يستخدم هذا البروتوكول لنظام التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا المؤتلف ، المعروف باسم نظام PURE ، زراعة الخلايا وتنقية الخلايا لتبسيط تنقية البروتين المطلوبة. وهذا يقلل بشكل كبير من متطلبات الوقت والعمل. وقد أثبتت طريقة OnePot أنها ليست فعالة من حيث التكلفة فحسب ، بل فعالة أيضا من حيث الوقت.
فإنه يقلل من أوقات التحضير من عدة أسابيع إلى ثلاثة أيام عمل. وهذا يجعل منصة PURE الخالية من الخلايا في متناول المزيد من المختبرات في جميع أنحاء العالم ويساعد على تنفيذ هذه المنصة القوية حقا لعلم الأحياء الخالي من الخلايا الاصطناعية. قبل البدء، تأكد من أن جميع السلالات عبر عن البروتين كل منها بشكل جيد.
للبدء، قم بإعداد العمود لتنقية بروتين OnePot كما هو موضح في المخطوطة النصية باستخدام ملليلترين من راتنج سيفاروز، ثم قم بشحن العمود بكبريتات النيكل. إعداد الثقافات بداية من خلال الجمع بين 20 ملليلتر من وسائل الإعلام LB مع 20 ميكرولتر من أمبيسلين. إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام في 35 بئرا من العقيمة 96 لوحة بئر عميقة.
تلقيح كل واحد منهم مع سلالة كل منها، باستثناء عامل الاستطالة الحرارية غير مستقرة، أو EFTU، وختم لوحة مع غشاء تنفس. لثقافة EFTU، تلقيح ثلاثة ملليلترات من أمبيسلين تحتوي على وسائط LB في أنبوب ثقافة 14 ملليلتر مع غطاء المفاجئة. حوالي ثلاثة ملليلترات من ثقافة EFTU كافية لثقافة تعبير OnePot واحدة.
احتضانه في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 260 التناوب في الدقيقة الواحدة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، نقل 500 ملليلتر من وسائل الإعلام LB و 500 ميكرولتر من الأمبيسلين في قارورة حائرة معقمة. تلقيح ثقافة OnePot PURE مع 1675 ميكرولتر من ثقافة EFTU و 55 ميكرولتر لكل ثقافة من الثقافات من لوحة البئر العميقة.
احتضان الثقافة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز 260 دوران في الدقيقة ، أو حتى تصل الكثافة البصرية للثقافة إلى 0.2 إلى 0.3. حث الثقافة مع 500 ميكرولتر من 0.1 ملليمولار IPTG وتنمو لمدة ثلاث ساعات إضافية. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أربع درجات مئوية و 3، 220 مرة G لمدة 10 دقائق، وتخزين بيليه الخلية في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
في اليوم الثالث، قم بقياس كميات المخازن المؤقتة اللازمة لتنقية هذه المخازن وإضافة TCEP إليها جميعا كما هو مبين في النص. تخزين المخازن المؤقتة المتبقية دون TCEP في أربع درجات مئوية لتنقية المستقبل. Equilibrate العمود المشحون مع 30 ملليلتر من المخزن المؤقت A.After 25 ملليلتر من المخزن المؤقت A قد مرت من خلال، إغلاق العمود من أسفل.
إذابة الخلايا واستخدام ماصة المصلية لإعادة إنفاق بيليه الخلية في 7.5 ملليلتر من العازلة A.Lyse الخلايا باستخدام مسبار 130 واط. إذا كانت سونيكيشن ناجحة، فإن الحل يتحول إلى أغمق. تأكد من إبقاء الخلايا على الجليد ووضع المسبار عميقا بما فيه الكفاية دون لمس الأنبوب.
إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 21، 130 مرة G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية والحفاظ على lysate على الجليد. أضف الناسخ الفائق إلى العمود المتساوي. أغلق العمود من الأعلى وتأكد من عدم وجود تسرب.
احتضان العمود لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية تحت دوران باستخدام أنبوب الدوار. Elute مكونات غير منضمة من العمود وغسل مع 25 ملليلتر من العازلة A.Wash العمود مع 25 ملليلتر من 25 ملليمولار imidazole العازلة. Elute البروتينات مع خمسة ملليلتر من 450 ملليمولار imidazole العازلة والحفاظ على البروتينات eluted على الجليد في جميع الأوقات.
تمييع اليواتي مع 25 ملليلتر من العازلة HT والحفاظ على الخليط على الجليد. أضف 15 ملليلتر إلى فلتر طرد مركزي 15 ملليلتر وركز على حجم 1.5 ملليلتر. أضف المتبقية 15 ملليلتر إلى عامل التصفية مع الحل المركزة والتركيز إلى 1.5 ملليلتر مرة أخرى.
إضافة 10 ملليلتر من المخزن المؤقت HT إلى عينة مركزة والتركيز على ملليلتر واحد. استرداد العينة المركزة وإضافة كمية متساوية من المخزن المؤقت للمخزون B وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. أثناء تبادل المخزن المؤقت استعادة العمود كما هو محدد في النص.
في اليوم الرابع، قم بقياس تركيز البروتين باستخدام م المقايسة برادفورد. ركز العينة مع 0.5 ملليلتر من ثلاثة كيلودالتون تصفية الطرد المركزي إلى 20 ملليغرام لكل ملليلتر. تحقق من تكوين بروتين OnePot PURE باستخدام صفحة SDS.
تمييع 2.5 ميكرولتر من العينة مع 7.5 ميكرولتر من الماء مختلطة مع 10 ميكرولتر من اثنين من العازلة X Laemmli، ومن ثم تحميل خمسة ميكرولتر و 2.5 ميكرولتر من العينات على الجل. تشغيل الصفحة SDS كما هو محدد في النص. ملء تركيز وطول الحمض النووي في الخلايا الصفراء المقابلة في جدول البيانات باستخدام اثنين إلى 10 نانومولار من الحمض النووي لرد الفعل.
ملء حجم رد الفعل الإجمالي المطلوب في microliters. إزالة الكواشف المطلوبة من الثلاجة وتذوب لهم على الجليد. ثم، ماصة كميات محسوبة من الماء والحمض النووي والطاقة حل إلى جانب واحد من أنبوب PCR أو زاوية واحدة من بئر على لوحة بئر 384.
ماصة كميات محسوبة من البروتين والحل ريبوسوم إلى الجانب الآخر من أنبوب PCR أو الزاوية المقابلة من لوحة بئر 384. تدور لمدة 30 ثانية لدمج مكونات التفاعل. لمنع التبخر أثناء تجارب قارئ اللوحة، أضف 35 ميكرولتر من الشمع السائل، واختم اللوحة بتسرب شفاف.
حضانة لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية. للقراءة على قارئ لوحة، وقياس كثافة فلوريسنس في الطول الموجي المطلوب كل دقيقتين. يظهر النجاح على التعبير في جميع السلالات الفردية المستخدمة في وقت لاحق لإعداد البروتين OnePot هنا.
تم تحليل التركيب العام للحل النهائي بروتين OnePot PURE من قبل صفحة SDS. ومن الملاحظ أن وحدة مكافحة الإرهاب موجودة بتركيز أعلى مقارنة بالبروتينات الأخرى، كما هو متوقع. تم تحليل غلة توليف محلول بروتين OnePot جنبا إلى جنب مع الريبوسومات الموسومة أو غير الموسومة من خلال مراقبة مضان eGFP بمرور الوقت.
تم تحليل مستويات التعبير من ثلاثة بروتينات مختلفة وصفت باستخدام tRNA القائمة الخضراء في نظام وضع العلامات في المختبر، أو تلطيخ كوماسي، على هلام صفحة SDS. لنظام PURE وظيفية، فمن الأهمية بمكان أن جميع السلالات التعبير عن البروتينات الخاصة بهم بشكل جيد. تسهل هذه التقنية تطبيق نظام PURE على هندسة النظام البيولوجي ، مما يتيح تطوير شبكات جينية جديدة وتشخيص جزيئي وعلاجات ومجموعات تعليمية.
