نعترف دعم البحوث من قبل برنامج بحوث جماعية من NIBIB ، المعاهد الوطنية للصحة.

عينة الجمعية خلية وعزم الدوران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ البناء عينة الخلايا من خلال وضع إطار التجمعات معا 2. وضع طوقا نافذة على حامل الإطار. موقف بطانة الإطار (أو يسمى في بعض الأحيان وسادة النافذة) حامل داخل الإطار بحيث افتتاح بطانة هو العكس keyway حاملها. بزاوية طفيفة ، وضع الإطار في التوفيق بين صاحب العلامة الكاتب نافذة على الطريق الرئيسي مع صاحب النافذة. اضغط لأسفل برفق على حواف جدا على جانبي الإطار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم سليم لضمان دقة وعزم الدوران من الخلية عينة ، ونحن معطفا خفيفا طوقا الإسكان والحلبة مع زيوت التشحيم Spinkote المسمار. انتشار كمية صغيرة جدا من Spinkote بين الإبهام والسبابة. معطف المواضيع خاتم المسمار مع الفيلم ، رقيقة غير مرئية من Spinkote. وبالمثل ، معطف طوقا الإسكان. تمحو أي مواد التشحيم مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ التجمع عينة الخلية عن طريق تحريك إطار تجميع واحد ، مع إطار مواجهة تجاهك ، في السكن الخلية عن طريق مواءمة keyway مع مفتاح السكن. محاذاة محور keyway مع مفتاح السكن والسماح لها سقوط برفق على الجزء العلوي من إطار التجمع داخل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أبدا استخدام أي نوع من أداة لدفع محور الإسكان في الخلية. هذا يمكن أن يسبب ضررا دائما لCP مما أدى إلى تسرب خلال التجارب. بدوره الجمعية النافذة الثانية بحيث تكون النافذة التي تواجه نحو محور ، بعيدا عنك ، محاذاة keyway مع مفتاح السكن والانزلاق إلى أسفل على أعلى من محور. مكان السكن طوقا على أعلى ، ثم حلقة المسمار حتى كلمة &quot;مخرج&quot; مرئيا. باستخدام أصابعك وأداة المحاذاة ، ومن جهة إحكام الطوق المسمار. إذا كان الحزب الشيوعي لا تنزلق بسهولة داخل برميل الإسكان ، وتوفيق لأول مرة ، بعد ذلك ، وضع التجمع النافذة الثانية على أعلى من ذلك. من خلال تطبيق الضغط النزولي لطيف على التجميع النافذة ، سواء في شريحة الإسكان الخلية في نفس الوقت. وبهذه الطريقة نتمكن من تجنب الضغط مباشرة على البرنامج القطري. الآن هو الوقت المناسب للنظر داخل الخلية لينت والغبار وبصمات الأصابع. ستلاحظ أيضا خواتم نيوتن التي تشير إلى أنه لا يزال الهواء بين الحزب الشيوعي والنوافذ. وسوف تختفي هذه بعد تطبيق عزم الدوران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع عصابة المسمار وكلمة &quot;الخروج&quot; مرئيا ، ضع عينة الخلية على طول الطريق داخل الخلية كوليه عزم الدوران من الوقوف عزم الدوران. عقد في مكان الخلية عن طريق الضغط المستمر على التعامل مع عزم دوران الوقوف. في اقتراح واحد متواصل ، وتشديد الطوق المسمار الى ما بين 120-140 في رطلا. إذا باستخدام ميكرومتر تعديل عزم الدوران وجع ، تعيينها إلى ما بين 120-140 في / رطل وإحكام الطوق المسمار حتى تم التوصل إلى وجع &quot;النقرات&quot; مما يدل على عزم المجموعة. الافراج عن التعامل مع عزم الدوران والوقوف بعناية إزالة الخلية عينة دون لمس النوافذ. </li></ol> وختم تحميل خلية نموذج <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجارب سرعة الترسيب ، ونحن بشكل روتيني تحميل حجم 400ul في كل قطاع من محور 12mm باستخدام ماصة 200ul. موقف خلية العينة مع ثقوب التحميل على رأس وكلمة &quot;الخروج&quot; على الحلقة المسمار مرئية. الشريحة النصف غيض ماصة صولا إلى القطاع محور اليسار من خلال الثقوب التحميل والاستغناء ببطء 200ul حل المرجع. أكرر مرة واحدة لمجموع 400ul. استخدام غيض ماصة نفسه ونفس الأسلوب ، بعناية وببطء ملء القطاع محور الحق مع 400ul حل العينة. وتستخدم كميات 150-180 UL للتجارب توازن الترسيب ولكن ينبغي أن يتبع نفس الرعاية والتقنية. لا بد من تطابق حجم العينة المرجعية وحلول بقدر الإمكان. تركيب طرف ماصة بشدة كي تستقر على ماصة ، تحميل ببطء والاستغناء عن حلول ، وتجنب فقاعات التحميل واستخدام غيض ماصة نفسها لكلا حلول كل المساعدات في الحفاظ على وحدات التخزين على قدم المساواة قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الخلية عن طريق وضع المكونات 2 جديدة الإسكان الحمراء جوانات بشكل مريح في كل فتحة التحميل والتأكد من أنها متوضعة بين قطعة سكنية ومركز الألمنيوم. تغطية كل المكونات مع السكن. ومن ناحية تشديد مع رئيس مفك شقة صغيرة. </li></ol> عينة محاذاة الخلية في الدوار <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحميل الدوار ، تأكد من موازنة لا تتجاوز 0،5 ز أخف من خلية العينة في الموقف المعاكس في حالة الخلية التي تتسرب العينة. تبدأ مع توازن عند مستوى الصفر. وزن العينة الاولى الخلية التي ستكون في موقف معاكس لCB. الفارغة على التوازن الذي طرح الوزن خلية العينة ، ثم وزن CB. إضافة أو طرح الوزن من ثقب تعلق موازنة. تأكد من أوزان لا تبرز من الأعلى. Reweigh للتأكد من أن الوزن موازنة النهائي في غضون 0.5 ز أخف من خلية العينة المعاكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الدوار 4 - مكان ، ضع في موازنة المركز 4 بحيث السهم الأبيض مرئيا ومشيرا في رانه اتجاه القوة النابذة. تأكد من أنه على طول الطريق داخل الدوار. ربط مجموعة المسمار بلطف ، وجدت على قمة موازنة فقط عبر من السهم الأبيض ، حتى يتم موازنة ثابتة في مكانها ، ولكنها لا تزال قادرة على أن تكون محاذاة. موقف الخلية عينة متوازنة مع المقابس التي تواجه الإسكان وسط الدوار وكلمة &quot;الخروج&quot; على الحلقة المسمار مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبحث من تحت الدوار ، محاذاة علامة الكاتب الداخل (علامة الأقرب إلى وسط الدوار) مع علامة الكاتب على موازنة باستخدام أداة المحاذاة. تشديد المسمار تأمين موازنة لتعيين الانحياز في المكان. في نفس الطريق ، ومحاذاة الخلية الكاتب علامة مع عينة داخل علامة على موقف الكاتب 2 على الدوار. </li></ol> لمزيد من المعلومات راجع <a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a>

<ol>
	<li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation.">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li><li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation.">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li><li>. Home - Workshops [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a></li></ol>

الجمعية الخلية السليمة ، أو الإدراج العينة ، والمحاذاة خلية في الدوار هو أمر حاسم لجودة عالية التجارب الجامعة الأمريكية بالقاهرة. هذا صحيح ، وعلى وجه الخصوص ، للتجارب التي تتطلب تحليلا مفصلا للغاية من البيانات المطلوبة على ملامح ترسيب الجزيئات ، على سبيل المثال ، عند دراسة التفاعلات البروتين وتحديد المبالغ الإجمالية التتبع. في كثير من الأحيان على جودة الإعداد التجريبية يحد عن دقة ودقة النتائج من دراسة بالجامعة الأمريكية. للاطلاع على تفاصيل عملية تصميم وتنفيذ المزيد من التجارب الجامعة الأمريكية بالقاهرة ، انظر المراجع 1 -- 3. ويجري حاليا عقد حلقات عمل تغطي عملية الإعداد ، من الناحية النظرية ، وتحليل البيانات من التجارب AUC مرتين في السنة في مختبرنا في المعاهد الوطنية للصحة [4].

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4-place Ti analytical rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361964</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torque stand assembly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361318</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell alignment tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinkote Lubricant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Counterbalance</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>360219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Housing kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>334602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window liner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362329</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, sapphire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>307177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, quartz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>301730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>305037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12mm double sector Epon centerpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell plug gaskets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell housing plug	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362327</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell

نابذة فائقة السرعة وتحليلية (AUC) هو أداة قوية تسمح لنا البيوفيزيائية لتسجيل ملامح ترسيب الجزيئات أثناء الطرد المركزي بسرعة عالية. عند تخطيط سليم وتنفيذ ، يمكن لسرعة الترسيب AUC أو الترسيب تجربة التوازن تكشف الكثير عن بروتين في ما يخص حجم وشكل ونقاء العينة ، ومعامل الترسيب ، والتفاعلات الدول oligomerization البروتين البروتين. هذا الأسلوب ، ومع ذلك ، يتطلب مستوى دقيق من الاهتمام التقني. عينة الخلايا عقد مركز قطعة تقع بين مجالس قطاعية نافذة اثنين. ومختومة أنها ذات ضغط عزم دوران حول 120-140 في / رطل. يتم تحميل المخزن المرجعية والعينة في القطاعات محور ثم بعد الختم ، تتماشى تماما الخلايا في الدوار التيتانيوم بحيث أنظمة الكشف البصري على حد سواء عينة المسح والعازلة الإشارة في خط الوسط من خلال نفس المسار شعاعي محور كل قطاع في حين تناوب بسرعة تصل إلى 60 دورة في الدقيقة 000 ، وتحت فراغ عالية جدا ليس فقط هو الصحيح التجميع خلية العينة الحرجة ، ومكونات الخلية عينة غالية جدا ويجب العناية بشكل صحيح لضمان أن تكون في حالة صالحة للعمل في المثلى لتجنب تسرب والكسر خلال التجارب. التعامل مع النوافذ بعناية ، حتى لأدنى الكراك أو خدش يمكن أن يؤدي إلى كسر في جهاز الطرد المركزي. يجب أن يكون محور الاتصال بين والنوافذ تكون ضيقة قدر الإمكان ، أي لا ينبغي حلقات نيوتن ق تكون مرئية بعد تطبيق ضغط عزم الدوران. يمكن الغبار ، والوبر ، وخدوش والزيوت على النوافذ أو محور كل حل وسط وهذا الاتصال بسهولة بالغة تؤدي الى تسرب من الحلول من قطاع إلى آخر أو تسرب للخروج من محور جميعا. لا يتم فقدان العينات الثمينة ، وتسرب من الحلول خلال التجربة سوف تسبب خللا في الضغط في الخلية التي غالبا ما يؤدي إلى تحطيم النوافذ والقطع المركزية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن الجوانات المكونات والمقابس بالسكن ينبغي أن تكون في مكان آمن لتجنب الحلول التي انسحبت من القطاع من خلال الثقوب محور التحميل من فراغ عالية في غرفة الطرد المركزي. يجب أن المتشددين النافذة وحشيات تكون خالية من التشققات وفواصل التي يمكن أن تسبب الحركة مما أدى إلى تحطيم النوافذ. هذا الفيديو سوف تظهر إجراءاتنا التجمع خلية العينة ، وعزم الدوران والتحميل والمحاذاة الدوار للمساعدة في تقليل ضرر عنصر ، حل تسريب والكسر أثناء التجربة AUC الكمال.

Watch this Scientific Journal Video about Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell at JoVE.com

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

نابذة فائقة السرعة وتحليلية (AUC) خلية العينة يحمل عينة والعازلة المرجعية وخلال التجارب ، ويتعرضون للفراغ وسرعات عالية تصل إلى الدوار 60000 دورة في الدقيقة. وهذا الفيديو يظهر انتباه دقيق إلى التفاصيل اللازمة لتحميل والتجمع ومواءمة هذا العنصر مهم جدا من تجربة الجامعة الأمريكية بالقاهرة.

التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

assembly-loading-alignment-an-analytical-ultracentrifuge-sample

Research

JoVE Journal

Biology

22.5K Views.  Dynamics of Macromolecular Assembly, Laboratory of Bioengineering and Physical Science. نابذة فائقة السرعة وتحليلية (AUC) خلية العينة يحمل عينة والعازلة المرجعية وخلال التجارب ، ويتعرضون للفراغ وسرعات عالية تصل إلى الدوار 60000 دورة في الدقيقة. وهذا الفيديو يظهر انتباه دقيق إلى التفاصيل اللازمة لتحميل والتجمع ومواءمة هذا العنصر مهم جدا من تجربة الجام?...

Video: Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

تشريح المنظم وExplants القطب الحيواني من أجنة القيطم المورق وجمعية خلية الفحص الالتصاق

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

في المختبر عن طريق الجمعية النووية مجزأ مقتطفات البيض القيطم

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

التجمع ، وضبط واستخدام المجهر حقل قرب Apertureless الأشعة تحت الحمراء للتصوير البروتين

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

جيل من البلازميد ناقلات معربا عن بروتينات الموسومة FLAG تحت تنظيم الاستطالة الإنسان عامل-1α المروج عن طريق الجمعية جيبسون

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

تحميل عينة المبردة في زاوية سحرية الغزل مطياف الرنين المغناطيسي النووي الذي يحافظ على الجدوى الخلوية

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...