普拉莫德Nehete博士和夫人Bharti公司Nehete猕猴血液和PBMC样品;部分支持这项工作是由美国国立卫生研究院授予的AI 46969资金，所有的细胞培养基，由中央媒体实验室，这是由美国国立卫生研究院授予CA资助16672。

总额以及记忆T细胞子集的表型和功能的详细分析的程序可分为四个部分：1）细胞的制备及抗原刺激，2）表面标志物染色，3）细胞内细胞因子染色和4）流式细胞仪分析。 1。细胞的制备及抗原刺激<ol><li>既新鲜分离以及冷冻保存外周血单个核细胞（PBMC）的，在此协议使用。肝素或枸橼酸恒河猴静脉血液样本中分离的外周血单核细胞密度梯度沉淀，使用聚蔗糖- Hypaque（Histopaquen - 1077，Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州）。存储在90％FCS的PBMC等分10％，在液氮冷冻和二甲基亚砜。 </li><li>使用冷冻保存外周血单个核细胞时，从液氮冷冻PBMC瓶在37℃水浴中迅速解冻，轻轻混合，用RPMI - 1640（Hyclone公司实验室，洛根，UT）洗去冻结中期和完整的媒体重新悬浮厘米; RPMI - 1640具有10％的补充热灭活FCS（Hyclone公司实验室），2mm的L -谷氨酰胺（Sigma - Aldrich公司），100U/ml青霉素/链霉素（Invitrogen公司），并于6培养 - 以及组织培养板在37℃过夜彗星在饱和湿度5％的CO 2气氛。第二天早晨，活细胞计数测定台盼蓝染料排斥法和重新悬浮在CM。 </li><li>细胞治疗非特异性与抗原特异性刺激因子分析其次是不同的：（一）非特异性刺激与佛波醇-12 - 肉豆蔻酯（PMA）和离子霉素（一）（Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，MO），分装在体积的0.1毫升细胞（1.0 × 10 6细胞/孔）接种在96孔组织培养板（BD公司），新泽西州富兰克林湖，个别井。 PMA和离子霉素，分别用于在终浓度为50ng/ml和500ng/ml。 96孔组织培养板的最终总量0.2ml/well：（B）抗原特异性刺激，1.0 × 10 6卷1.0毫升的细胞在24孔组织培养板中的个别井（BD公司镀，新泽西州富兰克林湖），井前视为与修改9。简言之，在24孔组织培养板涂有2.5微克/毫升/以及羊抗鼠IgG（H + L）（克尔凯郭尔和佩里实验室，马里兰州盖瑟斯堡）在50毫米的Tris溶液（PH值8.6），4 ° C过夜。第二天早上板块洗净，用无菌PBS和协同刺激单克隆抗体的表达CD49d，克隆9F10（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞）两次，分别加入10微克/毫升/以及随后一小时的孵化，在37 ° C。孵化后，用无菌PBS洗涤板在室温下的两倍。利益抗原（包括6个HIV包膜肽 8鸡尾酒添加的每个肽的终浓度为10μg/ml。附加井仅在CM细胞作为阴性对照准备最后的总体积为每孔24孔组织培养板为1.0 ml。 </li><li>细胞培养6小时，在37 ° C的饱和湿度5％的CO 2气氛。 Brefeldin一（Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州）在10μg/ml的文化，为最后的4.5小时的刺激。随后，细胞被转移到5毫升聚丙烯管洗净，用冷（4 °彗星）流洗缓冲液（贝科的PBS（，钙2 /镁2 -免费DPBS Life技术“，罗克维尔，医师）用2％热灭活FCS），然后与不同的荧光标记抗体染色处理。 </li></ol> 2。免疫表面标志物的染色<ol><li> 1ul活/死可以解决旱厕荧光活性染料染色刺激细胞在4 ° C的黑暗30分钟，洗后用冷水流缓冲液洗一次。 </li><li>然后，下面的适当滴定，荧光标记的单克隆抗体细胞：抗CD3 PE - Cy7（SP34 - 2），抗- CD8 Alexa700（RPA - T8），抗CD28 PerCP cy5.5（L293）抗CD95的APC（DX2）和抗CD4太平洋蓝（OKT4），所有自BD Biosciences公司（新泽西州富兰克林湖，），除CD4 +，太平洋蓝（OKT4）从eBioscience公司（加利福尼亚州圣迭戈）。细胞孵育30分钟，在4 ° C，在黑暗中。 </li><li>对于每个实验10,11利用补偿控制和荧光减一（FMO）的控制。利用补偿控制，以确定每一个人的染色到其他探测器的外溢coeffecients。补偿控制，一套完整的含有猴细胞悬浮液管与荧光标记的单克隆抗体染色，单独作为单一颜色的污渍。鱼类统营处是一个多色染色的组合，包含所有的试剂，而是一个利益，是用来确定之间的边界通过复制自体荧光的水平和数据的正面和负面的人口目前在完全染色的样本。 </li><li>染色的细胞，然后用冷水流缓冲液洗的洗，和固定在固定/通透的解决方案（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞）（在这个阶段的细胞，可存储在一夜之间在4 ° C黑暗环境中至少10分钟）然后进行细胞内细胞因子染色。 </li></ol> 3。细胞内细胞因子染色<ol><li>固定与流动缓冲液洗洗涤细胞，然后烫/洗涤液（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞）是根据制造商的说明补充。简单地说，细胞培养1X烫/缓冲液洗为10分钟，在4 ° C黑暗环境中0.1毫升。 </li><li>随后，细胞培养与适当滴定的FITC标记的抗干扰素γ（B27）和PE标记的抗IL - 2为60分钟（MQ1 - 17H12）4 ° C黑暗环境中。 </li><li>那么细胞洗两次与通透的解决方案</li><li>最后一次洗涤后，将细胞重新悬浮在1％多聚甲醛在DPBS和24小时内遭受流式细胞仪分析。 </li></ol> 4。流式细胞仪分析<ol><li>染色的细胞获得一个LSR II流式细胞仪（BD公司，加利福尼亚州圣何塞）或青色ADP（DAKO，Carpinteria的CA）。通过使用FlowJo软件（树星，亚什兰，或），流式细胞仪数据分析。 </li><li>图。 1显示了具有代表性的动物，从不同的T细胞亚群的分析利用浇注计划。首先通过前向散射（FSC）与侧散射（SSC），门控的淋巴细胞，再活的淋巴细胞被确定基于SSC和水产人口负。 T细胞，然后验明正身由检测的CD4 + CD8 -（CD4 + T细胞），CD3 +表达和CD4 - CD8 +（CD8 + T细胞）的种群内的CD3 + T细胞的人口。的CD4 +和CD8 + T细胞被进一步区分到不同的子天真（TN，CD28 + CD95 -），中央内存（TCM，CD28 + CD95 +）和效应记忆体（TEM，CD28 - CD95 +）细胞为CD28和CD95表达的基础上在文学5日，10所述。 </li><li>图。 2如何CD4 +和CD8 + T细胞不同亚群细胞因子的产生，在刺激与PMA和离子霉素（PMA + I）（IFN -γ和/或IL - 2）功能的能力进行评估。 </li></ol> 5。代表流式细胞仪数据恒河猴外周血单个核细胞组成，使用流式细胞仪分析来确定。图1显示了门控计划为代表的动物从一个不同的T细胞亚群的分析利用。首先通过前向散射（FSC）与侧散射（SSC），门控的淋巴细胞，再活的淋巴细胞被确定基于SSC和水产人口负。 CD3 +表达的T细胞，然后确定。 CD4 + CD8 -（CD4 + T细胞）和CD4 - CD8 +（CD8 + T细胞）的种群内的CD3 + T细胞的人口也决心。图2所示的CD4 +和CD8 + T细胞进一步区分到不同的子集的CD28和CD95表达的幼稚（TN，CD28 + CD95 -），中央内存（TCM，CD28 + CD95 +）和效应记忆体（TEM的基础上， CD28 - CD95 +）细胞。图2A显示IFN -γ和IL - 2在未刺激和PMA /离子霉素刺激CD4 + T细胞及亚群，和图2B生产显示的INF -γ和IL - 2在未刺激和PMA /离子霉素刺激CD8 + T细胞的生产，和亚群注意：在每个子集，不同的细胞因子刺激引起的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig1tmb.jpg" alt="图1" border="0" /></a> 图1。浇注流流式细胞仪分析外周血单个核细胞组成的战略在恒河猴macqaues <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2a.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2atmb.jpg" alt="图2a" border="0" /></a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2b.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2btmb.jpg" alt="图2b" border="0" /></a> 图2。 （一）总的CD4 + T细胞亚群。细胞因子生产概况（二）总CD8 + T细胞及亚群细胞因子的生产概况。

<ol>
	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

解决方案和缓冲器<ul><li>聚蔗糖- Hypaque（Histopaquen - 1077，Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州） </li><li> RPMI - 1640培养基（Hyclone公司实验室，洛根，UT） </li><li>胎牛血清（FBS）（Hyclone公司实验室，洛根，UT） </li><li> L -谷氨酰胺（Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州） </li><li>青霉素/链霉素（Invitrogen公司;卡尔斯巴德，CA） </li><li>台盼蓝试剂（Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州） </li><li>的50 mM的Tris，PH值8.6，过滤和储存在4 ° C </li><li>贝科的PBS（DPBS，Ca2/Mg2-free; Life技术，马里兰州洛克维尔） </li><li>流洗涤缓冲液：含2％FBS DPBS补充，储存于4 ° C </li><li> BD Cytofix / Cytoperm固定/通透解决方案套件（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞） </li></ul>激活剂<ul><li>佛波醇-12 - 肉豆蔻13醋酸乙烯酯（PMA）（Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州） </li><li>离子霉素（Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州） </li><li>共刺激表达CD49d单克隆抗体，克隆9F10（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞） </li><li>亲和纯化抗体的F（ab）2片段的羊抗鼠IgG（H + L）（克尔凯郭尔和佩里实验室，马里兰州盖瑟斯堡） </li><li>特定的激活剂可以包括肽池，单肽，或整个蛋白质</li></ul>细胞因子的分泌抑制剂<ul><li> Brefedin一个（博鳌亚洲论坛，Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州） </li><li>高尔基的插头，可交替使用（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞） </li></ul>抗体<ul><li>活/死可以解决旱厕荧光染色试剂盒（Invitrogen公司;卡尔斯巴德，CA） </li><li> CD3 + PE - Cy7（SP34 - 2），（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞） </li><li> CD4太平洋蓝（OKT4），（eBiosciences（加利福尼亚州圣迭戈） </li><li> CD8 + Alexa700（RPA - T8），（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞） </li><li> CD28 PerCP cy5.5（L293），（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞） </li><li> CD95的APC（DX2），（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞） </li><li>干扰素- FITC（B27），（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞） </li><li> IL - 2的PE（MQ1 - 17H12），（BD Biosciences公司;加利福尼亚州圣何塞） </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

猕猴模型是目前最好的艾滋病毒和艾滋病的模型，了解其发病机制，以及疫苗和疗法的发展<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;。在这里，我们描述了一个详细的表型和功能分析的细胞免疫反应，特别是细胞内的CD4细胞因子生产+和CD8 + T细胞以及个人记忆亚群的方法。我们精确的定量和定性的措施，为生产干扰素γ（INF -γ）和白细胞介素（IL）-2获得的CD4 +和CD8 + T细胞从PMA加离子霉素（PMA + I）刺激的恒河猴PBMC的。细胞因子在记忆细胞不同亚群的不同。此外，该协议为我们提供的灵敏度，证明即使是轻微的组分抗原特异性CD4 +和CD8 + T细胞内的PBMC样本在我们的实验室开发的HIV包膜肽鸡尾酒疫苗免疫恒河猴的子集。多色流式细胞术是一种强大的工具，准确地识别不同人群的T细胞<sup&gt; 4,5</sup&gt;与细胞因子产生能力<sup&gt; 6</sup&gt;非特异性或抗原特异性刺激以下<sup&gt; 5,7</sup&gt;。

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

我们展示了总额以及记忆CD4 +和CD8 + T细胞在猕猴，艾滋病毒/艾滋病疫苗研究的理想模型的子集的详细的表型和功能特性的多色流式细胞仪的实用。

多色流流式细胞仪分析细胞在恒河猴的免疫应答

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

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Immunology and Infection

21.0K 次观看.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. 我们展示了总额以及记忆CD4 +和CD8 + T细胞在猕猴，艾滋病毒/艾滋病疫苗研究的理想模型的子集的详细的表型和功能特性的多色流式细胞仪的实用。