نشكر J. تشن لتوفير قفص بروتوكول التوليف فلوريسئين-ديكستران. وأيد هذا البحث من قبل شهر مارس من جائزة الدايمات 5 FY09-78، أمريكا جائزة جمعية القلب 09BGIA2090075، وجائزة NIH / NHLBI R01 HL107369-01 لSS A الخاصة. شكرا لClosson C. للمساعدة المجهري له

<ol>
	<li>Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mEosFP-based+green-to-red+photoconvertible+subcellular+probes+for+plants.">mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants.</a> Plant physiology. 154, 1573-1587 .</li><li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).</li><li>Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature. 6, 153-159 (2009).</li><li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein.">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature protocols. 1, 960-967 (2006).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Watanabe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-organelle+tracking+by+two-photon+conversion.">Single-organelle tracking by two-photon conversion.</a> Optics express. 15, 2490-2498 (2007).</li><li>Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+embryonic+blood+in+zebrafish:+multi-+and+unipotential+lineages+are+segregated+at+gastrulation.">Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation.</a> Developmental cell. 16, 744-755 (2009).</li><li>Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindling+fluorescent+proteins+for+precise+in+vivo+photolabeling.">Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling.</a> Nature. 21, 191-194 (2003).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).</li><li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos.">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model.">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li><li>Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gridlock+signalling+pathway+fashions+the+first+embryonic+artery.">Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery.</a> Nature. 414, 216-220 (2001).</li><li>Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+progenitor+for+haematopoietic+and+endothelial+lineages+in+the+zebrafish+gastrula.">A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula.</a> Nature. 443, 337-339 (2006).</li><li>Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Labeling+of+Zebrafish+Cells+with+Laser+Uncagable+Fluorescein+Dextran.">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran.</a> J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).</li><li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , (2003).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+and+gene+expression.">Analysis of protein and gene expression.</a> Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وتصف هذه الورقة طريقة تنوعا لواحدة خلية تعيين مصير استنادا إلى تنشيط ضوئي من قفص فلوريسئين-ديكستران. Uncaging من قفص فلوريسئين-ديكستران في الخلايا واحدة ويتحقق باستخدام اثنين من الفوتون امتصاص من الفيمتو ثانية ماي الليزر تاي بالإضافة إلى المجهر LSM زايس META 510 مبائر. Uncaged فلوريسئين-ديكستران في الخلايا photoactivated هو تصور بسرعة باستخدام إجراء المناعية بسيطة. في هذا البروتوكول الطول الموجي امتصاص ثنائي الفوتون لتنشيط ضوئي من قفص فلوريسئين-ديكستران هو 740 نانومتر. تم تحديد تجريبيا هذا الطول الموجي من photoactivating قفص فلوريسئين-ديكستران الأجنة wildtype حقن. وقد تباينت الطول الموجي الإثارة الليزر 600 حتي 800 نانومتر، وكان مصمما نوعيا وجود أو عدم وجود مضان فلوريسئين تفعيل بعد. وجدنا أن 740 نانومتر ينتج إشارة فلوريسئين تفعيل أقوى التالية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن 740 نانومتر العمل للجميعنظم نموذجية، ومع ذلك، فإننا ننصح اختبار مجموعة من موجات لتحديد الأمثل الطول الموجي الإثارة ثنائي الفوتون لعينتك. في قفص حقن فلوريسئين-ديكستران الأجنة wildtype، لكل طول موجي الإثارة ثنائي الفوتون نحن اختبار تفاوتت أيضا قوة الليزر المتوسط. لطول موجة الإثارة من 740 نانومتر، وهي قوة الليزر المتوسط ​​من 47 تنتج ميغاواط إشارة أقوى فلوريسئين في المنطقة المنشط بالمقارنة مع خفض القوى الليزر المتوسط. لم العالي القوى الليزر العادي لا ينتج إشارات أقوى فلوريسئين، ولكن الاجتثاث الناجم عن الأنسجة. منذ نبضات الليزر الفيمتو ثانية هي فعالة في الأنسجة البيولوجية ablating 15، نوصي تحديد الليزر متوسط ​​طاقة عتبة تنشيط ضوئي أن يتجنب الاجتثاث الأنسجة. ثنائي الفوتون امتصاص يحدث خلال حجم التفاعل الصغيرة. لضمان تفعيل السليم للقفص فلوريسئين-ديكستران، يجب أن توضع الخلية في الخشوع. في اله فوق البروتوكول، وتصويرها في وقت واحد الخلايا GFP إيجابية تحت الضوء الأبيض لتأكيد التركيز الخلية. لذلك، بيضاء اكتساب ضوء بالإضافة إلى قنوات أخرى من المستحسن. بعد التأكد من تركيز الخلية، بروتوكول لدينا تشير إلى تعظيم خلية المنشط. ويقترح وهناك عامل التكبير من 50 إلى 70، ولكن هذه القيمة يعتمد على حجم الخلية المختارة. زيادة التكبير يعزل الخلية المنشط من الخلايا المجاورة، ويحد منطقة المسح الضوئي لمدة الفوتون التنشيط. من الناحية المثالية، ينبغي أن منطقة المسح الضوئي تغطي مساحة واسعة من الخلية. الكشف عن واحدة الخلايا تفعيلها يتطلب أن تلطيخ الخلفية يكون ضئيلا للغاية. في بروتوكول مناعي أعلاه فإنه من المهم أن يتم حظر العينة في حجب العازلة لمدة 5 إلى 6 ساعات (الخطوة 4.13). عند وضع مع NBT / BCIP، ينبغي uncaged فلوريسئين-ديكستران تصبح مرئية خلال 10 إلى 20 دقيقة. إذا تلطيخ خلفية قوية، نقترح يغسل يعد حظر الوقت وإضافية لإزالة مكافحةالجسم (الخطوة 4.17). الأرقام 1 و 2 تقديم نتائج ممثل تنشيط ضوئي ومناعي. في الشكل 1، 1 في وقت مبكر - تم حقن ل2-الخلية الأجنة wildtype المسرح مع قفص فلوريسئين-ديكستران. وأثيرت الأجنة لsomitogenesis المتوسطة والتي تقام في الاغاروز انصهار منخفضة في الاتجاه الجانبي. الشكل 1 (أ، ب) تصور brightfield والصور الفلورسنت من الجنين قبل تنشيط ضوئي. ويتجلى دليل على أن الجنين لا يزال uncaged بسبب عدم وجود مضان فلوريسئين في الشكل 1 (ب). تم تفعيل منطقة صغيرة داخل الجسيدة مع طول موجة من 740 نانومتر لمدة 31 ثانية باستخدام قوة الليزر المتوسط ​​من 47 ميغاواط، الشكل 1 (ج؛ السهم). حدث بعد تفعيل، واثنين من الفوتون uncaging من فلوريسئين-ديكستران كما يتضح من مضان من منطقة تفعيلها، الشكل 1 (د؛ السهم). لم تكن مصحوبة التنشيط من خلال التذرية الليزر، حيث أن الأنسجة somitic ظلت على حالها، الشكل 1 (ج). الشكل 2 يوضح مناعي من فلور uncaged<html> escein-ديكستران. وphotoactivated منطقة صغيرة في الأديم المتوسط ​​وحة الجانبية للجنين المرحلة 10-الجسيدة باستخدام المعلمات ليزر نفس المذكورة في الشكل 1. تم رفع الجنين ومعالجتها باستخدام الخطوات 4،1 من خلال 4،20. السهم في يقع 2 الشكل المنطقة تفعيلها، كما يدل على ذلك تراكم راسب أزرق. تم الكشف بوضوح فقط موقع المنشط دون التدخل تلطيخ الخلفية. إعداد الحلول: 1 X PBT (1 L) 100 مل 10 X PBS 2 غرام BSA 10 مل توين 20٪ 10 X PBS (1 L) 80 جم كلوريد الصوديوم 2 غرام بوكل 6،1 ز نا 2 HPO 4 1،9 ز KH 2 PO 4 DDH 2 O إلى 1 L الرقم الهيدروجيني إلى 7.3 4٪ لامتصاص العرق (160 مل) 32٪ لامتصاص العرق (كل منهما 10 قارورة مل) 8 مل 20 X PBS 132 مل DDH 2 O jove_content &quot;&gt; AP العازلة (50 مل) 1 مل 5 M كلوريد الصوديوم 2.5 مل 1 M MgCl 2 5 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9،5 250 ميكرولتر توين 20٪ 41،25 مل DDH 2 O حل الأجسام المضادة (لمدة 1 العينة) 5،5 مسحوق الأسيتون ميكرولتر 40 PBT ميكرولتر 0،8 LS ميكرولتر 0.1 ميكروليتر مكافحة فلوريسئين-AP الأجسام المضادة 2٪ LS (360 ميكرولتر لمدة 1 العينة) 7،2 ميكرولتر LS 100٪ 352،8 PBT ميكرولتر 1 X Danieau وسائل الإعلام (1 L) ‡ 11،6 5 مل M كلوريد الصوديوم 700 ميكرولتر 1 M بوكل 400 ميكرولتر 1 M MgSO 4 600 ميكرولتر 1 M كا (NO 3) 2 5 مل 1 HEPES M DDH 2 O إلى 1 L درجة الحموضة ضبط إلى 7.6 ‡ Danieau هو الحل الملح مثالية لتربية الأجنة الزرد dechorionated. شريطة أن يمكن استخدام وسائل الإعلام الأخرى، والحلول متساوي التوتر مع بروperly الأسمولية (~ 300 الميلي أسمول لالزرد) NBT الأسهم (1 مل) 50 ملغ نيترو الأزرق تترازوليوم 0،7 مل أنهيدريد الفورماميد ثنائي ميثيل 0.3 مل DDH 2 O BCIP الأسهم (1 مل) 50 ملغ 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl الفوسفات 1 مل أنهيدريد الفورماميد ثنائي ميثيل NBT / BCIP حل النامية 1 مل AP العازلة 4،5 الأسهم NBT ميكرولتر 3،5 الأسهم BCIP ميكرولتر الأسيتون مسحوق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد 20 سمكة الكبار وتجميدها في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن الأسماك المجمدة مع بمدافع الهاون والمدقه إلى مسحوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مسحوق الأسماك في أنبوب 50 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الأنبوب المخروطية مع الأسيتون 100٪. دوامة الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الأنبوب في دورة في الدقيقة كحد أقصى لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه آخر 3 مرات في الأسيتون 100٪ وتدور الأنبوب في دورة في الدقيقة كحد أقصى لمدة 10 دقيقة. Bيجب Y غسل مشاركة طاف تظهر واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 الأسيتون٪ إلى بيليه مرة أخرى، والسماح للأنبوب تصل إلى درجة حرارة الغرفة. فإن جزيئات أكثر كثافة تسوية، في حين أن الجسيمات الدقيقة ستبقى في التعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب على الجسيمات الدقيقة في أنبوب جديد. قسامة الحل مسحوق في أنابيب منفصلة وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li></ol>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> كتالوج رقم </th></tr><tr><td> CMNB-قفص فلوريسئين SE </td><td> إينفيتروجن </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 كيلو دالتون Aminodextran </td><td> إينفيتروجن </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> زيبا العمود Desalt سبين </td><td> خرق </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> انخفاض ذوبان الاغاروز </td><td> Amresco </td><td> 0815-100G </td></tr><tr><td> بورات الصوديوم </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100G </td></tr><tr><td> Tricaine Methylsulfonate / MS222 </td><td> البحث العضوية </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> مكافحة فلوريسئين-AP </td><td> روش </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> حجب العازلة </td><td> روش العلوم التطبيقية </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> المالئيك حمض </td><td> سيجما </td><td> MO375-500G </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> إلكترونياتحول علوم المجهر </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> NBT </td><td> سيجما </td><td> I8377-250mg </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> فيشر العلمية </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Microinjector </td><td> هارفارد جهاز </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> LabTek حجرات ساترة الشرائح </td><td> Nalge نونك الدولية </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> بروتين K </td><td> إينفيتروجن </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> الحمل المصل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META NLO </td><td> زايس </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0،8 NA الهواء لامزيغ الهدف </td><td> زايس </td><td></td></tr><tr><td> الأصفر مرشح شفافة </td><td> مسرح البيت وشركة </td><td> Roscolux لون ورقة فلتر: 312 </td></tr></tbody></table>

single cell fate mapping in zebrafish

القدرة لتسمية تفاضلي الخلايا واحدة لديه آثار هامة في علم الأحياء التنموية. على سبيل المثال، تحديد كيفية المكونة للدم، الأنساب سفينة اللمفاوي، والدم تنشأ في النامية الأجنة يتطلب رسم الخرائط مصير وسلالته البحث عن المفقودين من الخلايا السلائف غير متمايزة. في الآونة الأخيرة، والبروتينات photoactivatable والتي تشمل: لقد تلقت إيوس 1، 2، PAmCherry 3، Kaede الذي 4-7، pKindling 8، وKikGR 9 و 10 الفائدة واسعة كما تحقيقات الخلية البحث عن المفقودين. يمكن أن تتحقق الطيف مضان من هذه البروتينات للضوء تحويلها بسهولة مع الإثارة UV، مما يسمح للإلى يمكن تمييزها يبلغ عدد سكانها من الخلايا من تلك التي المتاخمة لها. ومع ذلك، يجوز للphotoefficiency من البروتين المفعلين يمكنهم تحد من طويلة الأجل الخلية تتبع 11. كبديل للالبروتينات photoactivatable، في قفص وقد تم فلوريسئين-ديكستران المستخدمة على نطاق واسع في نظم نموذجية لالجنين 7، 12-14. تقليديا، إلى uncage فلوريسئين-ديكستران، UV كسكيتوقد استخدم أوجه من منزل مصباح مضان أو أ UV الفوتون ليزر واحدة؛ ومع ذلك، مصادر مثل هذه تحد من القرار المكاني للتنشيط ضوئي. هنا ونحن يقدم تقريرا على بروتوكول إلى خريطة مصير، التتبع سلالته، وكشف عن واحدة الخلايا المسمى. يتم photoactivated الخلايا واحد في الأجنة حقن مع في قفص فلوريسئين-ديكستران مع البقول ليزر بالقرب من-الأشعة تحت الحمراء المنتجة من أ الفيمتو ثانية التيتانيوم ليزر الياقوت. هذا الليزر هو العرفي في جميع المجاهر اثنين من الفوتون مبائر مثل المجهر 510 LSM NLO META المستخدمة في هذا الورق. منذ الأنسجة البيولوجية يكون شفافا بالنسبة بالقرب من-الأشعة تحت الحمراء التشعيع 15 يمكن أن، أن يركز عليها البقول ليزر عميقة داخل الجنين دون uncaging الخلايا أعلاه، أو أدناه الطائرة التنسيق المحددة. ولذلك، يتم التي يسببها غير الخطية اثنين من الفوتون امتصاص فقط عند بؤرة هندسية إلى uncage فلوريسئين-ديكستران في خلية واحدة. للكشف عن والخلية التي تحتوي uncaged فلوريسئين-ديكستران، ونحن تصف على بروتوكول الكيمياء الهيستولوجية المناعية بسيطة 16 إلى visua بسرعةليز الخلية المنشط. للبروتوكول التنشيط وكشف عن المعروضة في هذا الورقة هو متعددة الاستعمالات ويمكن تطبيقها على أي نظام نموذج. ملاحظة ما يلي: ويمكن الاطلاع على الكواشف المستخدمة في هذا بروتوكول في بموجب الجدول المرافق في نهاية من هذه المادة.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Fate Mapping in Zebrafish at JoVE.com

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

ووصف طريقة لphotoactivate الخلايا واحدة تحتوي على البروتين في قفص الفلورسنت باستخدام اثنين من الفوتون امتصاص من تي: الياقوت مذبذب يزر الفيمتو ثانية. إلى خريطة مصير الخلية photoactivated، يتم استخدام المناعية. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى أي نوع من الخلايا.

واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. ووصف طريقة لphotoactivate الخلايا واحدة تحتوي على البروتين في قفص الفلورسنت باستخدام اثنين من الفوتون امتصاص من تي: الياقوت مذبذب يزر الفيمتو ثانية. إلى خريطة مصير الخلية photoactivated، يتم استخدام المناعية. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى أي نوع من الخلايا.

Video: Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

جيل من تفرقوا Presomitic الأديم المتوسط ​​الثقافات خلية التصوير من اسماك الزرد الإنقسام على مدار الساعة في خلايا واحدة

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

تحديد MyoD Interactome عن طريق جنبا الى جنب الانجذاب تنقية جانب لقياس الطيف الكتلي

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...