ESB는 NIH 원장의 새로운 이노 수상 (OD002002 - 01 DP2), NIH 도전 그랜트 1RC1MH088182 - 01, NIH 그랜드 기회 부여 1RC2DE020919 - 01, NIH 1R01NS067199 - 01, NSF (0835878 및 0848804), 맥거번 연구소 Neurotechnology 보너스 프로그램에 의해 자금 인정 , 국방, NARSAD, 알프레드 P. 슬로안 재단, 제리와 마지 버넷, 신경 과학, MIT 미디어랩, Benesse 재단과 월러스 H. 쿨터 재단의 혁신을위한 SFN 연구 수상의학과.

1. Stereotaxic 클램프를 건설 <ol><li> stereotaxic 클램프는 인젝터가 stereotaxic 팔이 평행 있도록 stereotax에 인젝터 배열을 연결하는 데 사용됩니다. </li><li> 그것이 하나 이상의 수술이 동시에 자리를 차지할 수있는 예상되지 않는 각각의 연구실에서 단 하나의 클램프 필요합니다. 이 경우, 동시 수술의 예상 최대 번호와 같은 번호를 확인합니다. 또한 처음에 손상의 경우, 추가를하는 것이 좋습니다 수도 있습니다. </li><li> stereotaxic 클램프하려면, 첫째로, 1.5 mm 외경 (OD) 강철 정맥은 길이 2 인치 절단되고 끝을 중 하나가 평면 때까지 Dremeled입니다. </li><li> 다음, 작은 조각 (약 0.5 X 0.5 cm)는 스페이서로 사용, PCB 킬로그램 보드 밖으로 절단합니다. </li><li> 의 모든 상처가 재료의 표면에 직각되는 것을 보장하기 위해 레이저 커터를 사용하여 두 개의 동일한 직사각형 (1 / 2 &quot;X 8분의 3&quot;는) 1 / 8 &quot;아크릴 판금, 두 원형 구멍을 가지고 각각의 사각형에서 버렸어요 사각형의 반대 구석. 첫 번째 구멍은 1.5mm 직경을 가지고 있으며, 단지 단단히 금속 정맥을 가질 정도로 큽니다. 두 번째 구멍은 직경 16분의 1 &quot;(그림 1C)을하고 있습니다. </li><li> 금속 정맥은 두 번째의 1.5 mm 구멍을 통해 다음 하나의 사각형의 1.5 mm의 구멍에 삽입됩니다. 정맥의 아래 끝은 하키 스틱의 모양을 형성 하단 사각형의 하단 표정으로 정렬됩니다. </li><li> 단단히 두 사각형 사이에 개최되는 공백을 유지하면서,이 구조는 gluing에게 사각형에 공백을 피하기 위해주의되는, 정맥 및 1.5mm 구멍 주위에 뜨거운 접착제를 사용하여 함께 초경 있습니다. 모델링 점토는이 과정에서 함께 물건을 개최 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 접착제가 마른 후 1-72 나사는 직사각형의 맨 측면에서 16분의 1 구멍에 삽입됩니다. 그런 다음 1-72 헥스 너트가 1-72 나사의 끝 부분에 실수를하고, 강화입니다. 나사와 너트가 함께 클램프를 잡아 제공하고 있습니다. </li><li> 아래쪽 사각형, 5 분 에폭시 소량의 하단 얼굴 헥스 너트를 연결이 에폭시는 헥스 너트 또는 나사의 스레드에 들어갈 수없이 진수 너트의 가장자리 주위에 제외됩니다. 모든 모델링 흙이 제거되고 그것은 공백이 나사를 강화하여 굳게 장소에서 개최되는 수 있음을 확인합니다. </li></ol> 2. 해밀턴 펌프 및 stereotax : 맞춤 인젝터 배열에 대한 시스템을 준비 <ol><li> 연료 분사 장치 배열 시스템은 두뇌에 좌표 거의 모든 설정을 사용자 정의할 수 있습니다. </li><li> 사용자 첫째 찾습니다은 stereotax에서 사용하는 적절한 좌표로 변환, 마우스 (또는 다른 종) 뇌 아틀라스에서 원하는 사출 사이트의 좌표 (여기서, X -, Y - 및 Z - 좌표). 사출 사이트의 번호 (인물 1A 및 1B 세) 이하 K라는 것입니다. </li><li> 10 μl 해밀턴 주사기 K 번호는 같은 하버드 장치에서 하나로서 주입 / 탈퇴 주사기 펌프에 배치됩니다. </li><li> 폴리에틸렌 튜빙의 다음 3 피트 길이의 조각은 안전하게 각 해밀턴 주사기 바늘에 첨부됩니다. </li><li> 폴리에틸렌 튜브, 업처치 과학에서 F - 252 튜브 슬리브의 각 조각을위한 오픈 엔드 이상 하락하고 있으며 포함된 너트를 사용하여 P - 627 튜브 어댑터에 연결된 또한 업처치 과학에서 물미. </li></ol> 3. 사용자 정의 주입기 배열을 구축 <ol><li> 각 인젝터의 배열은 사용자가 선택되는 좌표의 집합으로 정의됩니다. 단, 번역 및 / 또는 회전에 따라 다릅니다 좌표의 집합에 대해 같은 인젝터 배열을 사용할 수 있습니다. </li><li> 오직 상대 X 및 사출 사이트의 Y 좌표를 고려 K 구멍 &quot;이 같은 상대적인 간격으로.이 구멍이 Modela 미니 공장과 0.011를 사용하여 몰락는&quot;두께 32분의 1의 PCB 킬로그램 보드로 뚫고 아르 맥마스터 - 카에서 드릴 비트 직경. 속보 또는 드릴 비트를 착용하지 않도록 책임의 느린 속도 (Z - 스피드)를 사용해야합니다. 방앗간에서 보드를 제거하기 전에, 사각형은 작은 하나를 입고 피하기 위해, 직경 32분의 1 &quot;의 큰 드릴 비트를 사용하여 작은 구멍 주위 몰락하는 미니 밀에 대한 코드가 쉽게 MATLAB을 사용하여 생성할 수 있습니다;. 샘플 코드는 다음과 같은 파일에 제공됩니다. <ol class="lroman"><li> generate.m - MATLAB 코드를 원하는 좌표에서 Modela 코드를 생성 </li><li> holes_ex.rml - 킬로그램 - 보드에 드릴링 링 패턴 (8 홀)에 대한 Modela 코드 </li><li> outline_ex.rml - 구멍 주위에 드릴링 사각형에 대한 Modela 코드 </li></ol></li><li> 245 μm의는 OD/100 μm의 내경 (ID) 융합 실리카 모세관 튜브, Polymicro 기술에서 사용할 수는 3 인치 조각 K 오브 번호로 절단됩니다. 이들은 각각의 인젝터를 구성. 모세관 튜브의 일회용 조각을 통해 찌르고있다구멍의 각, 실제 인젝터를 괴롭히는없이 파편을 치워 수 있습니다. 인젝터는 다음 각 구멍에 중간 삽입, 그들이 서로 밀접하게 병렬 개최하고 있습니다 있도록. 인젝터는 연료 분사 장치를 배열의 구조를 형성, 이사회에 epoxied 있습니다. 유지 모든 올바른 길이로 인젝터를 장식하는 것입니다. </li><li> 연료 분사 장치를 배열은 stereotaxic 클램프의 나사를 강화하여 다음 아크릴 사각형 사이의 킬로그램 - 보드 중 하나가 모서리를 배치하여 stereotaxic 클램프에 연결하고 있습니다. 다음, 클램프의 금속 정맥은 stereotax의 부착 메커니즘을 사용하여 stereotax에 첨부되어 있습니다. </li><li> 다음 중 모든 현미경으로 이루어집니다. 외부 인젝터 (즉, 다른 인젝터의 부딪히는없이 스트레이트 에지와 함께 측면에서 접근할 수있는 하나) 중 하나, 킬로그램 보드의 하단 넘어 연장 끝 가위로 절단됩니다. 피질 주사 들어, 인젝터는 킬로그램 기판의 표면을 넘어 약 5mm 연장하도록 적합합니다. 깊은 주사의 경우이 번호는 깊이 해당 증가에 의해 증가 수 있습니다. 팁는 Dremel 도구 평평합니다. 심도 정밀 덜 중요한 경우 인젝터 팁 또한, 막히는에 대한 추가 예방 조치로 각도로 지상 수 있습니다. </li><li> 다음 안정된 기준점이 stereotaxic 팔 범위 내에서 선택하고, 연료 분사 장치를 배열은 외부 주입기의 평평 끝에,이 참조 지점에되도록 이동합니다. </li><li> 두 번째 주입기가 해당 좌표와 함께 선택됩니다. 첫 번째와 두 번째 인젝터 좌표 사이의 높이에 상대적인 차이가 (Z - 방향)입니다 간주됩니다. 인젝터 배열이 상대 거리에 의한 Z의 축을 따라 이동됩니다. 두 번째 주입기는 두 번째 주입기의 끝은 기준점의 높이에서 이제 평평하고 있도록 손질하고 올바른 길이로 Dremeled입니다. 연료 분사 장치를 배열은 참조 지점으로 분사기 팁의 비교를 용이하게하는 X와 Y 방향으로 이동할 수 있습니다. </li><li> 트리밍의이 과정은 나머지 인젝터에 대해 반복됩니다. </li></ol> 4. 전체 시스템을 조립 <ol><li> stereotaxic 클램프 및 맞춤 인젝터 배열은 모두 이미 만들어진,이 부분이 필요합니다. </li><li> 각 인젝터의 백 엔드는 (손질되지 않은 끝), P - 235 너트와 업처치 과학에서 P - 200 물미를 사용하여 F - 240 튜브 슬리브 파란색으로 삽입 이미 연결된 스레드 어댑터에 연결되어 폴리에틸렌 튜브에 의해 해밀턴 펌프합니다. 제조 업체의 지침에 대한 자세한 내용은 상담을하실 수 있습니다. </li><li> 27 게이지 바늘을 사용하여 실리콘 오일은 전혀 공기 방울과 함께 전체 시스템 인젝터 팁에 해밀턴 주사기에서 가득 있도록 해밀턴 주사기의 뒷면에 주입합니다. </li><li> 해밀턴 주사기가 해밀​​턴 펌프에 다시 배치됩니다로서, 실리콘 오일의 가장 큰 가능한 볼륨이 주사기에 유지됩니다. </li><li> 실험은 펌프가 (이 경우 두)을 위해 설계보다 더 주사기가 필요한 경우, 주사기는 한 다른 그들이 평행 유지하고, 모든 조각이되는 것을 보장하기 위해 플라스틱 작은 조각 (예 : 바늘 모자)과 간격 수 동일한 범위에 펌프에 의해 밀려. 또는 다중 랙 업그레 이드 키트는 한 10 주사기까지 개최 하버드 장치에서 구입하실 수 있습니다. </li></ol> 5. 주사 / 수술 <ol><li> 병렬 주입기로 주입의 과정은 하나의 피펫과 주입의 매우 유사합니다. </li><li> 빠른 펌핑은 크고 작은 튜브 사이의 공동에 대한 스트레스를 넣어 있기 때문에 그것은 천천히 리필을 사용하여 /이 과정에서 속도를 달이다하는 것이 필수적입니다. 추천 최대 속도 : 2 μl / 바이러스를로드하는 분, 그리고 0.1 μl / 바이러스를 일으키는위한 분. </li><li> anesthetized 마우스는 stereotax에 배치하고, 실험을 통해 anesthetized 남아있다. </li><li> 필요에 따라 마우스를 준비합니다. 예를 들어, 메스와 싱글 컷이 눈 사이에서 귀 사이에, 피부의 정중선을 만들 수 있습니다. 피부는 두개골을 노출 다시 뽑아이며, 근막이 닦아 있습니다. 가져온 유리 피펫은 stereotax에 첨부되어 있습니다. bregma 및 람다가 같은 높이로 정렬하고, 그래서 그들을 연결하는 라인이 stereotax의 Y 축 평행 것을 때까지 귀 바의 위치가 조정됩니다. stereotax의 축의는 사출 좌표 계산되었습니다있는 좌표계에 따라 지향하고 있습니다. stereotaxic는 bregma에 유리 피펫의 끝에와 제로는 다음 팁을는 X 및 사출 사이트 중 하나의 Y - 좌표에서 약간 두개골 위에 위치합니다. </li><li> 뼈의 매우 얇은 층이 남아 때까지 치과 드릴을 사용하여, 팁 아래의 두개골은 신중하게 멀리 앞에 서있다. 유리 피펫 낮은 수몰락하는 구멍이 올바른 위치에 중심 있는지 확인하기 위해 제기 에드합니다. 30 게이지 바늘을 사용하여 레이어의 작은 조각이 부드럽게 올바른 X -와 Y - 좌표에서, 개털되도록 두라 메이터가 노출되는. 이 구멍은 인젝터 (0.25mm 폭) 중 하나에 맞게 충분 커야합니다. 다이어그램 그림 1D를 참조하십시오. 이 방법에서는 작은 0.25mm 넓은 구멍에서 두개골에 만든 X - 각 주사 사이트에 해당하는 Y는 - 좌표. </li><li> 유리 피펫은 샵스 컨테이너에서 삭제되고 맞춤화된 인젝터 배열은 stereotaxic 클램프를 사용하여 stereotax에 첨부되어 있습니다. </li><li> 제대로 주입기 배열의 각도를 설정하려면 두 외부 인젝터는 다음과 같이 주어진 참조 지점으로 조정하는 선택입니다. 인젝터 중 하나가 참조 지점과 일치하면, 상대 X -이 인젝터에 상대적인 사출 사이트간에 Y - 거리와 다른 하나를 고려하십시오. 전체 주입기 배열이 이러한 상대적인 거리에 의해 X -와 Y - 방향으로 이동되도록 stereotax의 축이 조정됩니다. 두 번째 주입기 이제 기준점에 부합하지 않으면, 금속 정맥은 느슨하게하고 회전합니다. 인젝터 배열이 올바르게 직각 때까지이 과정은 반복 반복됩니다. </li><li> 주사기가 2 μl 점 (이상)에까지 바이러스와 인젝터를 작성하기 전에, 인젝터는 실리콘 오일로 가득합니다. 이것은 제보에 막히는 모든 공기 방울 또는 쉽게로 이전 묘사, 주사기의 뒷면에서 실리콘 오일과 리필로 전체 시스템을하지 않고, 해밀턴 펌프를 사용하여 앞으로 기름을 추진하여 제거할 수 있도록, 버퍼 영역을 제공합니다. </li><li> Parafilm의 살균 조각은 두개골에 위치하며, 인젝터는 부드럽게 Parafilm에 가만히있어. 크게 다양한 깊이, 맞춤 가공된 부분 (예 : 계단 모양의 객체)로 좌표 로딩 용이하게 수 있습니다. </li><li> 다음 부품은 바이러스 1 μl이 (작은 수량이 원하는 경우에는 다음과 같은 수량이 크기를 줄일 수 함) 각 사이트에서 로드할 수 있다고 가정합니다. 바이러스&gt; 1 μl를 각 사이트에서 주입 것을 보장하기 위하여, 바이러스의 1.5 μl은 각 인젝터의 끝에 Parafilm이나 계단에 pipetted입니다. </li><li> 해밀턴 펌프의 리필 속도 1 μl / 분 설정으로 바이러스 1.2 μl은 각 인젝터로 리필됩니다. </li><li> 가장 긴 주입기의 끝은 bregma에서 제로이며, 다음 인젝터 배열은 그 주입기의 X 및 Y - 좌표 이동합니다. 막히는가 문제가있다면 많은 깊은 대상이 참여하는 경우, 말씀 :도 두뇌에 인젝터 팁 삽입하기 전에, 그것은 바이러스가 모든 인젝터 팁에서 신흥 볼 수 때까지 펌프 일으키는를 시작하는 때로는 권합니다. 이것은 인젝터 팁든지 공기 방울을 제거하고, 또한 더 괴롭히는가 없다는 것을 보장합니다. 막히는의 경우, 해밀턴 펌프는 부드럽게 막히는 아웃을 취소, 2 μl / 분 더 높은 속도로 짧은 펄스를 달이다으로 설정됩니다. </li><li> 연료 분사 장치를 배열은 다음 올바른 Z - 깊이, 30 게이지 바늘로 만든 작은 구멍을 통해 저하됩니다. </li><li> 바이러스 1 μl은 0.1 μl / 분, 각 인젝터를 통해 주입합니다. </li><li> 주사는 30 분 동안 혼자 남아 있습니다. </li><li> 연료 분사 장치를 배열 천천히 두뇌에서 추출되면 해밀턴 펌프는 각 인젝터에 막히는 것을 확인하기 위해, 0.1 μl / 분 같은 속도로 불어 넣다로 설정됩니다. </li><li> 다음 인젝터 2 μl / 분 에탄올 1.5 μl를 충진하고 일으키는 청소됩니다. </li><li> 마지막으로, 인젝터는 각 해밀턴 주사기에 2 μl 버퍼 영역을 유지하기 위해 실리콘 오일 리필 있습니다. </li><li> 모든 장비는 기관의 biosafety과 동물 사용 프로토콜에 따라, 절차 전후에 소독해야합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 개인 시간이 개업의 기술에 따라 달라집니다 있지만 병렬 인젝터의 배열은, 설치 및 복구 시간을 카운트 아니라, 인젝터의 숫자와 같은 요인에 의해 거의 수술을 속도. 1 microliter 주입을 위해, 우리는 일반적으로 직경 약 1mm (그림 1E)의 영역에 lentivirus 표현을 보았다. 분사의 정밀도 팁 위치의 다양성이 재판에서 재판에 대해 45 미크론 (끝 위치에서 의도 팁 위치로 거리의 표준 편차)가 그러한되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 트리플 병렬 인젝터 배열의 사진은 세 동시 주사 들어, 트리플 인젝터의 구성을 보여주는 병렬 인젝터 배열 시스템, 개략도. B, 디자인, 구현 및 병렬 바이러스 인젝터 배열을 사용하지 않습니다. diagrammed . <st롱&gt; C, 위에서 개요에 표시된 stereotaxic 클램프, D, 손상 - 최소화, 두뇌에 주입기 삽입을 위해 두개골에 구멍의 효율적인 개방을위한 기술의 그림 :. 치과 드릴, 얇은 다운 두개골 ~ 50 미크론의 두께로 다음 사용 channelrhodopsin - 2 (ChR2)를 보여주는 작은 craniotomy을 열 날카로운 바늘의 팁. E, 형광 이미지 GFP - 레이블로 트리플 인젝터 배열의 대상이 셋 마우스 대뇌 피질의 지역에서 세포가 B.에 표시

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	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

모든 절차는 실험 동물에 대한 NIH 가이드에 따라되었으며 MIT 동물 관리 및 사용 Biosafety위원회의 승인을.

(예 : 1,4,5,6,7,8 빛을 짧은 펄스에 대한 응답으로, temporally - 정밀한 방식으로 최근에는 유전자 인코딩 광학 sensitizers의 숫자가 활성화되는 뉴런을 활성화하고 생체내의 침묵 , 11). 뉴런은 포유류의 두뇌에 빛을 sensitized있다있는 주요 방법은,에서 마우스에서 원숭이에 이르기까지 동물의 두뇌에 opsins에 대한 인코딩 유전자를 제공할 수있는 등 lentiviruses 및 adeno - 관련 바이러스 (AAV)와 같은 바이러스를 통해이다 안전하고 지속 패션 (예 : 2,9,10). 바이러스는 특히 쥐가 원숭이와 같은 유전자 모델 생물되지 않은 생물, 트렌스 제닉보다 빠른 처리 시간을 허용하고, opsins에 대한 유전자 변형 시나리오에서 가능하지 않을 수 있습니다 높은 표현 수준을 사용 수 있습니다. 여기서 우리는 하나의 수술 단계에서 전체 3 차원 뇌 구조가 virally 유전자를 타겟팅할 수 있도록 신속한 timescale에 만들 수있는 병렬 인젝터 배열, &quot;회로 수준 트렌스 제닉을&quot;보여줍니다. 연료 분사 장치를 배열은 polyimide / 융합 - 실리카에 피드를 각 각 드라이브 주사기 세트는 높은 압력 관용 커넥터를 통해 모세관 하나 이상의 변위 펌프로 구성됩니다. 모세 혈관은 크기이며, 다음 stereotactic 위치 보드를 지정 밀링에 의해 지정된 원하는 위치에 삽입, 따라서 바이러스 또는 다른 시약이 뇌 영역의 원하는 집합에 전달 될 수 있도록. 장치를 사용하려면, 외과 먼저 기름을 완전히 유체 서브 시스템을 가득 채우고 바이러스와 모세 혈관을 backfills, 삽입 두뇌에 장치 및 (&lt;0.1 ​​μL / 분) 천천히 시약을 infuses. 이 기술 (예 : 같은 행동을하는 동안 정확한 시간에 complexly 모양의 구조의 밀리초 - timescale 종료 (예 : 해마 등), redundantly 행위 수 있습니다 양자 구조의 temporally - 정밀 불활 성화와 같은 실험을 새로운 종류의 다양한 활성화됩니다 왼쪽과 오른쪽 편도) 및 위상 밖으로있는 두 지역을 운전 여러 개별 뇌 영역 (예,의 섭동 교차 지역 synchrony 각 지역 내의 활동에 따라 달라집니다 방법을 연구, 또는 일부를 입을 동안 지역으로 입력을 자극하는 ) 몇 가지 목표 중 어느 이러한 입력의 효과를 중재에 대한 중요 이해하기 위해서는 대상으로하고 있습니다. 영장류에서이 같은 큰 두뇌 들어있는 우리는 최근 광학 셀 타입의 특정 신경 활성화 3 behaviorally - 관련 분야에서 활동을 perturbing 것은 크고 복잡한 구조의 바이러스 라벨이 필요할 수 있습니다를 증명하고있다. 마약, neuromodulators, 신경 전달 물질, 심지어 세포 - - 두뇌의 복잡한 3 - D 패턴에 temporally - 정밀한 방식으로 우리는 병렬 인젝터 배열이 거의 모든 페이로드를 삽입하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, translational 관점에서 그것은 빠르게, 환자 맞춤형 유전자 치료 또는 약물 전달 장치가 빠르게 될 수도 있습니다 사용자 정의 - 설계 및 잠재적으로의 사용을 통해 pathologies 다양한위한 새로운 치료법을 지원, 각각의 뇌 형상에 맞게 가공 광학 제어 분자. 연료 분사 장치를 배열 양쪽 공간과 volumetrically, 정확하게 설계되었습니다. 에서 X 및 Y - 지시,이 인젝터는 서로 평행하게 개최되도록 인젝터를 맞게 충분 큰 구멍이있는, 저렴한 미니 밀을 사용하여 매우 정확하게 배치 구멍을 시추에 의해 성취, 그리고 정확한에 위치입니다. Z - 방향에서 인젝터는 stereotaxic 수술 자체의에 상응하는 정밀도 수준을 허용, stereotaxic 장치를 사용하여 손질하고 있습니다. 용적 정밀도 해밀턴 펌프의 정밀도뿐만 아니라 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC) 필드에서 적응 거의 제로 죽은 볼륨 커넥터에서 발생한다. 인젝터는 등 철강 cannulas과 같은 대안의 큰 벽 두께없이 강하고 그것이 압력을 받고 정확한 모양과 간격을 유지 충분한 강성이다 융합된 실리카 모세관 튜브에서 만들어집니다. 작은 수정을 쉽게 실험의 다양한 병렬 인젝터 배열을 적응 할 수 있습니다. 바이러 스나 미세한 간격의 작은 볼륨이 필요한 경우 예를 들어, 작은 모세관 튜브는 해당 작은 드릴 비트와 함께, 고용 수 있습니다. 미래의 장치는 (아마도 같은 장치가 자유롭게 이동하는 동물의 머리에 장착할 수 있도록)의 크기를 최소화하기 위해, 병렬 인젝터의 수를 증가, microfluidic 채널과 펌프를 활용 수 있습니다.

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		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

신경 회로에 대한 우리의 이해 - 크게 빠른 속도로 복잡한 3 유전자를 타겟팅하는 기술을 이용하여 용이 될 - 그들이 보조하다 감각, 생각, 감정, 그리고 행동, 어떻게 그들이 신경 및 정신 장애에 손상이있는 계산을 중재하는 방법 - 의 빠른 생성 활성화 차원 신경 회로, &quot;회로 수준 트렌스 제닉을.&quot; 우리는 최근에 빛에 민감한 단백질에 대한 바이러스 인코딩 밀리초 - timescale 활성화 특정 세포 유형을 감광성을하고 그대로 머리에 입을 수있는 방법을 개발했습니다. 우리는 여기에서 뇌의 3 차원 구조 내에서 정의된 포인트 수십하는 바이러스를 (또는 다른 유체) 제공 가능한 인젝터 배열의 설계 및 구현을 제시 (<strong&gt; 그림. 1A, 1B</strong&gt;). 연료 분사 장치를 배열은 polyimide / 융합 - 실리카에 피드를 각 각 드라이브 주사기 세트는 높은 압력 관용 커넥터를 통해 모세관 하나 이상의 변위 펌프로 구성됩니다. 모세 혈관은 크기이며, 다음 stereotactic 위치 보드를 지정 밀링에 의해 지정된 원하는 위치에 삽입, 따라서 바이러스 또는 다른 시약이 뇌 영역의 원하는 집합에 전달 될 수 있도록. 장치를 사용하려면, 외과 먼저 기름을 완전히 유체 서브 시스템을 가득 채우고 바이러스와 모세 혈관을 backfills, 삽입 두뇌에 장치 및 (&lt;0.1 ​​microliters / 분) 천천히 시약을 infuses. 연료 분사 장치를 배열의 병렬 특성은 가벼운 활성화 및 정의 뇌 회로의 입을를 활성화하기 위해 광학 sensitizers 같은 바이러스성 payloads과 전체 신경 회로의 신속 정확하고 안정적​​인 라벨을 용이하게합니다. 같은 뇌 영역의 원하는 세트 조명 납품을위한 광섬유 어레이와 같은 다른 기술과 함께, 우리는 그대로 머리에 인과 신경 기능의 탐색 체계를 수있는 도구 상자를 만들 수 있도록 최선을 다하겠습니다. 이 기술은 포유류의 회로에 초점을 맞춘 신경 과학 이러한 체계적인 접근을 열고 같은 비 인간 영장류와 같은 큰 동물의 뇌 영역의 라벨 촉진뿐만 아니라 셀 - 특정 광 제어 prosthetics에 대한 임상 translational 경로를 열 수 없습니다 있습니다 누구의 정밀도는 어려운 뇌 질환의 개선 치료를 가능하게 수 있습니다. 마지막으로, 여기에서 설명한 같은 장치가 원활히 수 있습니다 정확하게 - 초과 쉽게 사용자 정의 방식으로 3 차원 구조 이러한 줄기 세포 및 약리 대리인 등 다른 payloads의 유체 전달,.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

신경 회로를 제어 및 분석<em&gt; 생체내에</em&gt; 뇌 영역의 원하는 3 차원 세트에 바이러스 및 기타 시약의 전달 기술에 의해 촉진됩니다. 우리는 복잡한 뇌 회로의 광학 조작을 지원, 사용자 정의 유체 인젝터 배열 제조 및 virally 인코딩된 광 sensitizers의 배달을 보여줍니다.

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K 조회수.  Massachusetts Institute of Technology. 신경 회로를 제어 및 분석 생체내에 뇌 영역의 원하는 3 차원 세트에 바이러스 및 기타 시약의 전달 기술에 의해 촉진됩니다. 우리는 복잡한 뇌 회로의 광학 조작을 지원, 사용자 정의 유체 인젝터 배열 제조 및 virally 인코딩된 광 sensitizers의 배달을 보여줍니다.

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Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

연구

신경과학

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

뇌 이식 Microdevices과 주변 조직의 손상 조직 학적 특성

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 톡소 포자충</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not represent the underlying cytoarchitectural and functional complexity of the affected individuals carrying suspected disease variants. Conventional 2-D models remain incomplete representations of in vivo-like structures and do not adequately capture the complexity of the brain. Thus, there is an emerging need for more 3-D hiPSC-based models that can better recapitulate the cellular interactions and functions seen in an in vivo system.
Here we report a protocol to develop a 3-D system from undifferentiated hiPSCs based on the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model mirrors aspects of a developing ventralized neocortex and allows for studies into functions integral to living neural cells and intact tissue such as migration, connectivity, communication, and maturation. Specifically, we demonstrate that the SFEBs using our protocol can be interrogated using physiologically relevant and high-content cell based assays such as calcium imaging, and multi-electrode array (MEA) recordings without cryosectioning. In the case of MEA recordings, we demonstrate that SFEBs increase both spike activity and network-level bursting activity during long-term culturing. This SFEB protocol provides a robust and scalable system for the study of developing network formation in a 3-D model that captures aspects of early cortical development.

Here we report a protocol to develop a three-dimensional (3-D) system from human induced-pluripotent stem cells (hiPSCs) called the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model can be used like an organotypic slice culture to model human cortical development and for the physiological interrogation of developing neural circuits.

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

자유롭게 움직이는 동물의 신경 활동을 기록하는 다중 섬유 광도 측정법

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...