الدكتور برامود Nehete والسيدة Nehete بهارتي للدماء وعينات المكاك PBMC ؛ وأيد هذا العمل جزئيا من أموال منحة من المعاهد القومية للصحة رقم 46969 ، وأنتجت كل خلية ثقافة وسائل الإعلام من قبل وسائل الإعلام مختبر المركزي ، الذي تموله المعاهد الوطنية للصحة منح CA 16672.

ويمكن تقسيم الإجراءات لتحليلات مفصلة المظهرية والوظيفية من الكل فضلا عن مجموعات فرعية من الخلايا التائية الذاكرة إلى أربعة أجزاء هي : 1) إعداد وتحفيز الخلية مستضدي ، 2) بالمتر تلطيخ علامة ، 3) بين الخلايا تلطيخ خلوى و 4) التدفق الخلوي التحليلات. 1. إعداد وتنشيط الخلايا مستضدي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سواء طازجة معزولة فضلا عن الحفاظ على البرد استخدمت خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC) في هذا البروتوكول. وقد عزل من PBMC heparinized سيتراتي أو عينات الدم الوريدي من المكاك وهو قرد اسيوي بالترسيب التدرج الكثافة باستخدام Ficoll - Hypaque (Histopaquen - 1077 ، سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO). كانت مخزنة Aliquots من PBMC المجمدة في السفح 90 ٪ و 10 ٪ في DMSO النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعند استخدام البرد الحفاظ PBMC ، إزالة قنينة من PBMC المجمدة من النيتروجين السائل وتحسنت بسرعة في حمام الماء 37 C ، مختلطة بلطف ، وغسلها مع RPMI - 1640 (HyClone المختبرات ، لوغان ، UT) لإزالة التجمد والمتوسطة إعادة تعليق في وسائل الإعلام الكامل [CM ؛ RPMI - 1640 الملحق مع 10 ٪ للحرارة المعطل FCS (HyClone المختبرات) ، L - 2mm والجلوتامين (سيغما الدريخ) ، 100U/ml البنسلين / الستربتوميسين (Invitrogen) ، والمثقف في 6 -- كذلك لوحات زراعة الأنسجة ليلا 37 درجة مئوية في ترطيب الاجواء 5 ٪ CO 2. في صباح اليوم التالي ، تم تحديد عدد الخلايا قادرة على البقاء من خلال طريقة التريبان الأزرق الإقصاء وإعادة صبغ معلقة في CM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكان يعامل بطريقة مختلفة عن الخلايا غير محددة مقابل التحفيز مستضد محدد تليها تحليلات خلوى : (أ) للحصول على التحفيز غير محددة مع phorbol 12 - 13 - myristate خلات (PMA) وIonomycin (I) (سيغما الدريخ ، وسانت وكانت مطلية لويس ، MO) ، aliquots من الخلايا في حجم 0.1ml (1.0 × 10 6 خلية / جيد) في الآبار الفردية لل96 - جيدا لوحات زراعة الأنسجة دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، وفرانكلين البحيرة ، ونيو جيرسي). واستخدمت سلطة النقد الفلسطينية وIonomycin بتركيز نهائي 50ng/ml و500ng/ml ، على التوالي. الحجم النهائي لمجموع 96 - جيدا نسيج لوحة الثقافة 0.2ml/well : (ب) للحصول على تحفيز المستضد محددة ، كانت مطلية 1.0 × 10 6 خلايا في حجم 1.0 مل في الآبار الفردية من 24 لوحات جيدة زراعة الأنسجة دينار بحريني (العلوم البيولوجية وفرانكلين البحيرة ، نيوجيرسي) ، حيث كانت الآبار قبل المعالجة كما هو موضح سابقا مع التعديل 9. باختصار ، كانت مغلفة في زراعة الأنسجة 24 لوحات جيدة مع 2.5 ميكروغرام / مل / مفتش جيدا الماعز المضادة للماوس (H + L) (كيركيغارد وبيري مختبر ، غايثرسبيرغ ، MD) في حل تريس 50mM (PH 8.6) درجة مئوية لمدة 4 بين عشية وضحاها. أضيفت في 10 ميكروغرام / مل / يتبع بشكل جيد من قبل احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية ، وصباح اليوم التالي تم غسلها لوحات مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة وشارك في تنشيطية CD49d خريطة موقع ، استنساخ 9F10 (سان خوسيه ، كاليفورنيا العلوم البيولوجية دينار بحريني) بعد الحضانة ، وغسلها لوحات مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة في درجة حرارة الغرفة. تم إضافة مستضدات المصالح (بما في ذلك الكوكتيل ستة الببتيدات المغلف فيروس نقص المناعة البشرية 8 في التركيز النهائي لل10μg/ml كل الببتيد. أعدت بئرا إضافية مع الخلايا في CM بمفرده السيطرة السلبية ، والحجم النهائي لمجموع كل بئر من 24 ورفاه زراعة الأنسجة لوحة 1.0 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكانت الخلايا المستنبتة لمدة 6 ساعات إلى 37 درجة مئوية في ترطيب الاجواء 5 ٪ CO 2. وأضاف Brefeldin A (سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO) للثقافة في 10μg/ml للساعات 4.5 النهائي من التحفيز. في وقت لاحق ، تم نقل الخلايا إلى 5 أنابيب البولي بروبلين مل وغسلها بالماء البارد (4 درجات مئوية) العازلة غسل تدفق (PBS Dulbecco ل(DPBS ، كا 2 / 2 ملغ خالية ؛ التقنيات الحياتية ، روكفيل ، دكتوراه في الطب) مع 2 ٪ للحرارة المعطل FCS) ، ومعالجتها بعد ذلك لتلطيخ مع مختلف الأجسام المضادة المسماة مضان. </li></ol> 2. علامات سطح المناعي تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكانت ملطخة first الخلايا الحية مع حفز / قتلى يمكن حلها 1ul صبغة الفلورسنت ماء رد الفعل عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة ، وغسلها مرة واحدة مع تدفق العازلة غسل الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم ، ما يلي معاير مناسب مضان المسمى أضيفت الاجسام المضادة لخلايا : مكافحة CD3 PE - Cy7 (SP34 - 2) ، ومكافحة CD8 Alexa700 (RPA - T8) ، ومكافحة CD28 - PerCP cy5.5 (L293) ومعاداة CD95 APC (DX2) ومكافحة CD4 المحيط الهادئ (زرقاء OKT4) ، كل من العلوم البيولوجية دينار بحريني (فرانكلين البحيرة ، ونيو جيرسي) ، باستثناء CD4 الأزرق المحيط الهادئ (OKT4) من eBioscience (سان دييغو ، كاليفورنيا). وحضنت الخلايا لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تجربة كل من تعويض الضوابط ومضان ناقص واحد (FMO) الضوابط استخدمت 10،11. وقد استخدمت ضوابط لتحديد التعويض coeffecients امتداد كل فرد وصمة عار في الكشف عن الأخرى. لعناصر التعويض ، وكانت ملطخة مجموعة كاملة من الأنابيب التي تحتوي على تعليق من واحد من الخلية قرد مع الفلورسنت خريطة موقع مترافق بشكل فردي والبقع لون واحد. FMO هو مزيج متعدد الألوان تلطيخ الكواشف التي تحتوي على كافة ولكن واحدة من الفائدة ويستخدم لتحديد الحدود بين موجبالثانية بمضاعفة عدد السكان السلبية لصناعة السيارات في مضان مستوى والبيانات الموجودة في نموذج ملون بالكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم غسلها ثم الخلايا ملطخة الباردة تدفق العازلة يغسل ، والثابتة في تثبيت / permeabilization حل دينار بحريني (العلوم البيولوجية وسان خوسيه ، كاليفورنيا) عن 10 دقائق على الأقل (في هذه المرحلة ويمكن تخزين الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام) قبل أداء الخلايا تلطيخ خلوى. </li></ol> 3. جواني خلوى تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وجرفت المياه خلايا ثابتة مع تدفق العازلة يغسل ، وبيرم ثم / اغسل العازلة دينار بحريني (العلوم البيولوجية وسان خوسيه ، كاليفورنيا) وكان المضافة وفقا لتعليمات الصانع. لفترة وجيزة ، وحضنت الخلايا في 0.1ml من بيرم 1X / اغسل العازلة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحقا ، وحضنت الخلايا مع معاير مناسب FITC المسمى مكافحة الإنترفيرون γ (B27) والمؤسسة العامة ذات العلامات المضادة للIL - 2 (MQ1 - 17H12) لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تم غسل الخلايا اثنين من أكثر الأوقات مع حل permeabilization </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي ، كانت الخلايا إعادة معلقة في بارافورمالدهيد 1 ٪ في DPBS وتخضع للتحليل التدفق الخلوي في غضون 24 ساعة. </li></ol> 4. تحليل التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم الحصول على الخلايا الملون تدفق عداد الكريات الثاني LSR دينار بحريني (العلوم البيولوجية وسان خوسيه ، كاليفورنيا) أو سماوي ADP (داكو ، Carpinteria ، CA). وقد تم تحليل البيانات باستخدام FACS FlowJo البرمجيات (شجرة ستار ، آشلاند ، OR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرقم. 1 يبين مخطط تبوب تستخدم للتحليلات لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا T من حيوان ممثل. كانت الأولى عبر بوابات اللمفاويات مبعثر قدما (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) ، ومن ثم تم تحديد الخلايا الليمفاوية يعيش على أساس التعاون بين بلدان الجنوب والسكان ماء سلبية. ثم تم التعرف على الخلايا التائية التي تليها CD3 التعبير الكشف عن CD4 + CD8 - (خلايا CD4 + T) وCD4 - CD8 + (CD8 + الخلايا التائية) السكان داخل CD3 + T السكان الخلية. تميزوا كذلك CD4 + و CD8 + الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مختلفة على أساس CD28 والتعبير CD95 بأنه ساذج (تينيسي ، CD28 + CD95) ، والذاكرة المركزية (الطب الصينى التقليدى ، CD28 + CD95 +) والذاكرة المستجيب (تيم ، CD28 ، CD95 +) الخلايا كما ووصف في الأدبيات 5 ، 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرقم. 2 يوضح كيف تم تقييم مجموعات فرعية مختلفة من خلايا CD4 + و CD8 + الخلايا التائية للقدرة وظيفية من حيث الإنتاج خلوى (INF - γ و / أو IL - 2) ردا على التحفيز مع سلطة النقد الفلسطينية وionomycin (PMA + I). </li></ol> 5. ممثل FACS البيانات وقد تقرر تشكيل PBMC المكاك وهو قرد اسيوي في استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل. الشكل 1 يبين مخطط تبوب تستخدم للتحليلات لمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا T من حيوان ممثل. كانت الأولى عبر بوابات اللمفاويات مبعثر قدما (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) ، ومن ثم تم تحديد الخلايا الليمفاوية يعيش على أساس التعاون بين بلدان الجنوب والسكان ماء سلبية. ثم تم تحديد الخلايا T التي CD3 التعبير. CD4 + CD8 - (خلايا CD4 + T) وCD4 - CD8 + (CD8 + الخلايا التائية) السكان داخل CD3 + T وجرى أيضا تحديد عدد الخلايا. وكما هو مبين في الشكل 2 ، وتتميز كذلك CD4 + و CD8 + الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مختلفة على أساس CD28 والتعبير CD95 باسم (CD28 تينيسي ، + CD95) السذاجة ، والذاكرة المركزية (الطب الصينى التقليدى ، CD28 + CD95 +) والذاكرة المستجيب (تيم ، CD28 - CD95 +) الخلايا. الشكل 2A يظهر INF - γ وIL - 2 الإنتاج في CD4 unstimulated وحفزت PMA / ionomycin + الخلايا التائية ، وفرعية ، و 2B ويبين الشكل INF - γ وIL - 2 الإنتاج في الخلايا التائية unstimulated وسلطة النقد الفلسطينية / ionomycin حفز CD8 + ، ومجموعات فرعية لاحظ ملامح متميزة خلوى التحفيز التي تسببها في كل مجموعة فرعية. <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" /> الشكل 1. المحاصرة الاستراتيجية المستخدمة لتحليل تدفق cytometric تكوين PBMC في macqaues الريسوسي. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1. <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2atmb.jpg" alt="الشكل 2A" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2btmb.jpg" alt="الرقم 2B" border="0" /> الشكل 2. (A) سايتوكاين التعريف إنتاج CD4 + مجموع الخلايا التائية وفرعية (B) لمحة من إجمالي إنتاج السيتوكينات الخلايا التائية CD8 + ومجموعات فرعية. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2a.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من 2A ، <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2b.jpg">أو هنا</a> لنسخة أكبر من الرقم 2B.

<ol>
	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

الحل والمخازن <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll - Hypaque (Histopaquen - 1077 ، سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI - 1640 المتوسطة (HyClone المختبرات ، لوغان ، UT) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المصل البقري الجنين (FBS) ، (HyClone المختبرات ، لوغان ، UT) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L - الجلوتامين (سيغما الدريخ ؛ سانت لويس ، MO) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البنسلين / الستربتوميسين (Invitrogen ؛ كارلسباد ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التريبان الأزرق الكاشف (سيغما الدريخ ؛ سانت لويس ، MO) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 ملي تريس ، PH 8.6 ؛ تصفيتها وتخزينها في 4 درجات مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dulbecco في برنامج تلفزيوني (DPBS ، Ca2/Mg2-free ؛ الحياة التكنولوجيات ، روكفيل ، دكتوراه في الطب) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفق العازلة غسل : تكملة DPBS FBS مع 2 ٪ ، وتخزينها في 4 درجات مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دينار بحريني Cytofix / Cytoperm التثبيت / Permeabilization الحل كيت دينار بحريني (العلوم البيولوجية وسان خوسيه ، كاليفورنيا) </li></ul> التنشيط وكلاء <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phorbol 12 - 13 - myristate خلات (PMA) (سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ionomycin (سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Costimulatory خريطة موقع CD49d ، استنساخ 9F10 دينار بحريني (العلوم البيولوجية وسان خوسيه ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقارب المنقى F الضد (أ ب) 2 شظايا من الماعز المضادة للماوس مفتش (H + L) (كيركيغارد وبيري مختبر ، غايثرسبيرغ ، MD) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تنشيط عوامل محددة تشمل برك الببتيد ، الببتيد واحد ، أو البروتين الكامل </li></ul> مثبطات إفراز خلوى <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Brefedin A (لمنتدى بواو الاسيوى ، سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن استخدامها بدلا من غولجي التوصيل دينار بحريني (العلوم البيولوجية وسان خوسيه ، كاليفورنيا) </li></ul> الأضداد <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعيش / قتلى ماء قابل للتثبيت طقم الفلورسنت وصمة عار (Invitrogen ؛ كارلسباد ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD3 PE - Cy7 (SP34 - 2) ، (العلوم البيولوجية دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4 المحيط الهادئ (زرقاء OKT4) ، (eBiosciences (سان دييغو ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD8 Alexa700 (RPA - T8) ، (العلوم البيولوجية دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD28 - PerCP cy5.5 (L293) ، (العلوم البيولوجية دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD95 APC (DX2) ، (العلوم البيولوجية دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنترفيرون FITC (B27) ، (العلوم البيولوجية دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL - 2 PE (MQ1 - 17H12) ، (العلوم البيولوجية دينار بحريني ، سان خوسيه ، كاليفورنيا) </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

النموذج المكاك ريسوس حاليا أفضل نموذج المتاحة لمكافحة فيروس الإيدز فيما يتعلق بفهم المرضية فضلا عن تطوير لقاحات وعلاجات<sup&gt; 1،2،3</sup&gt;. هنا ، نحن تصف طريقة لتحليلات مفصلة المظهرية والوظيفية من الاستجابات المناعية الخلوية ، وتحديدا بين الخلايا إنتاج السيتوكينات من CD4 + و + CD8 خلايا تي ، فضلا عن مجموعات فرعية الذاكرة الفردية. حصلنا على دقة القياسات الكمية والنوعية لإنتاج الإنترفيرون جاما (INF) وانترلوكين (IL) -2 في كل CD4 + و CD8 + T خلايا من المكاك ريسوس PBMC حفز مع سلطة النقد الفلسطينية بالاضافة الى ionomycin (PMA + I). كانت ملامح خلوى مختلفة في مجموعات فرعية مختلفة من خلايا الذاكرة. وعلاوة على ذلك ، قدمت لنا هذا البروتوكول حساسية لإظهار الكسور ولو كانت بسيطة من المستضد CD4 + ومحددة CD8 + الخلايا التائية فرعية داخل عينات من المكاك وهو قرد اسيوي PBMC المحصنين مع لقاح مضاد لفيروس نقص المناعة البشرية المغلف كوكتيل الببتيد وضعت في مختبر لدينا. والتدفق الخلوي تقنية متعددة الألوان هي أداة قوية لتحديد بدقة مجموعات مختلفة من الخلايا T<sup&gt; 4،5</sup&gt; مع خلوى المنتجة للقدرة<sup&gt; 6</sup&gt; التالي التحفيز غير محددة أو محددة مستضد<sup&gt; 5،7</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

نحن لشرح فائدة التدفق الخلوي متعدد الألوان مفصلة عن توصيف المظهري والوظيفية من الكل فضلا عن مجموعات فرعية من الذاكرة CD4 + CD8 + وخلايا T في المكاك وهو قرد اسيوي ، والنموذج المثالي لإجراء دراسات لقاح فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز.

تحليلات متعددة الألوان من التدفق الخلوي الاستجابة المناعية الخلوية في المكاك وهو قرد اسيوي

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

multicolor-flow-cytometry-analyses-cellular-immune-response-rhesus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.0K Views.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. نحن لشرح فائدة التدفق الخلوي متعدد الألوان مفصلة عن توصيف المظهري والوظيفية من الكل فضلا عن مجموعات فرعية من الذاكرة CD4 + CD8 + وخلايا T في المكاك وهو قرد اسيوي ، والنموذج المثالي لإجراء دراسات لقاح فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز.

Video: Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

تحليل قردي نقص المناعة CD8 للفيروسات محددة<sup&gt; +</sup&gt; خلايا تي في القرد قرود المكاك التي كتبها الببتيد-MHC-I Tetramer تلطيخ

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

كوانتيتيشن خلية واحدة مرناً و "سطح التعبير البروتين" في خلايا CD4 المصابين "فيروس نقص المناعة القردي"+ "تي الخلايا المعزولة" من macaques ريسوس