אנו מודים ס Arber עבור העכברים mGFP ולחברי במעבדה Zervas מי אנושות לקרוא את העיתון וסיפקה סיוע טכני. א &#39;בראון נתמכה על ידי המוח המדע פרס קפלן קיץ מחקר לתארים מתקדמים. א Normand נתמכה על ידי מדעי המוח פרס תוכנית מחקר לתואר שני. מחקר זה מומן גם על ידי קרנות מחקר הזנק (MZ).

טמוקסיפן הכנה נוהל Gavage שבעל פה (E8.5) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון המניות של טמוקסיפן ידי המסת טמוקסיפן בשמן תירס מחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפתרון על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות nutator ו מערבולת לסירוגין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן המניות טמוקסיפן מהחנות אור, ב 4 ° C, ושימוש של עד חודש אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הניסויים מיפוי גורל, להקים זוג לרבייה המורכב וובסטר שוויצרי הנשי (wildtype; שנרכשו Taconic) ואת זכר שניהם נושאת גן ספציפי קואל אלל T ו אלל הכתב. למטרות הדגמה, אנו משתמשים Wnt1 קואל-T; mGFP גברים (Ellisor 2009). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שוויצרי נקבות וובסטר בכל בוקר להופעתו של תקע הנרתיק. ציין הבוקר (0900) של היום תוסף הנרתיק נתפסת 0.5 ימים שלאחר משגל ו לחשב את התאריך של הממשל טמוקסיפן מבוסס על נקודה זו ההתחלה. (לצורך ניסוי זה, יום עובריים 8.5 היה בשימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט חיה האכלה (20 גרם x 1-1/2) להכין 200 μl של הפתרון מניות טמוקסיפן (4 מ&quot;ג טמוקסיפן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן היטב את הנקבה בזמן בהריון שוויצרי וובסטר ידי אחיזה של העורף בצוואר ובגב כדי לשתק את הראש להתהפך כך את הצד הגחוני הוא פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הזנב בין האצבעות חופשי כדי לשמור על הגוף בקו ישר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מחט האכלה לפינת הפה בעדינות מדריך את המחט לאורך הגג של הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את המחט כך שהוא מקביל לגוף, תוך הטיית הראש לאחור בעת ובעונה אחת כדי לשמור על צוואר ישר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדריך את המחט הוושט, אל הקיבה. היזהר שלא להזין את קנה הנשימה. אם יש התנגדות על המחט, רפלקס ההקאה של החיה עוסקת, או אם העכבר המאבקים, להסיר לאלתר את המחט ולנסות את gavage שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מחט האכלה הוא בבטן, לנהל את טמוקסיפן לתוך הקיבה להחזיר את הנקבה לכלוב בביתה עד למועד לנתיחה. </li></ul> Craniotomy: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Intracardially perfuse גורל מבוגר ממופה עכבר עם PFA 4% ולהסיר את הראש במספריים על ידי חיתוך דרך עמוד השדרה בדיוק מעל הכתפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל אזמל לאורך קו האמצע הגבי של הראש (מקורי כדי הזנב) לחתוך דרך הקרקפת ולחשוף את לחתור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, לגרד ממנו כל רקמת שריר עודפת או בצד ואת האחורי של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם לנקב, מלקחיים את הגולגולת על קו האמצע מקורי רק הנורות חוש הריח וליצור חור קטן כדי להתאים את קצות מספריים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המספריים מצוין לתוך החור הזה ולעשות חתך המדיאלי לאורך לרוחב של כ נורות חוש הריח. לחתוך זה ישבור את הגולגולת בצומת של עצם האף ועצמות חזיתית ולספק גישה טובה המספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לאורך התפרים sagittal בגולגולת (קו האמצע הגבי) והקפד לשמור על טיפים מספריים בזווית אל המוח כדי למנוע פגיעה ברקמה הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לתפוס את הגולגולת עם מלקחיים לקלף העצם לאורך החתך המדיאלי לחשוף את המוח. הגולגולת עשויה שבב מעל לחתיכות קטנות או להתנתק בקטעים גדולים יותר. המשך באמצעות מלקחיים כדי להסיר את כל, עצמות חזיתית הקודקודית, interparietal, ואת העורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצח את עצמות encasing paraflocculi (הממוקם בשולי לרוחב של המוח ברמה של המוח הקטן) על ידי צובט את העצמות כדורית בכל צד. משוך בעדינות את העצמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את הראש הפוך (צד הגב למטה) ולהשתמש מלקחיים לנתק את עצבי הגולגולת ולשחרר את המוח מהגולגולת. </li></ul> מיקרוסקופית שלמות הר: המוח למבוגרים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העריכו את המוח הבוגר עבור GFP סימון באמצעות היקף הניתוחים ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת המוח בצלחת פטרי המכילות PBS ולצלם באמצעות PictureFrame או תוכנה מתאימה אחרת. </li></ul> מיקרוסקופית שלמות הר: E12.5 עוברים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת עוברים הר שלם GFP סימון באמצעות היקף הניתוחים ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה אלה GFP חיובית על ידי הר שלם כדי בצלחת פטרי המכילות PBS ולצלם באמצעות PictureFrame או תוכנה מתאימה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים לצבוט חתיכה קטנה של הזנב מעובר אחד, כל פיסת מקום בצינור PCR ו גנוטיפ רקמות באמצעות PCR (Ellisor 2009) עבור שני אללים לאשר לראות תוצאות באמצעות ניתוח הר שלם. </li></ul> Micro-לנתיחה והכנת explant של mesencephalon הגחון מ E12.5 עוברים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לנתיחה משרשרת id הרחםentification הגורל ממופה עוברים על ידי כל הר פלואורסצנטי, עוברי העברה קר כקרח סטרילי PBS בצלחת תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים בסדר, להסיר את החלק הראש של העובר קיצוץ רוחבי, הזנב כדי rhombomere 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להסיר את החלק מקורי של הראש עם חתך דרך העטרה diencephalon. זה יחשוף את מבנה דמוי צינור שבו החדר 4 באמצעות הטופס שלפוחית ​​mesencephalic צינור בין רקמות הגבי ו הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף את הטיפים מספריים לתוך החדר 4, ו - חיתוך לאורך קו האמצע הגב, הזנב אל מקורי, מלא פתיחת צינור, יצירת &quot;ספר פתוח&quot; הכנה. Mesencephalon הגחון עכשיו יהיה חשוף מדיאלית, בעוד שני חצאי הגבי של mesencephalon יהיה להתגורר רוחבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל רקמה הנותרת ללא עצביים מתחת mesencephalon הגחון על מנת הרקמה להניח יותר בפשטות. אם יהיה צורך, לעשות חריצים בהיבטים מקורי ואת הזנב כך הגבי &quot;כנפיים&quot; של explant יהיה שכב גם כן. Explant אמור כעת דומה &quot;פרפר, בו mesencephalon הגב מייצג את הכנפיים, ואת rhombomere 1 הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמשיך לבודד את mesencephalon הגחון לניתוח FACS או תרבות ניסויים התא, להסיר את לרוחב (היבטים הגבי) של הרקמה. </li></ul> נציג תוצאות: בניסוי זה GIFM, Wnt1-להביע את התאים לצמיתות ומסומן heritably ידי מתן טמוקסיפן ב-E8.5 עד Wnt1 CreERT במהלך embryogenesis; עוברים mGFP. כתוצאה מכך, התאים האלה מסומנים הם דמיינו באמצעות פלואורסצנציה הר שלם אימונוהיסטוכימיה סעיף כדי לקבוע כיצד Wnt1 הנגזרות תאים לתרום מבנים עצביים לאורך הפיתוח. שלמה הר הקרינה מסתמך על מרכיב מחויב GFP הממברנה של הכתב mGFP ולכן מספק מידע סלולריים וכן להציג העל של Wnt1 הנגזרות תחזיות עצביים. לדוגמה, עם הממשל טמוקסיפן ב E8.5, Wnt1-CreERTmGFP עוברים על הקרינה E12.5 התערוכה GFP בעיקר המוח התיכון, למוח האחורי האחורי ואת חוט השדרה (איור 1A). בהגדלה גבוהה, תחזיות עצבי עדין נראים innervating המוח התיכון, קיר הגוף, איבר, ובאזור craniofacial. בשלב זה התפתחותי, העובר הוא שקוף וסימון GFP הפנימי להבחין בקלות. עם זאת, כמו המוח מתפתח, את צפיפות רקמת בוגרת מטשטש GFP הקרינה הנובעת מבנים מוחיים פנימיים. לכן, עם הממשל טמוקסיפן ב E8.5, רק תיוג GFP קטין הוא ציין colliculi מעולה של המבוגר על ידי כל הר פלואורסצנטי (תרשים 1C, הבלעה). בנוסף, התחזיות כמה axonal נראים שזרמו על פני השטח של הגחון למוח האחורי (לא מוצג). לעומת זאת, כאשר טמוקסיפן ניתנת על E9.5, תיוג GFP משמעותית מתרחשת ברחבי colliculi הנחות כולה (איור 1B, הבלעה). עלייה זו הקרינה הר שלם עשוי להצביע על כך Wnt1-לבטא בתאי ב E9.5 לתרום באופן משמעותי יותר שטחיים באזורים של המוח התיכון הגבי או להאריך את התהליכים יותר בתוך האזור הזה מאשר Wnt1 תאים להביע מ E8.5. בכל מקרה, זה כל ההבדל הר הקרינה משקף את הדינאמיות של הביטוי Wnt1 במהלך הפיתוח GIFM מדגים כיצד ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר אוכלוסיות תאים נבדלים העובר לתוך המבוגר בוגרת. עם, אימונוהיסטוכימיה גורל סעיפים רקמות ממופה מן Wnt1-CreERT; חיות mGFP מנותחים ברמה התאית. נוגדנים נגד ה-GFP ו - β-galactosidase (β-gal) משמשים בשילוב עם מגוון רחב של סמנים ביולוגיים רקמות ספציפיות כדי לקבוע את היקף התרומה בסדר הסלולר של שושלת Wnt1 כדי מבנים עצביים סוגי תאים. עם הממשל טמוקסיפן ב E8.5 וניתוח רקמות בבית E12.5, תאים חיובי כפול (GFP + ו β-gal +) הם נצפו ברחבי המוח התיכון, ואל למוח האחורי עם תחזיות שזורמים המוח התיכון הגחון (איור 1B). במוח הבוגר, Wnt1-השושלת המסומנים ב E8.5 מעורר המוח התיכון מבנים רבים כולל הקוליקולוס העליון ונחות כמו גם בסביבה של אוכלוסיות תאים דופאמינרגיים באזור tegmental הגחון substantia nigra ו (איור 1D) (ראה גם Zervas 2004). לעומת זאת, Wnt1 השושלת מסומן ב-E9.5 מעורר colliculi נחות כמו גם נוירונים באזור אוכלוסיות תאים דופאמינרגיים (איור 1F). <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 תוצאות נציג למיפוי Wnt1-גורל.: דוגמאות של כל הר ואת התוצאות immunocytochemistry Wnt1 ב-CreERT; עוברים mGFP וגורלו מוחות בוגרים ממופה (מסומן) בשעה E8.5 (AD)ו E9.5 (EF). א Wnt 1-קואל; עוברים mGFP על הקרינה E12.5 התערוכה GFP בעיקר במוח התיכון (MB), למוח האחורי האחורי (המוגלובין) ואת חוט השדרה (SP). התאים מסומנים ב דמיינו ונותחו ברמה התאית על ידי אימונוהיסטוכימיה כפי שמוצג על סעיף 1-מיקרומטר זה אופטי עבה (אובייקטיבי 40X, Z-סדרת הרכישה). תיוג נוגדן גרעיני β-galactosidase (nβ גל) (אדום) וסימון GFP נוגדן (ירוק) עולה בגורל ממופה תאים שמוצג המוח התיכון הגחון. הנה, תאים recombined הן חיוביות כפול (nβ גל + /-GFP +) בגלל האופי של הכתב mGFP מותנה. ג Whole-Mount מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתפרחת מגלה GFP קלוש הקוליקולוס העליון (SC) של המבוגר (הבלעה). הערכת השושלת Wnt1 המסומנים ב E8.5 על סעיפים מבוגר עם בהגדלה נמוכה (5X) מיקרוסקופית מגלה כי השושלת Wnt1 מעורר מבנים המוח התיכון כולל מעולה (SC) ונחותים (IC) colliculi (C). ד 40X, 1 מ&quot;מ סעיף אופטי שנלקחו המוח התיכון הגחון בסביבה של נוירונים דופאמינרגיים עם nβ גל תאים + ו-GFP עשיר + מקלעת axonal. א &#39;סימון על התוצאות E9.5 ב תיוג GFP ניכר כי הוא ציין בקלות colliculus הנחות של המוח התיכון כולו על ידי הר פלואורסצנטי (הבלעה). השושלת Wnt1 המסומנים ב E9.5 על סעיפים מבוגר (β-gal +, אדום) הוא מרוכז colliculus נחות (הגבי-האחורי המוח התיכון) כפי שהוא נראה במיקרוסקופ בהגדלה נמוכה עם (5X) (E). פ 40X, 1 מ&quot;מ סעיף אופטי שנלקחו המוח התיכון הגחון בסביבה של נוירונים דופאמינרגיים עם nβ גל תאים + ו-GFP עשיר + מקלעת axonal. נוירונים Wnt1 הנגזרות המסומנים ב E8.5 E9.5 לעומת מוגבלים בהדרגה מן התורמים המוח התיכון הגבי, בעוד שושלת Wnt1 ממשיכה לתרום המוח התיכון הגחון.

<ol>
	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

כל המחברים תרמו במידה שווה עבודה זו מופיעים בסדר אלפביתי. התרומה של כל אדם ניכר על ידי ההשתתפות שלו או שלה במאמר וידאו.

המערכת GIFM שאנחנו הוכיחו יכול לשמש כדי לענות על מגוון רחב של שאלות במגוון של תהליכים תאיים. למשל, בעכברים מהונדסים עם נהגים שונים Cre יכול לשמש מטרה לכל סוג תא, רקמה או שושלת היוחסין הגנטי של עניין. בנוסף, בגלל טמוקסיפן יכול להינתן בכל נקודת זמן עובריים או לאחר הלידה, רקו?...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

מפות הגורל נוצרות על ידי סימון ומעקב אחר תאים in vivo כדי לקבוע כיצד אבות לתרום מבנים ספציפיים סוגי תאים בפיתוח רקמות מבוגר. מראש המושג הזה הוא אני G enetic nducible F אכלו M apping (GIFM), המקשר ביטוי גנים, גורל התא, והתנהגויות תא in vivo, כדי ליצור מפות גורל מבוסס על השושלת הגנטית. GIFM מנצל X-קואל קווי כאשר X הוא גן או קבוצת גנים גורמים רגולטוריים אשר מקנה הביטוי המרחבי של חלבון bacteriophage שונה, Cre recombinase (קואל T). קואל T מכיל שונה דואר strogen r תחום eceptor ליגנד מחייב אשר הופך קואל T מוחרם בציטופלסמה בהיעדר התרופה טמוקסיפן. הכריכה של טמוקסיפן משחרר קואל T, אשר translocates לגרעין ו רקומבינציה מתווכת בין רצפי DNA מוקף אתרים loxP. ב GIFM, רקומבינציה מתרחשת בדרך כלל בין loxP מוקף הפסק הקלטת הקודמת גן הכתב כגון GFP. עכברים הם גידלו להכיל או אזור או סוג תא ספציפי קואל ו אלל כתב מותנה. עכברים שלא טופלו בחומר לא יהיה סימון כי קלטת עצור הכתב מונע שעתוק נוסף של הגן הכתב. אנו לנהל טמוקסיפן ידי gavage אוראלי מתוזמן נשים בהריון, אשר מספק שליטה הזמני של שחרור T קואל ו טרנסלוקציה לאחר גרעין הסרת קלטת עצור מן הכתב. בעקבות רקומבינציה, את האלל הוא כתב constitutively והביע heritably. זו סדרה של אירועים סימני תאים כאלה שההיסטוריה הגנטי שלהם נרשם בל יימחה. הכתב recombined ובכך משמש נותב איכות גבוהה שושלת גנטית, פעם אחת, הוא מנותקים ביטוי הגן השתמשו בתחילה לנהוג T קואל. אנו מיישמים GIFM בעכבר ללמוד התפתחות תקינה ועל תרומתו לבירור של שושלות גנטיות סוגי תאים ורקמות מבוגר. בנוסף, אנו משתמשים GIFM לעקוב תאים על רקע גנטי מוטציה כדי להבין טוב יותר פנוטיפים מורכבים המחקות המאפיינים הבולטים של הפרעות גנטיות האדם. מאמר זה וידאו מדריכים החוקרים באמצעות שיטות ניסיוניות בהצלחה להחיל GIFM. אנו מדגימים את השיטה באמצעות מאופיין היטב שלנו Wnt1-T קואל, עכברים mGFP ידי מתן טמוקסיפן ביום עובריים (E) 8.5 gavage דרך הפה ואחריו לנתיחה בבית E12.5 וניתוח על ידי stereomicroscopy epifluorescence. אנחנו גם מדגימים כיצד מיקרו לנתח תחומים גורל ממופה להכנת explant או ניתוח FACS ו לנתח מבוגר גורל ממופה מוחות עבור הדמיה הר שלם ניאון. ביחד, נהלים אלה לאפשר לחוקרים לענות על שאלות קריטיות בביולוגיה התפתחותית ומודלים המחלה.

Watch this Scientific Journal Video about A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo at JoVE.com

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

מיפוי גנטי הגורל ועין מתנהלת (GIFM) סימני עקבות תאים עם שליטה במרחב ובזמן קנס<em&gt; In vivo</em&gt; ו מבהיר כיצד תאים משושלת גנטית ספציפית לתרום בפיתוח רקמות בוגרות. הפגינו הנה טכניקות נדרש גורל המפה E12.5 עוברי עכבר לניתוח epifluorescent ו explant.

גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

a-practical-approach-to-genetic-inducible-fate-mapping-visual-guide

Research

JoVE Journal

Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K Views.  Brown University. מיפוי גנטי הגורל ועין מתנהלת (GIFM) סימני עקבות תאים עם שליטה במרחב ובזמן קנס In vivo ו מבהיר כיצד תאים משושלת גנטית ספציפית לתרום בפיתוח רקמות בוגרות. הפגינו הנה טכניקות נדרש גורל המפה E12.5 עוברי עכבר לניתוח epifluorescent ו explant.

Video: A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

מערכת מגנטית לקשור לחקור חזותית חוש הריח בקרת טיסה מתווך תסיסנית

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

הגורל מיפוי בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי גיבוש תפלצת

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

מדריך מעשי לphylogenetics לNonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...