ريتشارد دبليو برنجر وديفيد آش L. ، تطبيقات العلماء ، والمنتجات الحرارية NanoDrop العلمية ، للحصول على المساعدة الفنية والتصوير.

<html> 1. Microvolume الكمي الأحماض النووية باستخدام 2000c NanoDrop الطيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتبدأ ، وتنظيف الأسطح العلوية والسفلية البصري للنظام معمل microvolume الاحتفاظ العينة pipetting 2-3 ميكرولتر من المياه النظيفة منزوع الأيونات على سطح الدنيا البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق ذراع الرافعة ، وضمان أن رمى العليا يأتي في اتصال مع الماء منزوع الأيونات. رفع ذراع الرافعة وتمحو كل من السطوح البصرية مع نظيفة ، خالية من الوبر ، جافة محو المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتح البرنامج وحدد NanoDrop تطبيق الأحماض النووية. استخدام صغيرة الحجم ، pipettor معايرة لإجراء القياس بواسطة فارغة الاستغناء 1 ميكرولتر من عازلة على السطح السفلي البصرية. انخفاض ذراع الرافعة وحدد &quot;فارغة&quot; في تطبيق الأحماض النووية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد اكتمال قياس فارغة ونظيفة والسطوح البصرية على حد سواء مع نظيفة ، خالية من الوبر ، جافة محو المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر ثابتة ملائمة للعينة التي سيتم قياسها. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> نوع العينة </td><td> حدد الخيار </td><td> ثابت يستخدم لحساب التركيز </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA - 50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA - 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA - 40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> أليغو </td><td> عرف </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. النموذجية تركيز حمض النووي نطاقات مباشرة قياسات الامتصاصية A280 باستخدام NanoDrop microvolume معمل ، وكفيت التقليدية المستندة إلى معمل استخدامها مع كفيت microcell TrayCell ، وfluorospectrometer NanoDrop microvolume بالتزامن مع مقايسة PicoGreen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي على قاعدة التمثال انخفاض البصرية وإغلاق ذراع الرافعة. لأن القياس هو حجم مستقلة ، والعينة يحتاج فقط إلى سد الفجوة بين سطحين البصرية للقياس في هذا الشأن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;القياس&quot; في تطبيق البرمجيات. يقوم البرنامج تلقائيا بحساب تركيز حمض النووي ونقاء النسب. قياس العينة التالية ، استعراض الإخراج الطيفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقوم البرنامج تلقائيا بحساب تركيز حمض النووي ونقاء النسب. قياس العينة التالية ، واستعراض الصور الطيفية لتقييم جودة عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهناك عينة نموذجية من الحمض النووي لمحة مميزة جدا. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. سوف نموذجي عينة الحمض النووي لديك ملف مميزة جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصادر مشتركة من الملوثات المرتبطة محددة تقنيات عزل الحمض النووي تشمل استخراج الفينول / Trizol والعمود. في حالة استخراج الفينول / Trizol ، قد أشارت المتبقية التلوث بواسطة كاشف أطياف شاذة بين 220-240 نانومتر فضلا عن التحولات في المنطقة 260-280 نانومتر. على العكس ، قد الجوانيدين المتبقية من استخراج العمود تسهم في ذروة قرب 230 نانومتر ، وتحولا في الحوض الصغير من 230 نانومتر إلى حوالي 240 نانومتر. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 ، والتحولات في القمم وهبوطا من B و C العينات بالمقارنة مع عينة لتوضيح كيفية الملوثات يمكن أن تؤثر على أطياف عينات الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم جودة عينة من الدقة ، ينبغي تحليل 260/280 260/230 أو نسب في تركيبة مع الجودة الشاملة الطيفية. الأحماض النووية محض عادة نسبة العائد 260/280 من ~ 1.8 و 260/280 من نسبة 2.0 ~ ل DNA و RNA ، على التوالي. هذه النسبة تعتمد على درجة الحموضة والقوة الأيونية للالعازلة التي استخدمت لصنع نموذج فارغ والقياسات. والمحاليل الحمضية تحت تمثل النسبة التي 0،2-0،3 ، في حين أن الحل الأساسي والإفراط في تمثيل النسبة التي 0،2-0،3. قد تختلف اختلافا كبيرا نقاء النسب تشير إلى وجود الملوثات ، والفينول أو غيرها من البروتين التي تمتص بشدة عند أو بالقرب من 280 نانومتر. نسبة نقاوة 260/230 هو التدبير الثاني من النقاء الحمض النووي مع القيم عن &quot;نقية&quot; الحمض النووي عادة في نطاق 1،8-2،2. وقد نسب نقاء التي هي أقل بكثير من القيم المتوقعة تشير إلى استخدام أسلوب العزل قد تتطلب التحسين أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا أن تستخدم NanoDrop مطياف لقياس بروتينات باستخدام الامتصاصية المباشر أو عن طريق فحوصات بروتين اللونية. المناسبة لضمان تشكيل العمود واستنساخ ، وينصح 2 ميكرولتر العينات للحصول على عينات من البروتين. الرجوع إلى الفيديو إن الرب التالية : Microvolume تحديد تركيز البروتين استخدام الطيف NanoDrop <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">http://www.jove.com/index/Details.stp؟ID=1610</a> </li></ol>ق = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. عالية الحساسية Microvolume الكميات الأحماض النووية باستخدام NanoDrop 3300 Fluorospectrometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإثبات ذات حساسية عالية microvolume الكميات باستخدام الحمض النووي NanoDrop 3300 ، تم استخدام عدة PicoGreen مضان. لتبدأ ، يوازن معايير عدة ، وجميع عينات الحمض النووي إلى درجة حرارة الغرفة. عينات الفلورسنت خفيفة حساسة ويجب أن يوضع في العنبر أو أنابيب مغلفة الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1X يكفي TE العازلة للجميع المعايير والعينات المراد قياسها وكذلك من أجل حل PicoGreen العمل التي ستكون هناك حاجة. إعداد 1xTE العازلة التي قدمت تمييع 20X TE العازلة مع nuclease خالية من المياه في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. رد فعل يمكن أن أحجام تتراوح ما بين 200 ميكرولتر إلى أقل من 10 ماي. في هذا المثال ، سيتم إعداد 10 مجلدات رد فعل ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معايير dsDNA متسلسل المخفف في التركيز النهائي المطلوب في 2X nuclease خالية من قوارير أو أنابيب. نقل 5 ميكرولتر من كل من معايير dsDNA المخفف في الفرد المسمى nuclease خالية من العنبر أو احباط المغطاة الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 5 ميكرولتر من كل عينة من dsDNA الفائدة في العنبر nuclease خالية المسمى بشكل مناسب أو احباط المغطاة الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل PicoGreen العمل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نقل حجم مساو من الحل PicoGreen العمل على كل أنبوب تحتوي إما القياسية أو عينة من الفائدة (5 ميكرولتر في هذا المثال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع كميات متساوية من 1X TE العازلة وPicoGreen حل عمل للاعداد لسيطرة السلبية ، التي هي بمثابة حل المرجع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط محتويات كل أنبوب دقيق من قبل pipetting رد فعل لطيف واحتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ينبغي لجميع المعايير ومعايرتها العينات إلى نفس درجة الحرارة قبل القياس كما يتأثر بدرجة الحرارة إشارة مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد وتنفيذ صك القياسات ، وتنظيف الأسطح أولا السفلي والعلوي من العينة نظام الاستبقاء. الماصة 2-3 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات على السطح السفلي الضوئية ، ثم أغلق فتح ذراع الرافعة ، وصمة عار على الركائز العليا والسفلى مع نظيفة ، خالية من الوبر ، والمختبرات القضاء. ضمان الأسطح خالية من الوبر قبل المضي قدما كما يمكن أن يحمل مضان الوبر في وجود مصدر الإثارة ويمكن أن تتداخل مع القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح أداة البرمجيات ، حدد &quot;الأحماض النووية&quot; التطبيق ، وحدد &quot;PicoGreen - dsDNA&quot; الخيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى فارغة الصك ، إضافة 2 ميكرولتر من TE 1X إلى انخفاض رمى ، على مقربة من الذراع ، وحدد &quot;فارغة&quot; في الصك مجال البرمجيات. بمجرد اكتمال فارغة ، وصمة عار قبالة حل فارغة من كل السطوح من العينة نظام الاستبقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحل إشارة pipetting لطيف. نصائح الاحتفاظ به منخفضة ، ماصة 2 ميكرولتر على أقل رمى وإغلاق الذراع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;مرجع&quot; في نوع القياس ، وحدد الوحدات المطلوبة. انقر على &quot;التدبير&quot; لبدء دورة القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تكون دورة القياس اكتمال فتح الذراع وصمة عار تماما قبالة السطوح عينة نظام الاستبقاء. قياس ما يصل إلى خمسة مكررات الإشارة ، وذلك باستخدام قسامة جديدة لكل تكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر العملية لمعايير إضافية لبناء منحنى القياسية. ويمكن استخدام ما يصل الى سبعة المعايير. وقد صمم البرنامج لتخزين ما يصل إلى خمسة مكررات لكل معيار. وبلغ متوسط ​​مكررات من المعايير لإنشاء منحنى القياسية التي تتحدد تلقائيا تركيزات العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد اكتمال منحنى القياسية ، حدد &quot;عينات&quot; التبويب ، أدخل الرقم عينة منها المعلومات وقياس كل عينة مجهولة. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

ويعمل فيليب ديجاردان وكونكلين ديبرا المنتجات الحرارية التي NanoDrop العلمية ، وشركة التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

تستند بروتوكولات الكميات المعروضة هنا على أنظمة microvolume الأكثر قبولا على نطاق واسع. مثل هذه الأنظمة توفير بدائل عملية للحمض النووي المنهجية التقليدية الكميات ، التي تعتمد على كميات أكبر من العينات واستخدام أجهزة الاحتواء. NanoDrop microvolume توظف التكنولوجيا نظام الاحتفاظ العينة التي تعتمد على خصائص التوتر السطحي من العينة التي يجري قياسها على شكل عمود السائل. فمن الضروري أن العينة يجعل الاتصال مع قياس السطوح البصرية العلوي والسفلي لتشكيل العمود المناسب. إذا في أي نقطة من نتائج القياس يبدو غير صحيحة أو لا يمكن استنساخه ، فمن الأرجح نتيجة عدم التجانس أو عينة السائل كسر العمود. لا ينصح المنظفات ومواد التنظيف ايزوبروبيل لأنها قد uncondition السطوح قياس التمثال. ورمى دون شروط يحدث عندما تعرضت لما يثير الشبهة خصائص سطح مسعور من التمثال ، مما أدى إلى تسطيح للقطيرة عينة. ويمكن أن يؤدي إلى الركائز دون شروط كسر العمود السائل خلال القياس. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> ويتميز الشكل 3. السطح دون شروط من قبل تسطيح قطرات المياه. قد تكون مجددة السطوح رمى به Uncondtioned NanoDrop مجمع الركيزة تجديد (PR - 1 ، الحرارية العلمية منتجات NanoDrop). يتم تطبيق طبقة رقيقة من مجمع مساحته إلى السطوح رمى العلوي والسفلي ، سمح لتجف لمدة 30 ثانية ~ ، ثم يفرك قبالة باستخدام جافة ونظيفة وخالية من الوبر مختبر المسح. وتتميز حالة مجددة بنجاح بواسطة قطرات المياه الديكور حتى عندما يطبق إلى أسفل سطح التمثال. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. يتميز سطح مجددة من الديكور تتكون من قطرات الماء. نظم الكميات Microvolume الحد بشكل كبير من استهلاك العينة وزيادة كبيرة في نطاق التركيز عند مقارنة لأنظمة القياس الكمي أكثر تقليدية. على الرغم من أن الكميات microvolume أصبحت في كثير من الأحيان عبارة عن تقنية تمكن من الظروف التي تنطوي على محدودية كتلة الخلية مثل إبرة الخزعات وmicrodissection الليزر التقاط والكفاءة وسهولة استخدام هذه المنهجية قد جعل من بديل لقبول التقليدية على نطاق واسع الكميات حمض النووي حتى طرق عندما عينة وفيرة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-2000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 3300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-3300</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

ويجري باستمرار المقايسات الجزيئية البيولوجية المتقدمة التي تستخدم كميات صغيرة من المواد تدريجيا ، غالبا ما يحول دون استخدام الأدوات التقليدية المستندة كفيت عن الكميات الحمض النووي لتلك التي يمكن أن تؤدي الكميات microvolume. العينة microvolume NanoDrop نظام الاستبقاء (المنتجات الحرارية NanoDrop العلمية) من خلال الجمع بين وظائف تكنولوجيا الألياف البصرية ، والخصائص الطبيعية التوتر السطحي لالتقاط والاحتفاظ بها كميات ضئيلة من عينة مستقلة عن أجهزة الاحتواء التقليدية مثل cuvettes أو الشعيرات الدموية. وعلاوة على ذلك ، فإن النظام يعمل طول مسار أقصر ، مما يؤدي إلى طائفة واسعة من قياسات تركيز حمض النووي ، والقضاء اساسا على الحاجة إلى إجراء التخفيفات. تخفيض حجم العينة المطلوبة لتحليل الطيفي تسهل أيضا إدراج خطوات إضافية لمراقبة الجودة في جميع أنحاء سير العمل الجزيئية كثيرة ، وزيادة كفاءة ويؤدي في نهاية المطاف إلى مزيد من الثقة في النتائج النهائية. وقد برزت الحاجة إلى حساسية عالية من التحليل الشامل الفلورسنت محدودة أيضا مع التقدم التجريبية الاخيرة. باستخدام التكنولوجيا نفسها microvolume الاحتفاظ عينة ، قد يتم تنفيذ قياسات الفلورسنت مع 2 ميكرولتر من المواد ، مما يسمح الفلورسنت متطلبات حجم المقايسات خفضت بشكل ملحوظ. microreactions هذه ميكرولتر من 10 أو أقل من الممكن الآن استخدام fluorospectrometer microvolume مخصص. سيظهر اثنين microvolume الكميات الحمض النووي البروتوكولات التي تستخدم نظم متكاملة الاحتفاظ العينة كما بدائل عملية لبروتوكولات كفيت التقليدية القائمة. الأول ، هو وصف لطريقة مباشرة الامتصاصية A260 باستخدام معمل microvolume. اعقب ذلك عرض لطريقة مضان على أساس أنه يتيح تقليص حجم وتفاعلات مع مضان fluorospectrometer microvolume. هذه التقنيات الجديدة تمكن من تقييم تركيز الحمض النووي التي تتراوح بين 1 بيكوغرام / ميكرولتر إلى 15000 نانوغرام / ميكرولتر مع استهلاك الحد الأدنى من العينة.

Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

يوصف استخدام نظم microvolume NanoDrop كبدائل عملية وفعالة للحمض النووي التقليدية من خلال منهجية الكميات المظاهرة اثنين من بروتوكولات الكميات microvolume النووية الحمضية.

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2891"> &#x4E2D;&#x6587; </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2892"> Deutsch </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2893"> Fran&#231;ais </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2894"> Espa&ntilde;ol </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/Details.stp?ID=2895"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

200.7K Views.  Thermo Scientific NanoDrop Products.  中文 Deutsch Français 

Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

تعيين تركيز الأحماض النووية والبروتينات باستخدام الصغرى ، حجم الطيف نانو بيو المواصفات

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

كهرباء خالية من الحمض النووي متسلسل وعزل بروتين

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

تحليل وبناء هياكل الحمض النووي مع 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

مكملات غذائية من الأحماض الدهنية غير المشبعة في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

وصفها تسلسل معين من الأحماض النووية والبروتينات مع ميثيل والعامل المساعد النظائر

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...