إعداد عينة قياسية تجعل من الصعب تحقيق إشارة جيدة إلى الضوضاء أثناء تجارب الحيود الأشعة السينية من البلورات الدقيقة. يهدف هذا البروتوكول إلى تقليل مصادر البلورات التي تشكلت في الخلفية بطريقة خاضعة للرقابة. يوفر استخدام الروبوتات المجمدة وشبكات cryoTEM منصة قوية للتلاعب بالبلورات الدقيقة بشكل متكرر ، مما يقلل من حجم السائل المحيط ويوفر تزجيجا سريعا للعينة.
البراعة اللازمة للتعامل مع الشبكات مماثلة لتلك اللازمة لحصاد الكريستال التقليدية. وثمة عامل هام آخر هو تحديد معلمات النشاف الأولية باستخدام حل التبلور، وهو أمر أساسي للحد من استخدام العينة. للبدء، قم بإعداد وتبريد ثلاجة الغطس الآلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
قبل الاستخدام مباشرة، قم بتفريغ التوهج لشبكات cryoTEM لمدة 25 ثانية مع تيار 15 مللي أمبير وضغط 0.39 ملليبار، ثم حافظ على شبكات تفريغ التوهج في طبق بيتري مغطى. تعيين الرطوبة النسبية للغرفة عينة إلى 90٪، ووقت النشاف إلى خمس ثوان. تأكد من أن يتم تعيين الفريزر يغرق تلقائيا العينة بعد النشاف كاملة.
فتح ختم البئر تبلور والخزان. إضافة بسرعة اثنين إلى خمسة ميكرولترات من محلول الخزان في قطرة الكريستال للحفاظ على حجم الانخفاض. نقل 10 ميكرولتر من محلول الخزان إلى أنبوب 0.5 ملليلتر للاستخدام في وقت لاحق وإعادة ختم البئر لمنع انخفاض التبلور من التجفيف.
استخدام ملقط تجميد يغرق لاختيار توهج واحد شبكة تفريغ وتحميل الشبكة في الصك مع الجانب الكربون التي تواجه بعيدا عن الذراع النشاف. تدوير ملقط عقد الشبكة بحيث يواجه الجانب الكربون الذراع النشاف. استخدم ماصة 2.5 ميكرولتر لتطبيق اثنين من ميكرولترات من محلول الخزان على الجانب غير الداعم لشبكة cryoTEM.
تدوير الشبكة مع الجانب الكربوني التي تواجه بعيدا عن الذراع النشاف وتطبيق بعناية السائل الخزان إلى الجانب دعم فيلم الكربون من الشبكة. بدء عملية النشاف ومراقبة السائل المسحوب من سطح الكربون حتى موجة ظهرت عبر سطح الشبكة مرئية. إذا كانت موجة الظهور غير مرئية، قم بزيادة وقت النشاف من ثانية إلى ثانيتين قبل أن تتراجع ذراع النشاف من الشبكة.
ضع لوحة التبلور تحت المجهر الخفيف وضع الهدف جيدا داخل مجال الرؤية. ضع شبكة تفريغ توهج جديدة في ثلاجة الغطس وطبق سائل الخزان على الجانب غير الداعم من الشبكة كما هو موضح سابقا. تدوير الشبكة مع الجانب دعم فيلم الكربون التي تواجه منفذ عينة من الفريزر يغرق.
قشر الختم المؤقت من لوحة تبلور واستخدام ماصة تعيين في اثنين من microliters لتنشق بلطف قطرة تبلور مرارا وتكرارا. نقل اثنين من microliters من الطين microcrystal يستنشق إلى الثلاجة يغرق وتطبيق كل عينة على الجانب الكربوني من شبكة cryoTEM. بدء النشاف ومراقبة لموجة من ظهرت، ثم تبدأ على الفور تجميد يغرق.
نقل بسرعة الشبكة من الإيثان السائل إلى مربع الشبكة مغمورة في النيتروجين السائل. بعد النشاف والغطس تجميد الشبكة، تراجع الشبكة سقطت من الإيثان السائل عن طريق إعادة تعيين الفريزر يغرق. إزالة ملقط عقد الشبكة من الفريزر يغرق ووضع الشبكة تحت المجهر الخفيف.
ضبط التركيز الدقيق وتقييم كثافة بلورات عبر الشبكة. بعد تحميل شبكة cryoTEM في SEM، قم بمحاذاة العينة ثم قم بتشغيل شعاع الإلكترون. في البداية تقييم الشبكة بأكملها في التكبير 45X وتسجيل الصورة، ثم زيادة التكبير لفحص أوثق من المربعات الشبكة الفردية حتى يتم رصد بلورات الفردية بوضوح.
تحرك حول الشبكة والتقاط الصور الثابتة ، مما يضمن أن الشبكات مسطحة وفيلم دعم الكربون سليم إلى حد كبير. تأكد من وجود العديد من البلورات المفردة مع هالة ضيقة من السائل المهتز المحيط بالكريستال والثقوب مرئية في فيلم دعم الكربون. أثناء مراقبة والتقاط صور الشبكة ، تأكد من عدم وجود مناطق كبيرة من السائل المهزوز ، ولا ينتشر الجليد السداسي أو الجليد السطحي عبر الشبكة ، وأن البلورات ليست متداخلة وموزعة بالتساوي عبر فيلم الدعم.
في ديوار رغوة كبيرة، تبريد العدد المطلوب من أصحاب عينة VMXm تحميلها في خرطوشة العينة. إضافة النيتروجين السائل فوق موضع العينة في محمل العينة. نقل بسرعة مربع الشبكة التي تحتوي على شبكات محملة microcrystal إلى عطلة مربع الشبكة على محمل العينة وفك الغطاء قليلا للحفاظ على غطاء فضفاضة وقابلة للدوران.
ارفع الشبكة من مربع الشبكة وتناوب الشبكة لوضع الشبكة مسطحة على حامل العينة. ضع بسرعة أداة circlip المبردة مسبقا فوق الشبكة في فتح الشبكة واضغط على الزر لتثبيت circlip. إضافة النيتروجين السائل حوالي 1.5 سنتيمتر فوق حامل العينة.
استخدم ملقط عينة VMXm لرفع حامل العينة المحمل بعناية ووضعه مرة أخرى في خرطوشة العينة. استبدل الغطاء الموجود على الخرطوشة، وتأكد من أن الدبوس الموجود أعلى الخرطوشة يتفاعل مع الثقب الموجود في الغطاء. وأظهرت الصور الدقيقة الإلكترونية المسح الضوئي من البلورات الدقيقة التي أعدت على شبكات cryoTEM الحد الأدنى من التشتت الخلفية.
كانت الشبكة خالية من السائل الزائد ولوحظت هالة ضيقة من السائل تحيط بالبلورات. وقد لوحظت بلورات متعددة الهد بشكل فردي وكذلك في كتل. وأظهرت بلورات الأنسولين أكبر قليلا أيضا بعض تكتل جنبا إلى جنب مع بلورات معزولة.
كما تم تركيب البلورات الدقيقة الكبيرة جدا بنجاح على شبكات cryoTEM. كانت الثقوب في فيلم دعم الكربون مرئية بوضوح ، مما يشير إلى النشاف القوي. تتطلب العديد من العينات المزيد من التحسين بسبب الاختلاف في وقت النشاف وتركيز البلورات الدقيقة.
الشبكات المحملة بالبلورات تقلل من كفاءة النشاف وسجلت شعريات متعددة في صورة حيود واحدة. يمكن أن يؤدي وقت النشاف القصير لحلول التبلور اللزجة للغاية إلى عينة رطبة بشكل مفرط. للحصول على حل تبلور اللزوجة أقل، يؤدي وقت النشاف القصير في سرقة البلورات الدقيقة على جانب واحد من الشبكات.
إن إعداد العينة الأمثل يجعل من الممكن استغلال القدرات الكاملة ل VMXm لجمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الجودة بأعلى دقة ممكنة مع نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء. تحديد النشاف الأولي لحل التبلور هو المفتاح لاستخدام عينة الحد الأدنى. إذا كانت العينة محدودة جدا، فتخطى تقييم الكثافة.
في نهاية المطاف، من الأفضل أن يكون لديك عينة مخففة. هذه العينات جاهزة الآن لتجارب حيود الأشعة السينية في خط شعاع VMXm ، أو حيود الإلكترون البلوري الدقيق ، أو طحن شعاع الأيونات المركزة قبل ED الصغير.
