1. الفحص العلمي الحرارية qPCR سولاريس تصميم الخوارزميات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخوارزمية المستخدمة في تصميم المسبار أزواج سولاريس / التمهيدي qPCR يضبط تيم كل مكون وبالتالي تمكين الدراجات ظروف عالمية. إدماج MGB ، أو ثانوية ملزمة الأخدود ، شاردة في التحقيق يزيد من تيم ويسمح للأقصر تحقيقات لتكون مصممة لمرونة أكبر وأداء الفحص. كما يوحي الاسم ، MGBs هي فئة من المضادات الحيوية التي يمكن أن تندرج في أخدود صغير من الحمض النووي الحلزون. وترد MGBs إلى نهاية 3 أو 5 من مسبار الحمض النووي. في الحل ، وتطفئ مضان مراسل FAM لجنة التحقيق التي فاكهه تقضي الكسوف المظلمة. عند التحقيق يربط تسلسل الهدف ، مما أدى إلى تغيير التشكل 3 - D التحقيق ق يسمح إشارة قوية الفلورسنت. واستقرت الملزمة لتحقيق الهدف تسلسل الحمض النووي لمن MGB ، والذي يسمح باستخدام المجسات ومحددة للغاية أقصر مع الحفاظ على درجة حرارة مناسبة للذوبان PCR. وهكذا ، كشف إشارة يحدث خلال مرحلة الصلب من التضخيم الهدف. خلال خطوة التمديد ، التحقيق MGB ينأى وتطفئ مرة أخرى مضان. لأن ينأى التحقيق ، فإنه لا يؤثر على كفاءة PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميزة أخرى من الخوارزمية سولاريس هو استخدام Superbases. يتم تعديل Superbases القواعد التي عززت قدرات ملزمة لتحسين الاستقرار والقضاء على السندات AT GG الذاتي الجمعيات في متواليات الغنية جوانين. وعلاوة على ذلك ، فإنها لا يشفي fluorophores المتاخمة المرفقة في نهاية 5. يتم وضع هذه القواعد بشكل انتقائي ، وفقا لخوارزمية ، لتوسيع نطاق توافر سلاسل الهدف. وهذا يجعل من الممكن استخدام متواليات ، مثل المناطق GC الغنية ، التي لولاها يمكن تجنبها في تصميم أجهزة الاشعال وتحقيقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كلما كان ذلك ممكنا ، الخوارزمية سولاريس يضم مناطق تقاطع اكسون الممتدة في الموقع المستهدف. هذا يزيد من خصوصية من خلال تجنب التضخيم من الحمض النووي الجينومي الملوثات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأهم من ذلك ، الخوارزمية يحدد أيضا سلسلة الآراء لجميع المتغيرات لصق المعروفة ، بحيث يتم تغطية كل واحدة من قبل المسبار / مجموعة التمهيدي. لذا ، لا بد من فحص واحد فقط لجينة معينة من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا ، فإن الفحص qPCR سولاريس تصميم خوارزمية تستخدم المعلمات صارمة للغاية لاعتبارات التصميم الحرجة بما في ذلك المحتوى GC ، وطولها ، TM ، وتمتد من النيوكليوتيدات متجانسة. تسلسل الناتجة BLAST تحليلها لخصوصية استخدام 3 قواعد بيانات مختلفة : الجينومية ، نص ، وجين كاذب. </li></ol> 2. الحصول على الكواشف سولاريس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على سولاريس الكواشف المناسبة ، يمكنك زيارة <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / سولاريس</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الموقع انقر على &quot;البحث عن منتج GENEius&quot;. للذهاب مباشرة إلى البحث GENEius المنتج ، انتقل إلى <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر في مربع البحث والتحري في اختيار الكائن المستهدف المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يمكن للبحث العديد من المنتجات GENEius عملية معرفات الجينات المختلفة. هنا ، تدخل أحد مصطلحات البحث للعثور على واقترح الجينات في المصالح ، بما في ذلك المرجع تسلسل الانضمام ، معرف الجينات ، والرمز الجيني ، ووصف جين ، معرف أو رقم سانجر الانضمام ، أو رقم الكتالوج. ثم انقر على &quot;بحث&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على الجينات في المصالح والضغط على &quot;اختيار&quot; على الجانب الأيسر. وهذا فتح إطار يعرض مختلف المنتجات الحرارية العلمية المتاحة لهذا الجين من الفائدة. تحت عنوان &quot;المنتجات&quot; حدد &quot;الكشف qPCR&quot; الجدولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت عنوان &quot;سولاريس الفحص التعبير الجيني&quot; العنوان ، سترى أخرى مصممة بشكل أمثل سولاريس المسبار / الفحص التمهيدي. وهذا الاختبار غطاء واحد من كل المتغيرات لصق الجين المعروف الهدف الخاص بك. اختر الكمية المطلوبة. فهي متوفرة في 100 ، 400 ، 200 ، و 1000 X 25 التفاعلات ميكرولتر (إذا حددت مقايسة والتي هي من صنع النظام إلى أن حجم حزمة 100 لن تكون متاحة). بالنقر على &quot;أضف إلى السلة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، حدد المزيج المناسب للسيد cycler الحرارية التي سيتم استخدامها. لتحديد أي مزيج رئيسية ستعمل بشكل أفضل مع الجهاز المتاحة ، انقر على &quot;البحث عن سيد ميكس الذي يعمل بشكل أفضل مع Cycler PCR بك!&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على cycler qPCR التي سيتم استخدامها في القائمة لتحديد أي مزيج للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى البحث GENEius إطار المنتج ، واختيار المزيج المناسب الرئيسية. مزيج الرئيسي يأتي في 100 ، 400 ، 200 ، والأحجام رد فعل 1000. انقر على زر &quot;إضافة إلى السلة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا الإشارة الجينات اقترح ومستلزمات الصفحة اليسرى التوليف [كدنا] أن يؤمر لتحليل qRT - PCR كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصل qPCR الكواشف سولاريس ، وتخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. وينبغي أن تلقى الكواشف التالية : حل 20X تحتوي على اثنين الاشعال المقدمة في 800 نانومتر لكل منهما وتحقيق تقدم في جين معين 200 نانومتر ، sequمعلومات عن التحقيق سينعقد على حد سواء ، وأجهزة الاشعال ، وسولاريس التعبير الجيني qPCR ميكس ماجستير في تركيز 2X. سولاريس التعبير الجيني فحوصات qPCR مستقرة لمدة لا تقل عن 12 شهرا. تجنب تكرار تجميد الذوبان. </li></ol> 3. qPCR الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ مع بروتوكول qPCR [كدنا]. وينبغي استخراج الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام أسلوب عمود الدوران. وأوصت اللجنة العلمية الحرارية عدة فيرسو [كدنا] تجميع لعكس النسخ لتوليد [كدنا]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير للذوبان والتي qPCR الشعائل وتحقيقات ، ومزيج الرئيسي على الجليد. كما تكون في متناولهم PCR المياه الصف ومبهمة لوحات qPCR البيضاء ، التي يمكن أن تحسن من حساسية في الوقت الحقيقي PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج يحتوي على جميع المكونات الرئيسية لPCR الوقت الحقيقي بما في ذلك : 1) بوليميريز الحمض النووي الحرارية ابدأ ، وإصدار الساخنة بداية بوليميريز الحمض النووي Thermoprime. ويستخدم هذا النوع من البلمرة لمنع غير محددة خلال تضخيم رد الفعل إعداد ويتطلب تفعيل الخطوة في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 2) dNTPs في مزيج ماجستير سولاريس ، dTTP يستبدل dUTP لتعظيم الكفاءة التضخيم 3) رد فعل الملكية العازلة ، الأمثل للعمل مع المقايسات التمهيدي / سولاريس التحقيق. هذا رد فعل المخزن يحتوي على صبغة زرقاء لزيادة التباين بين الكاشف والبلاستيك. 4) ROX ، إذا كان الصك الخاص qPCR يتطلب ROX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن تحسنت الحلول ، من خلال مزيج عبها الأنبوب (لا الدوامة). تدور عليهم لمنع فقدان كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وإعداد 15 مل أنبوب فالكون العقيمة لإعداد مزيج رد فعل لهذا الجين من الفائدة ، زائد واحد لهذا الجين المرجعية ، وزيادة اعتمادا على عدد من العينات. اعداد كافية من هذا القبيل يمكن ان ثلاثة مكررات تكون مستعدة لكل عينة ، بما في ذلك السيطرة قالب رقم (NTC) ، وعينات من منحنى القياسية ، إذا كان سيتم استخدام الأسلوب منحنى القياسية للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشغيل كل عينة على طبق من ذهب 96 كذلك ، مزيج ما يلي : 5 ميكرولتر من مزيج سولاريس 2X ماجستير qPCR ، 0.5 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي / دقق سولاريس (20X) ، ومثل PCR المياه الصف أن حجم رد الفعل النهائي مرة واحدة يضاف [كدنا] سيكون 25 ميكرولتر. لكل عينة تعمل على 384 لوحة مزيج جيد ما يلي : 12.5 ميكرولتر من مزيج سولاريس 2X ماجستير qPCR ، 1.25 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي / دقق سولاريس (20X) ، ومثل PCR المياه الصف أن حجم رد الفعل النهائي مرة واحدة [كدنا] وسوف يتم إضافة يكون 10 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor متعددة القنوات ، ونقل المزيج الرئيسي إلى الآبار المناسب للوحة. والصبغة الزرقاء المدرجة في مزيج رئيسية تساعد في تتبع التقدم pipetting على لوحات بيضاء. ثم ، تضاف 1-5 قالب ميكرولتر [كدنا] (لوحة 96 أيضا) أو 1-2 ميكرولتر من قالب [كدنا] (لوحة 384 أيضا). ماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. وضع لوحة في جهاز للطرد المركزي وتدور باستمرار لإزالة أي فقاعات ، وهذه سوف تتداخل مع قراءات مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج cycler الحرارية : يجب تنشيط الانزيم مع 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (1 دورة). ثم 40 دورة من 95 درجة مئوية ، وتمسخ لمدة 15 ثانية ، والصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الصك qPCR. بدء تشغيل البرنامج. </li></ol> ممثل النتائج qPCR باستخدام سولاريس <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. فحوصات الكشف عن إعطاء سولاريس موثوقة حتى بتركيزات منخفضة جدا المدخلات ، والحكم على كفاءة والقيم PCR R2. تم تضخيمها عشرة أضعاف التخفيفات 10 من [كدنا] تسلسل الاصطناعية توليفها من amplicon RNA أو تسلسل الحمض النووي amplicon على صك 7900HT ABI باستخدام سولاريس التعبير الجيني للF2RL1 qPCR الفحص أو CDC20 ، على التوالي. تظهر منحنيات التضخيم سجل النطاق والمنحنيات القياسية مع أداء كل مقايسة بما في ذلك الكفاءة والقيمة R2 ، دينامية مجموعة من التخفيفات LOG10 10 ، والحد الأدنى من الكشف. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. فحوصات سولاريس تعطي نتائج متسقة حتى بين مختلف الباحثين والمختبرات. وtransfected siRNAs استهداف ALDOA وPPIB ، فضلا عن عدم استهداف التحكم (NTC) ، إلى خلايا هيلا في 100 نانومتر و 10 و 1 و 0.1 تركيزات النهائي. وكان حصاد الخلايا والحمض النووي الريبي مجموع عزل 48 ساعة بعد تلقي العلاج. تم تصنيعه باستخدام [كدنا] الحرارية العلمية كيت فيرسو التجميعي [كدنا]. تم تضخيمها وقسامة من [كدنا] في مختبرين منفصلين جغرافيا باستخدام سولاريس التعبير الجيني qPCR فحوصات للكشف عن ALDOA ، PPIB وGAPDH على LightCycler روش 480 (384 أيضا) منصة. تم احتساب ضربة قاضية باستخدام الأسلوب ΔΔCq (لتطبيع GAPDH إشارة الجينات والخلايا المعالجة NTC). وقد برهنت على نفس مستويات ضربة قاضية للأهداف الجينات سواء بين كل من الباحثين في كلا الموقعين.

كتاب هذه المقالة هي من موظفي العلمية الحرارية.

الحرارية العلمية سولاريس qPCR توفير فحوصات بسيطة ، وطريقة محسنة لأداء تحليل qPCR. باستخدام خوارزمية عالية الصرامة ، وإدماج التكنولوجيا وSuperbases MGB ، هذه المجموعات التمهيدي وتحقيق أقصى قدر من الدقة ومتانة التجارب qPCR. واحد وتعيين التحقيق التمهيدي تعترف جميع الصيغ المعروفة للصق الجين المعطى. الموقع المستهدف ، كلما كان ذلك ممكنا ، وتشمل المناطق الممتدة اكسون ، لضمان عدم تضخيم أن الحمض النووي الجيني. هذه الميزات تجعل من الممكن لتشغيل عينات عديدة في وقت واحد ، مما يقلل كثيرا من مقدار الوقت اللازم لإجراء التجارب المعقدة. منذ الرئيسي هو مزيج الأزرق ، فمن الممكن استخدام لوحات غير شفافة بيضاء ، والتي تحسن من الحساسية للqPCR ، دون أن تفقد مسار pipetting. اتخذت جميع معا ، ملامح تصميم الفحص qPCR سولاريس جعل هذا الاختبار qPCR رواية مقايسة بسيطة ، ولكنها عالية الأداء في آن معا محددة وقوية.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

الجينات qPCR سولاريس الفحص التعبير هو نوع من الرواية التمهيدي / المسبار مجموعة ، وتهدف إلى تبسيط عملية qPCR مع الحفاظ على حساسية ودقة الفحص. وهذه المجموعات التمهيدي / المسبار مصمم مسبقا على 98 ٪&gt; من الجينوم البشري والفأر والتحسينات ميزة كبيرة من التكنولوجيات المتاحة سابقا. وقد جاءت هذه التحسينات الممكنة بحكم رواية خوارزمية التصميم الذي وضعه خبراء المعلوماتية الحيوية الحرارية العلمية. وأدرجت العديد من المزايا المريحة في الفحص qPCR سولاريس لتبسيط عملية تنفيذ الكمية في الوقت الحقيقي PCR. أولا ، بروتوكول مماثل إلى البدائل استخداما ، لذلك فإن الأساليب المستخدمة خلال qPCR من المحتمل أن تكون مألوفة. الثاني ، هو مزيج الرئيسي الأزرق ، الأمر الذي يجعل تحديد ردود الفعل qPCR أسهل لتعقب. الثالثة ، والظروف الدراجات الحرارية هي نفسها بالنسبة للجميع المقايسات (الجينات) ، مما يجعل من الممكن لتشغيل كثير من العينات في وقت واحد والحد من احتمالات الخطأ. أخيرا ، تقدم لجنة التحقيق التمهيدي وتسلسل المعلومات ، وتبسيط عملية النشر. هنا ، ونحن لشرح كيفية الحصول على الكواشف المناسبة سولاريس البحث باستخدام ميزة المنتج GENEius العثور على موقع على شبكة الإنترنت بسهولة (www.thermo.com / سولاريس) وكيفية استخدام الكواشف سولاريس لأداء qPCR باستخدام أسلوب منحنى القياسية.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

فحوصات الجينات qPCR التعبير هي رواية سولاريس مصمم مسبقا qPCR التمهيدي / مسبار تركيبات المصممة لتبسيط عملية qPCR دون التضحية خصوصية ومتانة مقايسة.

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

49.6K Views.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Video: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

التنميط الجيني للعينات النباتية والحيوانية دون تنقية DNA قبل

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

كمي، في الوقت الحقيقي وتحليل قاعدة الختان في نشاط إصلاح Lysates خلية الاستفادة من الآفات محددة منارات الجزيئية

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...