ونحن ممتنون لأربر S. للفئران mGFP وأعضاء المختبر Zervas الذي قرأ ورقة نقدية ، وقدمت المساعدة التقنية. كان مدعوما من قبل ألف براون الدماغ الصيف كابلان علوم جائزة بحوث الدراسات العليا. وأيد نورمان E. بواسطة برنامج جائزة العلوم أبحاث الدماغ العليا. وقد تم تمويل هذا البحث أيضا من أموال الأبحاث بدء التشغيل (MZ).

تاموكسيفين إعداد وإجراء بالتزقيم الفم (E8.5) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون 20 ملغ / مل من تاموكسيفين تاموكسيفين عن طريق إذابة في زيت الذرة قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على nutator ودوامة بشكل متقطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حماية المخزون من مخزن تاموكسيفين ، الضوء على 4 درجات مئوية ، واستخدام لمدة تصل الى شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعيين مصير التجارب ، وإقامة الزوج تربية تتألف من الاناث وبستر السويسرية (wildtype ؛ شراؤها من Taconic) والذكور على حد سواء يحمل جين معين الأليل T CreER مراسل وأليل. لأغراض العرض التوضيحي ، ونحن به Wnt1 - T CreER ؛ mGFP الذكور (Ellisor 2009). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من الإناث وبستر السويسرية صباح كل يوم لظهور أحد المكونات المهبلية. يسمي الصباح (0900) من يوم ينظر إلى المكونات المهبل إلى 0.5 أيام بعد الجماع وحساب تاريخ تاموكسيفين الادارة القائمة على هذا نقطة انطلاق. (للحصول على هذه التجربة ، كانت تستخدم اليوم الجنينية 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقنة 1 مل مع إبرة تغذية الحيوان (20G X 1-1/2) لوضع 200 ميكرولتر من محلول المخزون تاموكسيفين (4 ملغ تاموكسيفين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كبح بشدة وقت الإناث الحوامل وبستر السويسرية استيعاب مؤخر العنق والظهر لشل حركة الرأس وذلك بتسليم الجانب البطني يكون مواجها لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الذيل بين الأصابع الحرة لابقاء الجسم في خط مستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الإبرة التغذية في زاوية الفم وتوجيه الإبرة بلطف على طول سقف الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير الإبرة بحيث تكون موازية للهيئة ، في حين تميل في الوقت نفسه رئيس الخلف للحفاظ على العنق على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دليل الإبرة أسفل المريء ، نحو المعدة. يجب الحرص على عدم دخول القصبة الهوائية. إذا كان هناك مقاومة على الإبرة ، يشارك الحيوان منعكس هفوة ، أو إذا كان الماوس الصراعات ، على الفور بإزالة الإبرة وحاول مرة أخرى بالتزقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبرة مرة واحدة التغذية في المعدة ، وإدارة تاموكسيفين الى المعدة وعودة المرأة إلى قفص منزلها حتى تاريخ تشريح. </li></ul> حج القحف : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي Intracardially مصير أخلاقي معين الفأر مع PFA 4 ٪ وإزالة الرأس مع مقص من خلال قطع في العمود الفقري فقط فوق الكتفين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل مشرط على طول خط الوسط الظهرية من الرأس (منقاري لعجزي) الى قطع طريق فروة الرأس وفضح سكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط ، بعيدا كشط الزائد أو أي نوع من الأنسجة العضلية لوعلى طول الجانب الخلفي من الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ثقب ، ملقط الجمجمة في خط الوسط منقاري عادل لبصيلات الشم وخلق ثقب صغير لاستيعاب نصائح من مقص الغرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضاف الى غرامة مقص هذا الثقب وإجراء شق الإنسي إلى الوحشي طول ما يقرب من بصيلات الشم. وهذا الخفض كسر الجمجمة عند تقاطع عظم الأنف والعظم الجبهي وتوفير إمكانية الوصول جيدة للمقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع على طول الغرز السهمي في الجمجمة (خط الوسط الظهرية) مع التأكد من الحفاظ على نصائح مقص الزاوية بعيدا عن الدماغ لتجنب إتلاف الأنسجة الكامنة وراءها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم بلطف الجمجمة مع ملقط وقشر بعيدا العظم على طول شق الإنسية لفضح الدماغ. قد الجمجمة رقاقة على شكل قطع صغيرة أو الانفصال في جو من المقاطع. الاستمرار في استخدام الملقط لإزالة كافة العظام ، الجبهي الجداري ، بين الجداري والقذالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر العظام والتغليف paraflocculi (الواقعة على طول الحواف الجانبية من الدماغ على مستوى المخيخ) بواسطة معسر عظام كروية على كل جانب. برفق بعيدا عن العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره رئيس رأسا على عقب (الجانب الظهري أسفل) واستخدام ملقط لقطع الأعصاب القحفية والافراج عن الدماغ من الجمجمة. </li></ul> جبل بأكمله الميكروسكوب : الدماغ الكبار <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم المخ لتعليم الكبار GFP باستخدام نطاق الفلورسنت تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الدماغ على طبق بتري تحتوي على صورة باستخدام برنامج تلفزيوني وPictureFrame أو برامج أخرى ملائمة. </li></ul> جبل بأكمله الميكروسكوب : E12.5 الأجنة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم الأجنة جبل بأكمله لوسم GFP باستخدام نطاق الفلورسنت تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تلك GFP الإيجابية التي جبل بأكمله إلى طبق بتري تحتوي على صورة باستخدام برنامج تلفزيوني وPictureFrame أو برامج أخرى ملائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقرصة قبالة قطعة صغيرة من الذيل من كل الأجنة ، ومكان كل قطعة في أنبوب PCR والنسيج الوراثي باستخدام PCR (Ellisor 2009) على حد سواء لتأكيد النتائج الأليلات المشاهدة عبر تحليل جبل بأكمله. </li></ul> الجزئي تشريح وإعداد يزدرع من الدماغ المتوسط ​​بطني من E12.5 الأجنة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح التالية من سلسلة الرحم و identification مصير المعنونة الأجنة التي يشن مضان كله ، لنقل الأجنة في برنامج تلفزيوني العقيمة الجليد الباردة في خلية طبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص غرامة ، وإزالة جزء من رأس الجنين القطع بالعرض ، لعجزي قسيم معيني 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وإزالة جزء منقاري من الرأس مع خفض الاكليلية من خلال الدماغ البيني. هذا وسوف يعرض بنية أنبوب يشبه فيه البطين 4 من خلال النموذج حويصلة الدماغ المتوسط ​​ممرا بين الأنسجة الظهرية والبطنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بعناية نصائح مقصية في البطين 4 ، وعلى طول خط الوسط قص ظهري ، لعجزي منقاري ، وفتح أنبوب تماما ، وخلق &quot;الكتاب المفتوح&quot; التحضير. والآن يتعرض الدماغ المتوسط ​​بطني إعلامي ، في حين أن نصفي الدماغ المتوسط ​​الظهرية من سيقيم أفقيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي المتبقية غير الأنسجة العصبية تحت بطني الدماغ المتوسط ​​من أجل النسيج لوضع أكثر صراحة. إذا لزم الأمر ، وجعل الشقوق في الجوانب منقاري والذيلية بحيث الظهرية &quot;أجنحة&quot; للازدراع سيضع شقة كذلك. ينبغي أن يزدرع الآن تشبه الفراشة &quot;، الذي يمثل الدماغ المتوسط ​​الظهرية الأجنحة ، وقسيم معيني (1) والذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمزيد من عزل الدماغ المتوسط ​​البطني للتحليل FACS أو تجارب زراعة الخلايا ، وإزالة الوحشي (الجوانب الظهرية) من الأنسجة. </li></ul> ممثل النتائج : في هذه التجربة GIFM ، Wnt1 - معربا عن الخلايا بشكل دائم وملحوظ خلال مرحلة التطور الجنيني heritably بواسطة بالإدارة تاموكسيفين في E8.5 لCreERT - Wnt1 ؛ mGFP الأجنة. في وقت لاحق ، وهذه الخلايا هي تصور عن طريق وضع علامة جبل مضان كله والمناعية المقطع لتحديد كيفية Wnt1 المستمدة من الخلايا العصبية تساهم في الهياكل عبر التنمية. مضان كله جبل تعتمد على عنصر GFP غشاء ملزمة لمراسل mGFP وبالتالي يوفر المعلومات الخلوية وكذلك من وجهة نظر شاملة Wnt1 المستمدة من الإسقاطات العصبية. على سبيل المثال ، مع تاموكسيفين الإدارة في الأجنة Wnt1 - E8.5 CreERTmGFP ، في معرض E12.5 مضان GFP في المقام الأول في الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر الخلفي والحبل الشوكي (الشكل 1A). في التكبير عالية ، وتعتبر التوقعات العصبية في الدماغ المتوسط ​​غرامة التعصيب ، جدار الجسم والأطراف ، والمنطقة القحفي. في هذه المرحلة التنموية والجنين غير شفافة والداخلية وضع العلامات GFP هو تمييزها بسهولة. لكن ، وكما تطور الدماغ ، وكثافة الأنسجة الناضجة يحجب GFP مضان المنبثقة عن هياكل الدماغ الداخلية. لذلك ، مع ادارة تاموكسيفين في E8.5 ، يلاحظ وجود العلامات فقط GFP طفيفة في أكيمات متفوقة من الكبار بحلول مضان جبل بأكمله (الشكل 1C ، أقحم). بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر بعض التوقعات محواري التعقيب على طول السطح البطني من الدماغ المؤخر (لا يظهر). في المقابل ، عندما يدار تاموكسيفين في E9.5 ، وسم GFP كبيرة تحدث في جميع أنحاء أكيمات السفلي بأكمله (1B الشكل ، الشكل). وهذا قد يزيد في مضان كله تشير إلى أن جبل Wnt1 ، معربا عن الخلايا في E9.5 تساهم بشكل كبير في مزيد من المناطق السطحية من المخ الأوسط الظهرية أو تقديم المزيد من العمليات داخل هذه المنطقة من التعبير عن الخلايا Wnt1 من E8.5. بغض النظر ، فإن هذا الاختلاف في جبل مضان كله يعكس الطبيعة الديناميكية لWnt1 التعبير خلال تطوير ويوضح كيف يمكن أن تستخدم لمتابعة GIFM السكان خلية متميزة من الجنين في الناضج. مع أقسام المناعية مصير والأنسجة المعينة من Wnt1 - CreERT ؛ يتم تحليل الحيوانات mGFP على المستوى الخلوي. وتستخدم الأجسام المضادة ضد GFP وβ - غالاكتوزيداز (β - غال) بالاشتراك مع مجموعة متنوعة من المؤشرات الحيوية أنسجة محددة لتحديد حجم مساهمة غرامة الخلوية من سلالة Wnt1 الهياكل العصبية وأنواع الخلايا. تاموكسيفين مع الإدارة في E8.5 وتحليل الأنسجة في E12.5 ، وخلايا ايجابية مزدوجة (GFP + و + β - غال) ويلاحظ في جميع أنحاء الدماغ المتوسط ​​والدماغ المؤخر مع التوقعات التي تجوب في بطني الدماغ المتوسط ​​(الشكل 1B). في الدماغ الكبار ، وWnt1 - ملحوظا في نسب E8.5 يثير العديد من الهياكل الدماغ المتوسط ​​بما في ذلك أكيمات الأعلى والأدنى ، وكذلك على مقربة من السكان خلية الدوبامين في المنطقة الجوفية السقيفية substantia وأسود (الشكل 1D) (انظر Zervas أيضا 2004). في المقابل ، Wnt1 - ملحوظا في نسب E9.5 يثير أكيمات السفلية وكذلك الخلايا العصبية في المناطق القريبة من السكان خلية الدوبامين (الشكل 1F). <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 نتائج ممثل عن مصير Wnt1 - تعيين : أمثلة على جبل لكامل والنتائج كيمياء سيتولوجية مناعية في Wnt1 - CreERT ؛ mGFP الأجنة والبالغين أدمغة مصير معين (علامة) في E8.5 (AD)وE9.5 (EF). ألف Wnt 1 - CreER ؛ mGFP الأجنة في المعرض E12.5 مضان GFP في المقام الأول في الدماغ المتوسط ​​(MB) ، الدماغ المؤخر الخلفي (الهيموغلوبين) والحبل الشوكي (SP). تصور باء الخلايا المحددة وتحليلها على المستوى الخلوي بواسطة المناعية كما هو مبين في هذا القسم 1 ميكرون سميكة البصرية (الهدف 40X ، ض سلسلة الاستحواذ). β - غالاكتوزيداز النووية (nβ غال) وسم الأضداد (الحمراء) ، ووضع العلامات GFP الأضداد (الأخضر) يدل على مصير المعنونة خلايا الدماغ المتوسط ​​هو موضح في بطني. هنا ، خلايا معاد ايجابية مزدوجة (nβ غال + / + GFP) بسبب طبيعة مراسل mGFP الشرطي. جيم الجامعة يشن المجهري يكشف تنوير خافت مضان GFP في أكيمات متفوقة (SC) من البالغين (الشكل). تقييم نسب Wnt1 ملحوظا في E8.5 على أبواب الكبار مع التكبير المنخفض (5X) المجهري يكشف عن أن نسب Wnt1 يثير الدماغ المتوسط ​​بما في ذلك الهياكل العلوية (SC) والسفلية (IC) أكيمات (C). D. A 40X ، الفرع 1 مم الضوئية المأخوذة من الدماغ المتوسط ​​البطنية في محيط الخلايا العصبية الدوبامين مع خلايا + nβ غال وGFP الغنية + محواري الضفيرة. E. علامات على النتائج في وضع العلامات E9.5 GFP الكبير الذي لوحظ بسهولة في أكيمة السفلي من الدماغ المتوسط ​​بواسطة جبل مضان كله (الشكل). وتتركز نسب Wnt1 ملحوظا في E9.5 على أبواب الكبار (β - غال + ، أحمر) في الأكيمة السفلية (الظهري الخلفي الدماغ المتوسط) كما رأينا مع التكبير المنخفض (5X) المجهري (E). F. A 40X ، الفرع 1 مم الضوئية المأخوذة من الدماغ المتوسط ​​البطنية في محيط الخلايا العصبية الدوبامين مع خلايا + nβ غال وGFP الغنية + محواري الضفيرة. وتقتصر الخلايا العصبية تدريجيا Wnt1 المستمدة ملحوظا في مقابل E8.5 E9.5 من المساهمة في الدماغ المتوسط ​​الظهرية ، في حين أن نسب Wnt1 استمرت في المساهمة في الدماغ المتوسط ​​البطني.

<ol>
	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

وساهمت جميع المؤلفين بالتساوي على هذا العمل ، ويتم سرد أبجديا. مساهمة كل فرد هو واضح من قبل له أو مشاركتها في مقالة الفيديو.

ويمكن استخدام هذا النظام الذي GIFM أننا أظهرنا للرد على مجموعة واسعة من الأسئلة في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الفئران المهندسة مع السائقين لجنة المساواة العرقية المختلفة لاستهداف أي نوع من الخلايا والأنسجة الوراثية أو نسب الفائ?...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

يتم إنشاؤها بواسطة خرائط مصير وسم وتعقب الخلايا في الجسم الحي لتحديد كيفية المساهمة في الأسلاف هياكل محددة وأنواع الخلايا والأنسجة في تطوير الكبار. تقدم في هذا المفهوم هو G enetic أنا أكلت nducible F M apping (GIFM) الذي يربط بين التعبير الجيني ، مصير الخلية ، والسلوكيات خلية في الجسم الحي ، لإنشاء الخرائط على أساس النسب مصير الجينية. GIFM يستغل X - CreER خطوط حيث X هو جين أو مجموعة من العناصر التنظيمية التي تمنح الجينات التعبير المكاني للبروتين البكتيريا المحورة ، لجنة المساواة العرقية recombinase (CreER T). CreER T يحتوي على تعديل ه strogen يجند eceptor ص المجال الملزمة التي تجعل CreER T المحتبسة في السيتوبلازم في غياب تاموكسيفين المخدرات. الربط من CreER تاموكسيفين T النشرات التي translocates إلى النواة وإعادة التركيب يتوسط بين تسلسل الحمض النووي محاط مواقع loxP. في GIFM ، تأشب يحدث عادة بين loxP يحيط إيقاف الكاسيت السابقة جين مراسل مثل GFP. هي ولدت الفئران لاحتواء أي منطقة أو خلية نوع محدد CreER وأليل مراسل الشرطي. سوف الفئران غير المعالجة لا نملك بمناسبة لأن الكاسيت في إيقاف مراسل يمنع النسخ مزيد من الجين المراسل. ندير تاموكسيفين بالتزقيم عن طريق الفم لتوقيت الحامل الإناث ، التي تنص على مراقبة الزمنية للإفراج T CreER وإزفاء اللاحقة إلى نواة إزالة كاسيت من إيقاف الصحفي. بعد إعادة التركيب ، وأليل المراسل هو constitutively وأعرب عن heritably. هذه السلسلة من الأحداث علامات مثل هذه الخلايا التي يتم تسجيلها لا يمحى تاريخهم الجينية. مراسل معاد يخدم بالتالي بمثابة التتبع الإخلاص النسب العالية التي الجينية ، مرة واحدة ، يتم uncoupled من التعبير الجيني يستخدم في البداية لحملة CreER تي. نحن نطبق GIFM في الماوس لدراسة التطور الطبيعي والتأكد من مساهمة الأنساب الجينية لأنواع الخلايا والأنسجة الكبار. ونحن أيضا استخدام GIFM لمتابعة الخلايا على الخلفيات الوراثية الطافرة من أجل فهم أفضل الظواهر المعقدة التي تحاكي السمات البارزة من الاضطرابات الجينية البشرية. هذه المقالة الفيديو دلائل الباحثين من خلال الطرق التجريبية لتطبيق بنجاح GIFM. نحن لشرح طريقة استخدام لدينا تتميز كذلك Wnt1 - T CreER ؛ الفئران التي mGFP بالإدارة تاموكسيفين في اليوم الجنينية (E) 8.5 خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم تليها في تشريح وتحليل من قبل E12.5 stereomicroscopy epifluorescence. نظهر أيضا كيفية الدقيقة تشريح مصير المجالات المعينة لإعداد يزدرع أو تحليل وتشريح FACS الكبار مصير المعنونة لتصوير أدمغة جبل بأكمله الفلورسنت. مجتمعة ، هذه الإجراءات تسمح للباحثين لمعالجة المسائل الحرجة في البيولوجيا التطورية ونماذج المرض.

Watch this Scientific Journal Video about A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo at JoVE.com

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

رسم الخرائط الجينية مصير محرض (GIFM) علامات المسارات والخلايا مع غرامة السيطرة المكانية والزمانية<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ويوضح كيفية الخلايا من سلالة وراثية محددة تسهم في تطوير وأنسجة البالغين. أظهرت هنا هي التقنيات المطلوبة لتعيين مصير أجنة الفئران E12.5 للتحليل وepifluorescent ازدراع.

نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

a-practical-approach-to-genetic-inducible-fate-mapping-visual-guide

Research

JoVE Journal

Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K Views.  Brown University. رسم الخرائط الجينية مصير محرض (GIFM) علامات المسارات والخلايا مع غرامة السيطرة المكانية والزمانية في الجسم الحي ويوضح كيفية الخلايا من سلالة وراثية محددة تسهم في تطوير وأنسجة البالغين. أظهرت هنا هي التقنيات المطلوبة لتعيين مصير أجنة الفئران E12.5 للتحليل وe...

Video: A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

: نظام الحبل المغناطيسي بالتحقيق البصرية والشمية التحكم الطيران توسط في ذبابة الفاكهة

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

دليل عملي لPhylogenetics لNonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

التحقق من صحة نموذج الفأر لعرقلة ينك مجمعات بطريقة خلية محددة

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...