1. El Thermo Scientific Solaris ensayo qPCR diseño de algoritmos <ol><li> El algoritmo utilizado en el diseño de Solaris qPCR sonda / primer pares se ajusta a la Tm de cada componente lo que permite condiciones universales ciclismo. Obligatoria la incorporación de la MGB, o surco menor, fracción en la investigación aumenta el Tm y permite una más corta que las sondas diseñadas para la flexibilidad y el rendimiento del ensayo mayor. Como su nombre indica, MGBs son una clase de antibióticos que pueden encajar en el surco menor de la hélice del ADN. MGBs se adjunta al final de 3 a 5 de una sonda de ADN. En la solución, la fluorescencia reportero FAM de la sonda se apaga por saciar la Eclipse oscuro. Cuando la sonda se une a una secuencia objetivo, el cambio resultante en 3-D la conformación de la sonda s permite que una señal fluorescente fuerte. La unión de la sonda de ADN de secuencia objetivo es estabilizado por el MGB, que permite el uso de muy específicas, las sondas más cortas, manteniendo la temperatura de fusión adecuado para PCR. Por lo tanto, la detección de la señal se produce durante la fase de recocido de amplificación de la diana. Durante la etapa de extensión, la sonda MGB se disocia y la fluorescencia se apaga de nuevo. Debido a que la sonda se disocia, no afecta la eficiencia de la PCR. </li><li> Otra característica del algoritmo de Solaris es el uso de superbases. Superbases se modifican las bases que han mejorado la capacidad de unión para mejorar la estabilidad de los bonos A y eliminar GG libre asociación en guanina secuencias ricas. Por otra parte, no apagar fluoróforos adyacentes conectados a la terminal 5. Estas bases son colocados de forma selectiva, de acuerdo con el algoritmo, para ampliar la disponibilidad de la secuencia blanco. Esto hace posible el uso de secuencias, como las regiones ricas en GC, que de otra forma se evitaría en el diseño de cebadores y sondas. </li><li> Siempre que sea posible, el algoritmo de Solaris incluye las regiones de unión exón de expansión en el sitio de destino. Esto aumenta la especificidad al evitar la amplificación de ADN genómico contaminante. </li><li> Es importante destacar que el algoritmo también identifica una secuencia consenso de todas las variantes de empalme conocidos, de tal manera que todos están cubiertos por una sola sonda / primer set. Por lo tanto, sólo un ensayo que se necesita para un determinado gen de interés. </li><li> Por último, el sistema operativo Solaris ensayo qPCR algoritmo de diseño utiliza parámetros muy estrictos para las consideraciones de diseño críticos, entre ellos el contenido de GC, la duración, Tm, y tramos de nucleótidos homogénea. Las secuencias resultantes se analizaron para BLAST especificidad con tres diferentes bases de datos: genómica, el expediente académico, y pseudogen. </li></ol> 2. La obtención de reactivos Solaris <ol><li> Para obtener los reactivos de Solaris, visite <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Una vez en el sitio web, haga clic en &quot;Búsqueda de Productos GENEius&quot;. Para ir directamente a la búsqueda de productos GENEius, vaya a <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Haga clic en la caja de consulta de búsqueda y elegir el organismo de destino apropiado. </li><li> La búsqueda de productos GENEius puede procesar muchos identificadores de genes diferentes. Aquí se pueden introducir uno de los términos de búsqueda sugeridos para encontrar el gen de interés, incluyendo Ref. Sec. de adhesión, la identificación de genes, el símbolo del gen, una descripción de genes, la identificación o el número de Sanger, o un número de catálogo. A continuación, haga clic en &quot;Buscar&quot;. </li><li> Identificar el gen de interés y haga clic en &quot;Seleccionar&quot; en el lado izquierdo. Esto abrirá una ventana que muestra los diferentes productos de Thermo Scientific para el gen de interés. En &quot;Productos&quot; seleccione la opción &quot;Detección de qPCR&quot; Tab. </li><li> En el marco del &quot;Ensayo de Solaris expresión génica&quot; la partida, podrás ver un óptimo diseño de la sonda Solaris / ensayo manual. Este ensayo un cubrirá todas las variantes conocidas de empalme de genes objetivo. Elija la cantidad deseada. Están disponibles en 100, 200, 400 y 1000 X 25 reacciones l (si el ensayo se identifica como hecho a la medida, el tamaño del paquete de 100 no estará disponible). Haga clic en &quot;Añadir al carro&quot;. </li><li> A continuación, seleccionar la combinación adecuada para dominar el termociclador que se utilizará. Para determinar qué mezcla maestra que funcionará mejor con la máquina disponible, haga clic en &quot;Find a Mix Master, que funciona mejor con su termociclador de PCR!&quot; </li><li> Buscar la cicladora qPCR que se utilizará en el menú para determinar cuál es la combinación de su uso. </li><li> Volver a la ventana de búsqueda GENEius producto, y seleccionar la combinación maestro adecuado. La mezcla maestra viene en 100, 200, 400 y 1000 tamaños de reacción. Haga clic en &quot;Añadir al carro&quot;. </li><li> Genes de referencia sugerido y los kits de verso cDNA síntesis también se puede pedir para una completa QRT-PCR análisis. </li><li> Cuando los reactivos Solaris qPCR llegar, almacenarlos a -20 ° C hasta que esté listo para su uso. Los siguientes reactivos deben ser recibidos: Una solución de 20X, con dos primers siempre a 800 nM cada uno y una sonda del gen específico establecido en 200 nm, secuenciadorescia de información tanto para la sonda y cebadores, y Solaris Gene qPCR Expresión Master Mix en una concentración de 2X. Solaris qPCR ensayos de expresión de genes son estables durante un mínimo de 12 meses. Evite congelar y descongelar repetidas. </li></ol> 3. qPCR configuración <ol><li> Comience el protocolo qPCR con cDNA. ARN total se extrajo utilizando un método spin columna. El Thermo Scientific kit Verso cDNA síntesis se recomienda para la transcripción inversa para generar ADNc. </li><li> Prepárese para qPCR por el deshielo de los cebadores, las sondas, y mezcla maestra sobre el hielo. También tener a mano agua grado PCR y qPCR opaco placas blancas, que pueden mejorar la sensibilidad de la PCR en tiempo real. </li><li> La mezcla maestra contiene todos los componentes para PCR en tiempo real, incluyendo: 1) la ADN polimerasa Thermo-Start, una versión de arranque en caliente de la ADN polimerasa Thermoprime. Este tipo de polimerasa se utiliza para evitar la amplificación no específica durante la reacción de instalar y requiere la activación de paso a 95 ° C 15 min. 2) en la mezcla de dNTPs Solaris Maestro, dTTP reemplaza dUTP para maximizar la eficiencia de amplificación 3) tampón de reacción de propiedad, optimizado para trabajar con Solaris cartilla / sonda de ensayos. Este tampón de reacción contiene un tinte azul para aumentar el contraste entre el reactivo y el plástico. 4) ROX, si su instrumento qPCR requiere ROX. </li><li> Una vez que las soluciones se han descongelado, mezcle agitando el tubo (no vortex). Girar hacia abajo para evitar la pérdida de reactivo. </li><li> Luego, prepare un tubo de 15 ml estériles Falcon para establecer la mezcla de reacción para el gen de interés, más uno para el gen de referencia, la ampliación en función del número de muestras. Prepare suficiente como para que tres réplicas se pueden preparar para cada muestra, incluyendo un control sin plantilla (NTC) y las muestras de la curva estándar, si el método de la curva estándar se utiliza para el análisis. </li><li> Para cada muestra se ejecutan en una placa y 96, mezclar los siguientes: 5 l de la mezcla de Solaris qPCR 2X Master, 0,5 l de la versión de Solaris Primer / sonda conjunto (20 veces), y el agua PCR grado tal que el volumen final de reacción, una vez el ADNc se agrega será de 25 mL. Para cada muestra se ejecutan en una placa de 384 y mezclar los siguientes: 12,5 l de la mezcla de Solaris qPCR 2X Master, 1,25 l de la versión de Solaris Primer / sonda conjunto (20 veces), y el agua como PCR grado que el volumen final de reacción, una vez que el cDNA se agrega será de 10 mL. </li><li> Utilizando una pipeta multicanal, la transferencia de la mezcla maestra a los pocillos correspondientes de la placa. El tinte azul incluido en la mezcla maestra ayudará en el progreso de pipeteo de seguimiento en las placas blancas. A continuación, agregue el 5.1 l plantilla de cDNA (de una placa y 96) o 2.1 L de cDNA plantilla (para una placa de 384 pocillos). Pipeta de arriba a abajo para mezclar. Colocar la placa en una centrífuga y centrifugar para eliminar las burbujas, ya que estos interfieren con las lecturas de fluorescencia. </li><li> Programa del termociclador: La enzima se debe activar con un 95 º C 15 minutos (1 ciclo). Luego 40 ciclos de 95 ° C, la desnaturalización de 15 segundos, y el recocido y extensión a 60 ° C durante 60 segundos. </li><li> Colocar la placa en el instrumento qPCR. Iniciar el programa. </li></ol> Representante qPCR resultados utilizando Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ensayos de Solaris dar una detección fiable incluso en concentraciones muy bajas de entrada, a juzgar por la eficiencia de la PCR y los valores de r2. Diez de 10 diluciones de cDNA sintetizado a partir de la secuencia sintética de amplificación del ARN o la secuencia de amplificación de ADN se amplificó en un instrumento ABI 7900HT con Solaris Gene qPCR ensayo de expresión de F2RL1 o Cdc20, respectivamente. Las curvas de amplificación escala logarítmica, y las curvas de calibración se muestran junto con el rendimiento de cada ensayo en particular la eficiencia, el valor de r2, el rango dinámico de 10 log10 diluciones y el límite inferior de detección. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Ensayos de Solaris dar resultados consistentes, incluso entre los diferentes investigadores y laboratorios. siRNAs dirigidos ALDOA y PPIB, así como un control no-objetivo (NTC), fueron transfectadas en células HeLa a 100 nm, 10, 1 y 0,1 la concentración final. Las células fueron cosechadas y el ARN total aislado 48 horas después del tratamiento. cDNA fue sintetizado utilizando Thermo Scientific Kit Verso cDNA Síntesis. Una alícuota del cDNA se amplificó en dos laboratorios separados geográficamente, utilizando Solaris qPCR ensayos de expresión genética para la detección de ALDOA, PPIB y GAPDH en un LightCycler de Roche 480 (de 384 pozos) de la plataforma. Caída se calculó utilizando el método ΔΔCq (normalizado a GAPDH genes de referencia y las células tratadas con NTC). Los mismos niveles de caída se manifestó en favor tanto de los objetivos de genes entre los dos investigadores en ambos sitios.

Los autores de este artículo son empleados de Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris ensayos qPCR un método sencillo, mejor para la realización de análisis qPCR. Utilizando un algoritmo de alto rigor, la incorporación de la tecnología y la MGB superbases, estos conjuntos de cebadores y sonda de maximizar la fidelidad y la solidez de los experimentos de qPCR. Un primer y sonda conjunto reconoce todas las variantes conocidas de empalme de un determinado gen. El sitio de destino, siempre que sea posible, incluye las regiones que abarca el exón, para asegurarse de que el ADN genómico no se amplifica. Estas características hacen posible el funcionamiento de numerosas muestras de forma simultánea, lo que reduce la cantidad de tiempo necesario para realizar experimentos complejos. Dado que la mezcla principal es azul, es posible el uso de placas de color blanco opaco, lo que mejora la sensibilidad de la PCR cuantitativa, sin perder de vista la pipeta. En conjunto, las características de diseño del ensayo qPCR Solaris hacen de este ensayo qPCR novela un ensayo simple, pero de alto rendimiento que es específica y sólida.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

El Solaris Gene qPCR ensayo de expresión es un nuevo tipo de juego de cebadores / sonda, diseñada para simplificar el proceso de qPCR mientras se mantiene la sensibilidad y la precisión de la prueba. Estos conjuntos de cebadores / sonda se pre-diseñados para&gt; 98% de los genomas humano y del ratón y mejoras de las características importantes de las tecnologías ya disponibles. Estas mejoras han sido posibles gracias a un algoritmo de diseño novedoso, desarrollado por expertos en bioinformática Thermo Scientific. Varias funciones convenientes han sido incorporados en el ensayo qPCR Solaris para agilizar el proceso de llevar a cabo cuantitativas PCR en tiempo real. En primer lugar, el protocolo es similar a otras alternativas comúnmente empleados, por lo que los métodos utilizados en qPCR es probable que esté familiarizado. En segundo lugar, la mezcla maestra es de color azul, lo que hace que la configuración de las reacciones qPCR más fácil de seguir. En tercer lugar, las condiciones de ciclos térmicos son los mismos para todos los ensayos (los genes), lo que permite ejecutar muchas muestras a la vez y reducir las posibilidades de error. Finalmente, la sonda y la información de la secuencia de los cebadores se proporcionan, lo que simplifica el proceso de publicación. En este sentido, se muestra cómo obtener la reactivos de Solaris con la función de búsqueda de productos GENEius encontrar en el sitio web de pedidos (www.thermo.com / solaris) y el uso de los reactivos para la realización de Solaris qPCR utilizando el método de la curva estándar.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

El Solaris qPCR ensayos de expresión génica son nuevas pre-diseñados qPCR primer / sonda combinaciones diseñadas para simplificar el proceso de qPCR sin sacrificar la especificidad y la robustez de la prueba.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

49.7K vistas.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Video: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

Buscando vías de controlador de adquirir resistencia a la terapia dirigida: sensibilidad restaurar por Gene Knock-down y generación Subclone resistente a los medicamentos

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management strategies that reduce the impact of the disease. Presently in many diagnostic laboratories, the polymerase chain reaction (PCR), particularly real-time PCR, is considered the most sensitive and accurate method for plant pathogen detection. However, laboratory-based PCRs typically require expensive laboratory equipment and skilled personnel. In this study, soil-borne pathogens of potato are used to demonstrate the potential for on-site molecular detection. This was achieved using a rapid and simple protocol comprising of magnetic bead-based nucleic acid extraction, portable real-time PCR (fluorogenic probe-based assay). The portable real-time PCR approach compared favorably with a laboratory-based system, detecting as few as 100 copies of DNA from Spongospora subterranea. The portable real-time PCR method developed here can serve as an alternative to laboratory-based approaches and a useful on-site tool for pathogen diagnosis.

Rapid and accurate detection of plant pathogens on-site, especially soil-borne pathogens, is crucial to prevent further inoculum production and proliferation of plant diseases in the field. The method developed here using a portable real-time PCR detection system enables on-site diagnosis under field conditions.

In situ detección Molecular de fitopatógenos transmitidos por el suelo mediante un sistema PCR en tiempo real Portable

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Medio ambiente

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medicina

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Inmunología e Infección

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biología

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR cuantitativa de bacteriófago T7 de Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análisis qPCRTag - Un alto rendimiento, Tiempo real ensayo PCR para Sc2.0 Genotipado

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Quantifying Environmental Microorganisms and Viruses Using qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona 
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR), also known as real-time PCR, is a widely-used molecular technique for enumerating microorganisms in the environment. Prior to this approach, quantifying microorganisms was limited largely to classical culture-based techniques. However, the culturing of microbes from environmental samples can be particularly challenging, and it is generally held that as few as 1 to 10% of the microorganisms present within environmental samples are detectable using these techniques. The advent of qPCR in environmental microbiology research has therefore advanced the field greatly by allowing for more accurate determination of concentrations of microorganisms such as disease-causing pathogens in environmental samples. However, an important limitation of qPCR as an applied microbiological technique is that living, viable populations cannot be differentiated from inactive or non-living populations.
This video demonstrates the use of qPCR to detect pepper mild mottle virus from an environmental water sample.

Cuantificación de microorganismos ambientales y virus utilizando qPCR

Source: Laboratories of Dr. Ian Pepper and Dr. Charles Gerba - The University of Arizona
Demonstrating Author: Bradley Schmitz
Quantitative polymerase ...