipo), la punta se extiende más allá de la parte inferior de la proto-board se corta con unas tijeras. Para las inyecciones cortical, es apropiado para que el inyector se extiende aproximadamente 5 mm más allá de la superficie de la proto-board. Para más inyecciones, este número puede ser aumentado por el incremento correspondiente en profundidad. La punta es aplanada con una herramienta Dremel. Consejos inyector también puede ser suelo en un ángulo como medida de precaución adicional contra la obstrucción, si la precisión en la profundidad es menos importante. </li><li> A continuación, un punto de referencia estable que se elija dentro del alcance del brazo estereotáxica, y el conjunto inyector se mueve de manera que la punta plana del exterior del inyector, es en este punto de referencia. </li><li> Un segundo inyector es elegido, junto con sus correspondientes coordenadas. En cuenta es la diferencia relativa de la altura (z) entre las coordenadas inyector primero y segundo. La matriz de inyección se mueve a lo largo del eje Z en esta distancia relativa. El inyector segundos se corta y Dremeled a la longitud correcta, de modo que la punta del inyector segundo plano y ahora es a la altura del punto de referencia. La matriz de inyección se pueden mover en las direcciones X e Y para facilitar la comparación de la punta del inyector con el punto de referencia. </li><li> Este proceso de recorte se repite para el resto de los inyectores. </li></ol> 4. Montaje de todo el sistema <ol><li> La pinza estereotáxica y personalizado conjunto inyector, ambos ya construidos, se requieren para esta parte. </li><li> La parte de atrás de cada inyector (el extremo que no ha sido recortada) se inserta en un azul F-240 y la tubería de manga, con un P-235 tuerca y P-200 casquillos de Upchurch Científico, es conectado al adaptador de rosca ya está conectado a la bomba de Hamilton por la tubería de polietileno. Las instrucciones del fabricante se pueden consultar para más detalles. </li><li> Usando una aguja de calibre 27, aceite de silicona se inyecta en la parte posterior de las jeringas de Hamilton para que el sistema entero está lleno de la jeringa Hamilton a la punta del inyector, sin burbujas de aire en absoluto. </li><li> Como las jeringas Hamilton se vuelven a colocar en la bomba de Hamilton, el mayor volumen posible de aceite de silicona se mantiene en las jeringas. </li><li> Si el experimento requiere más jeringas que la bomba está diseñada para (dos en este caso), las jeringas se pueden colocar pequeños trozos de plástico (por ejemplo, tapas de aguja) para mantenerlos paralelos entre sí, y para asegurarse de que todas las piezas son impulsado por la bomba en la misma medida. O bien, un conjunto de bastidor multi-upgrade se pueden comprar en Harvard Apparatus para almacenar hasta 10 jeringas a la vez. </li></ol> 5. Inyecciones / cirugía <ol><li> El proceso de inyección con inyector de un paralelo es muy similar a la de la inyección con una pipeta única. </li><li> Es esencial el uso de recarga lenta / infundir las tasas a lo largo de este proceso, ya que rápidamente el bombeo podría poner presión sobre la articulación entre la tubería de grandes y pequeños. Peso máximo recomendado de la tasa: 2 l / min para la carga de virus, y 0,1 l / min para infundir virus. </li><li> Un ratón anestesiado se coloca en el stereotax, y permanece anestesiado durante todo el experimento. </li><li> Prepare el ratón, según sea necesario. Por ejemplo, con un bisturí, un solo corte se realiza por la línea media de la piel, de entre los ojos entre las orejas. La piel se estira hacia atrás para exponer el cráneo, y la fascia se limpia. Una pipeta de vidrio tirado se une a la stereotax. Las posiciones de las barras de la oreja se ajustan hasta bregma y lambda están alineados a la misma altura, y para que la línea que conecta ellos es paralelo al eje de la stereotax. Los ejes de la stereotax se orientan de acuerdo con el sistema de coordenadas en el que las coordenadas de la inyección se han calculado. El estereotáxica se pone a cero con la punta de la pipeta de vidrio en el bregma, y ​​luego la punta se coloca ligeramente por encima del cráneo, en la X e Y las coordenadas de uno de los sitios de inyección. </li><li> Usando un taladro dental, el cráneo debajo de la punta es cuidadosamente comparación de distancia hasta que queda una capa muy delgada de hueso. La pipeta de vidrio puede ser menored y se crió para comprobar que el agujero se perfora se centra en la posición correcta. Usando una aguja de calibre 30, un pequeño trozo de la capa es suave interceptado, en el X-y corregir las coordenadas, de modo que la duramadre se expone. Este agujero debe ser lo suficientemente grande como para ajustarse a uno de los inyectores (0,25 mm de ancho). Ver Figura 1 D para el diagrama. De esta manera, los pequeños agujeros, ancho de 0,25 mm se hacen en el cráneo, en la X e Y las coordenadas correspondientes a cada sitio de la inyección. </li><li> La pipeta de vidrio se desecha en un contenedor de objetos punzantes, y la medida amplia de inyección se une a la stereotax con la abrazadera estereotáxica. </li><li> Con el fin de ajustar correctamente el ángulo de la matriz de inyección, inyectores dos exteriores son elegidos para ser calibrados a un punto de referencia determinado, de la siguiente manera. Después de uno de los inyectores se corresponde con el punto de referencia, tenga en cuenta la relación X e Y las distancias entre los puntos de inyección en relación con este inyector y el otro. Los ejes de la stereotax se ajustan de manera que todo el conjunto inyector se mueve en la X e Y las direcciones de estas distancias relativas. Si el inyector segundo no está alineado con el punto de referencia, la cánula de metal se afloja y se gira. Este proceso se repite iterativamente hasta que la matriz de inyección tiene un ángulo correcto. </li><li> Antes de llenar los inyectores con el virus, los inyectores están llenos de aceite de silicona hasta que las jeringas se encuentran en el punto 2 l (o superior). Esto proporciona una zona de amortiguamiento, por lo que las burbujas de aire o la obstrucción en la punta se puede quitar fácilmente empujando hacia adelante con aceite de la bomba de Hamilton, sin tener que volver a llenar el sistema con aceite de silicona de la parte posterior de las jeringas, como se describe anteriormente. </li><li> Un trozo de Parafilm estéril se coloca en el cráneo, y los inyectores son ligeramente baja en el Parafilm. Para las coordenadas con profundidades muy variables, una costumbre elaborado: una parte (por ejemplo, un objeto con forma de escalera) pueden facilitar la carga. </li><li> Las partes siguientes se supone que uno de l virus se va a cargar en cada lugar (las siguientes cantidades deben reducirse si se desean cantidades más pequeñas). Con el fin de garantizar que&gt; 1 l de virus se inyecta en cada sitio, de 1,5 l de virus es pipeta en el Parafilm o escalera en la punta de cada inyector. </li><li> Con la tasa de recambio de la bomba de Hamilton pone a 1 l / min, 1,2 l de que el virus se vuelve a llenar en cada inyector. </li><li> La punta de los más largos del inyector se pone a cero en el bregma, a continuación, la matriz de inyección se desplaza a la X e Y las coordenadas de ese inyector. Si la obstrucción es un problema, dicen que si muchos objetivos profundos están involucrados: incluso antes de insertar las puntas de inyección en el cerebro, a veces es aconsejable comenzar la infusión de la bomba, hasta que el virus se puede ver que salen de todos los consejos del inyector. Esto elimina las burbujas de aire en la punta del inyector, y también asegura que no se atasque. En el caso de la obstrucción, la bomba de Hamilton se encuentra a infundir un breve pulso a una velocidad mayor de 2 l / min, para limpiar suavemente la obstrucción. </li><li> La matriz de inyección se hace descender, a través de los pequeños orificios hechos con las agujas de calibre 30, a la correcta Z-profundidad. </li><li> 1 l de virus es inyectado a través de cada inyector, a 0,1 l / min. </li><li> Las inyecciones se quedan solos durante 30 minutos. </li><li> Después de la matriz inyector extrae lentamente desde el cerebro, la bomba de Hamilton está en infundir a la misma tasa de 0,1 l / min, con el fin de comprobar si la obstrucción en cada inyector. </li><li> A continuación, los inyectores se limpian por la reposición y la infusión de 1,5 l de etanol a 2 l / min. </li><li> Finalmente, los inyectores se rellenan con aceite de silicona para mantener la zona de amortiguación 2 l de cada jeringa Hamilton. </li><li> Todo el equipo debe ser esterilizado antes y después del procedimiento, de acuerdo con la bioseguridad de su institución y los protocolos de uso animal. </li></ol> 6. Resultados representante El paralelo conjunto inyector acelera una cirugía más o menos por un factor igual a la cantidad de inyectores, sin contar la instalación y el tiempo de recuperación, aunque los tiempos individuales dependerá de la habilidad del médico. Para una inyección de 1 microlitro, por lo general ver la expresión de lentivirus en una esfera de aproximadamente 1 mm de diámetro (Fig. 1E). La precisión de la inyección era tal que la variabilidad en el posicionamiento de la punta, a partir de los ensayos, fue de aproximadamente 45 micras (desviación estándar de la distancia desde la posición de la punta a la posición de punta de la intención). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diseño, implementación y uso de un virus en paralelo serie inyector. Un esquema, del sistema de matriz paralela inyector, mostrando una triple configuración de los inyectores, por tres inyecciones simultáneas. B, la fotografía de una matriz de tres paralelos de inyección como en el diagrama de un . <stRong&gt; C, abrazadera estereotáxica, que se muestra en líneas generales desde la parte superior D, la ilustración de la técnica para una eficiente, minimizando el daño-, la apertura de agujeros en el cráneo para inyector de inserción en el cerebro:. con un taladro dental, delgada del cráneo hasta espesor de ~ 50 micrones, a continuación, utilizar la punta de una aguja para abrir una pequeña craneotomía. E, que muestra imágenes de fluorescencia canalrodopsina-2 (ChR2)-GFP-etiquetados células en tres regiones corticales del ratón, como se había previsto por la triple serie de inyección se muestra en la B.

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	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la Guía del NIH para animales de laboratorio y aprobado por el Cuidado de Animales del MIT y el empleo y los Comités de Seguridad de la Biotecnología.

En los últimos años, una serie de organismos genéticamente codificados sensibilizadores óptica han permitido a las neuronas que se activan y silenciados en vivo de una manera temporal, precisa, en respuesta a breves pulsos de luz (por ejemplo, 1,4,5,6,7,8 , 11). Un método clave con la que las neuronas se han sensibilizado a la luz en el cerebro de los mamíferos, es a través de virus como lentivirus y virus adeno-asociados (AAV), que pueden entregar los genes que codifican para opsinas a los cerebros de los animales que van desde los ratones a los monos, en un forma segura y duradera (por ejemplo, 2,9,10). Los virus más rápido tiempo de respuesta permite que los transgénicos, especialmente para los organismos que no son organismos genética modelo como las ratas y monos, y por opsinas pueden permitir altos niveles de expresión que no puede ser posible en los escenarios de transgénicos. Aquí se demuestra una serie paralela de inyección capaz de crear, en un plazo de tiempo rápido &quot;, circuito a nivel de los transgénicos&quot;, que permite todo en 3 dimensiones las estructuras del cerebro que se forma viral dirigida a un gen, en un paso quirúrgico. La matriz de inyección comprende una o más bombas de desplazamiento que cada unidad de un conjunto de jeringas, cada uno de los que se alimenta en una de sílice fundida de poliamida / capilar a través de un conector de alta presión de alta disponibilidad. Los capilares son de tamaño, y después se inserta en, lugares deseados especificados por la costumbre, el fresado de una placa de posicionamiento estereotáctica, permitiendo así que los virus u otros reactivos que se entregarán al conjunto deseado de las regiones del cerebro. Para utilizar el dispositivo, el primer cirujano llena el subsistema de fluidos en su totalidad con petróleo, rellenos de los capilares con el virus, se inserta el dispositivo en el cerebro, e infunde reactivos lentamente (&lt;0,1 l / min). Esta tecnología permitirá que una amplia variedad de nuevos tipos de experimentos, como la escala de tiempo de milisegundos cierre de forma compleja en forma de estructuras (tales como el hipocampo) en momentos precisos en el comportamiento, la inactivación temporal, precisa de estructuras bilaterales que pueden actuar de forma redundante (como la izquierda y la amígdala derecha), y la perturbación de múltiples regiones cerebrales discretas (por ejemplo, conducir dos regiones conectados fuera de fase para estudiar cómo cruzada región sincronía depende de la actividad dentro de cada región, o estimular las entradas a una región, mientras que el silenciamiento de un subconjunto de los objetivos a fin de comprender cuál de los varios objetivos son fundamentales para la mediación de los efectos de los insumos). Para los grandes cerebros como los de los primates, en el que hemos demostrado recientemente óptico tipo de célula específica de activación neural 3, perturbando la actividad en un área de comportamiento relevantes pueden requerir el etiquetado viral de las estructuras grandes y complejas. Tomamos nota de que en paralelo matrices de inyección puede ser utilizado para inyectar casi cualquier carga - drogas, neuromoduladores, los neurotransmisores, o incluso células - en el complejo de 3-D los patrones en el cerebro, de manera temporal, precisa. Por último, desde el punto de vista de traslación, es posible que el rápido, el paciente a medida terapia génica o dispositivos de administración de fármacos puede ser rápidamente diseñados y fabricados para que coincida con geometrías individuales del cerebro, el apoyo a nuevos tratamientos para una variedad de patologías, posiblemente mediante el uso de moléculas de control óptico. Las matrices de inyección están diseñados para ser más precisos, tanto espacial como volumétrica. En la X e Y las direcciones, esto se logra mediante la perforación de los agujeros con gran precisión puesto con un mini-molino de bajo costo, con los agujeros lo suficientemente grande como para ajustarse a los inyectores, de modo que los inyectores se mantienen paralelos entre sí, y de manera precisa ubicación. En la dirección Z, los inyectores se cortan con un aparato estereotáxico, lo que permite un nivel de precisión equivalente a la de la cirugía estereotáxica en sí. La precisión volumétrica surge de la precisión de la bomba de Hamilton, así como la casi nula volúmenes muertos conectores, una adaptación de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) sobre el terreno. Los inyectores son obtenidos de un tubo capilar de sílice fundida, que es fuerte y lo suficientemente rígido que mantiene la forma precisa y el espacio bajo presión, sin que el espesor de la pared más grande de alternativas tales como cánulas de acero. Pequeñas modificaciones se pueden hacer fácilmente para adaptar el conjunto inyector paralelo a una variedad de experimentos. Por ejemplo, si un menor volumen de virus o espaciamiento más fino se requiere, más pequeño tubo capilar puede ser empleado, junto con una broca correspondiente más pequeño. Dispositivos en el futuro podrán utilizar canales de microfluidos y bombas, para aumentar el número de inyectores en paralelo, para reducir al mínimo el tamaño (tal vez permita a estos dispositivos para ser montado en la cabeza de libertad de movimiento de los animales).

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

Nuestra comprensión de los circuitos neuronales - cómo mediar en los cálculos que la sensación subserve, pensamiento, emoción y acción, y la forma en que están dañados en enfermedades neurológicas y psiquiátricas - se vería enormemente facilitada por una tecnología para la rápida selección de genes complejo 3 - dimensiones circuitos neuronales, lo que permite la rápida creación de &quot;nivel de circuito transgénicos.&quot; Recientemente hemos desarrollado métodos de codificación en el que los virus sensibles a la luz de las proteínas pueden sensibilizar a los tipos específicos de células a escala de tiempo de milisegundos de activación y silenciamiento en el cerebro intacto. Presentamos aquí el diseño e implementación de una matriz de inyección capaz de entregar los virus (y otros líquidos) a docenas de puntos definidos dentro de la estructura 3-dimensional del cerebro (<strong&gt; Figura. 1A, 1B</strong&gt;). La matriz de inyección comprende una o más bombas de desplazamiento que cada unidad de un conjunto de jeringas, cada uno de los que se alimenta en una de sílice fundida de poliamida / capilar a través de un conector de alta presión de alta disponibilidad. Los capilares son de tamaño, y después se inserta en, lugares deseados especificados por la costumbre, el fresado de una placa de posicionamiento estereotáctica, permitiendo así que los virus u otros reactivos que se entregarán al conjunto deseado de las regiones del cerebro. Para utilizar el dispositivo, el primer cirujano llena el subsistema de fluidos en su totalidad con petróleo, rellenos de los capilares con el virus, se inserta el dispositivo en el cerebro, e infunde reactivos lentamente (&lt;0,1 microlitros / min). La naturaleza paralela de la matriz de inyección facilita el etiquetado rápido, preciso, robusto y de toda circuitos neuronales con capacidades de carga viral tal como sensibilizadores óptica para permitir que la luz de activación y el silenciamiento de los circuitos cerebrales definidos. Junto con otras tecnologías, como las matrices de fibra óptica para la entrega de la luz a los conjuntos deseados de las regiones del cerebro, que esperamos crear una caja de herramientas que permite a la sistemática exploración de causal funciones neuronales en el cerebro intacto. Esta tecnología no sólo puede abrir tales métodos sistemáticos para circuito centrado en la neurociencia en los mamíferos, y de facilitar el etiquetado de las regiones del cerebro en los animales grandes, como los primates no humanos, pero también puede abrir un camino de traslación clínica de células específicas de prótesis de control óptico , cuya precisión puede permitir un mejor tratamiento de los trastornos cerebrales intratables. Finalmente, los dispositivos como se describe aquí puede facilitar precisamente el momento oportuno suministro de fluidos de otras cargas, como las células madre y los agentes farmacológicos, a tres dimensiones de estructuras, de manera fácilmente personalizable por el usuario.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Control y análisis de circuitos neuronales<em&gt; In vivo</em&gt; Se vería facilitada por una tecnología para la entrega de los virus y otros reactivos que desee en 3 dimensiones conjuntos de las regiones del cerebro. Demostramos a medida de fluidos de fabricación de serie del inyector, y la entrega de forma viral codificada sensibilizadores óptica, que permite la manipulación óptica de los circuitos cerebrales complejas.

Escalable neumático matrices inyector para Viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-D

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K vistas.  Massachusetts Institute of Technology. Control y análisis de circuitos neuronales In vivo Se vería facilitada por una tecnología para la entrega de los virus y otros reactivos que desee en 3 dimensiones conjuntos de las regiones del cerebro. Demostramos a medida de fluidos de fabricación de serie del inyector, y la entrega de forma viral codificada sensibilizadores óptica, que permite la manipulación óptica de los circuitos cerebrales complejas.