Dr Pramod Nehete makak kan ve PBMC örnekleri ve Bayan Bharti Nehete Bu çalışma kısmen, NIH hibe AI 46.969 fonları tarafından desteklenen ve tüm hücre kültür ortamı, Merkez Medya Laboratuvarı tarafından üretildi, NIH hibe CA tarafından finanse edilmektedir 16.672.

1) Hücre hazırlık ve antijenik stimülasyon, 2) Yüzey işaretleyici boyama, 3) Hücre içi sitokin boyama ve 4) Flow sitometri: toplam yanı sıra T hücrelerinin hafıza altkümelerini ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel analizler için prosedürler dört bölüme ayrılabilir. analiz eder. 1. Hücre hazırlık ve antijenik stimülasyon <ol><li> Her ikisi de taze olarak izole yanı sıra periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) cryo korunmuş bu protokolü kullanılmıştır. PBMC Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) kullanarak yoğunluk gradiyenti sedimantasyon Rhesus makak heparinize veya sitratlı venöz kan örneklerinden izole edildi. PBMC alikotları% 90 FCS saklandı ve sıvı azot içinde% 10 DMSO. </li><li> Cryo korunmuş PBMC kullanırken, dondurulmuş hücre şişeleri sıvı azot çıkarıldı ve hızla dondurma orta ve kaldırmak için RPMI-1640 (HyClone laboratuarlar, logan, UT) ile yıkanır, hafifçe karıştırılır, 37 C su banyosu içinde çözülmüş eksiksiz bir medya yeniden askıya [CM;% 10 ile RPMI-1640 ek ısı inaktive FCS (HyClone laboratuarlar), 2mm L-glutamin (Sigma-Aldrich), 100U/ml penisilin / streptomisin (Invitrogen) ve 6 kültür - iyi doku kültürü plakaları gecede 37 ° ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 atmosfer. Ertesi sabah, canlı hücre sayıları tripan mavi boya dışlama yöntemi ile tespit edildi ve CM yeniden askıya. </li><li> (A) phorbol 12-miristat ile non-spesifik uyarılması için hücrelerin sitokin analizleri takip karşı non-spesifik antijen-spesifik stimülasyon için farklı tedavi edildi: 13-asetat (PMA) ve Ionomycin (I) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 0.1ml bir birim hücreler aynı hacimde (1.0 x 10 6 hücre / kuyu), 96 iyi doku kültürü tabak (BD Biosciences Franklin, göl, NJ) bireysel kuyularda kaplama . PMA ve Ionomycin sırasıyla 50ng/ml ve 500ng/ml son bir konsantrasyonda kullanılmıştır. 96-iyi doku kültürü plaka için son toplam hacmi 0.2ml/well: (b), hacmi 1.0 ml antijen spesifik stimülasyon 1.0 x 10 6 hücre 24-iyi doku kültürü plakaları bireysel kuyuları (BD Biosciences kaplama modifikasyonu 9 ile daha önce açıklandığı gibi, kuyuların önceden tedavi edildi Franklin göl, NJ ). Kısaca, 24 kuyu doku kültürü plakaları, 4 50mm Tris çözüm 2.5 mikrogram / ml / iyi keçi anti-fare IgG (H + L) (Kierkegaard ve Perry Laboratuvarı, Gaithersburg, MD) (pH 8.6) ile kaplandı ° C geceleme. Plakalar steril PBS ve co-uyarıcı mAb CD49d, klon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) ile iki kez yıkandı Ertesi sabah, 10 mg / ml 37 az bir saat inkübe eklendi / iyi takip ° C Inkübasyondan sonra, plakaları oda sıcaklığında steril PBS ile iki kez yıkanır. Altı HIV zarf peptidler 8 kokteyli dahil olmak üzere, faiz antijenleri (her peptid 10μg/ml bir final konsantrasyon eklenmiştir. Yalnız CM hücreleri ile Ek kuyular negatif kontrol olarak hazırlanmıştır. Son 24 her bir kuyu için toplam hacmi -iyi doku kültürü plakası 1.0 ml. </li><li> Hücreler 37 az 6 saat kültüre edildi ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 atmosfer. Brefeldin A (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) stimülasyon son 4.5 saat 10μg/ml kültür eklendi. Daha sonra, hücreler 5 ml polipropilen tüpler transfer ve ile yıkanır edildi soğuk (4 ° C) akış yıkama tamponu (Dulbecco&#39;nun PBS (DPBS, Ca 2 / Mg 2-ücretsiz; Life teknolojileri, Rockville, MD) 2% ısı ile inaktive FCS) ve daha sonra çeşitli floresan etiketli antikorlar ile boyanarak için işlenmiş. </li></ol> 2. Boyama İmmünofloresan yüzey belirteçleri <ol><li> Uyarılmış hücreler ilk 4 ölü / canlı 1ul tamir edilebilir su floresan reaktif boya ile boyandı ° C 30 dakika boyunca karanlık, soğuk akış yıkama tamponu ile bir kez yıkanır. </li><li> Sonra, aşağıdaki uygun titre floresan etiketli anti-CD3 monoklonal antikorlar hücrelere ilave edildi: PE-Cy7 (SP34-2), anti-CD8 Alexa700 (RPA-T8), anti-CD28 PerCP cy5.5 (L293) , anti-CD95 APC (DX2) ve anti-CD4 pasifik mavi (OKT4) eBioscience (San Diego, CA), CD4 dışında BD Biosciences (Franklin göl, NJ) tüm pasifik mavi (OKT4). Hücreler, karanlıkta 30 dakika 4 ° C inkübe edildi. </li><li> Her deney için tazminat kontrolleri ve floresan eksi bir (FMO) hem 10,11 kullanılmıştır kontrol eder. Tazminat kontrolleri her bireyin diğer dedektörlerin içine leke yayılma coeffecients belirlemek için kullanılmıştır. Tazminat kontroller için komple bir set, maymun bir hücre süspansiyonları içeren tüplerde floresan konjuge mAb ile tek renk lekeleri gibi ayrı ayrı boyandı. FMO tüm reaktiflerin ancak bir ilgi içeren çok renkli boyama kombinasyonu ve bir olumlu arasındaki sınırı belirlemek için kullanılırnd oto-floresan seviyesi ve veri çoğaltma negatif nüfus tamamen lekeli örnek mevcut. </li><li> Vitray hücreler daha sonra soğuk akış yıkama tamponu ile yıkanır ve tespiti / permeabilization solüsyonu (BD Biosciences, San Jose, CA) sabit (Bu aşamada hücreler bir gecede 4 saklanabilir ° C karanlıkta) en az 10 dakika hücre içi sitokin boyama işlemini gerçekleştirmeden önce. </li></ol> 3. Hücre içi sitokin boyama <ol><li> Sabit hücreleri akış yıkama tamponu ile yıkanır ve daha sonra Perm / tampon yıkayın (BD Biosciences, San Jose, CA), üreticinin talimatlarına göre eklendi. Kısaca, hücreler 0.1ml 1X Perm / 4 10 dakika boyunca tampon yıkayın ° C karanlıkta inkübe edildi. </li><li> Daha sonra, hücreleri ile inkübe edildi uygun titre FITC etiketli anti-IFN-γ (B27) ve PE-etiketli 4 60 dakika anti-IL-2 (MQ1 17H12) ° C karanlıkta. </li><li> Ardından hücreler permeabilization çözümü ile iki kez daha yıkandı </li><li> En son yıkama aşamasından sonra, hücreler DPBS% 1 paraformaldehid yeniden askıya alan ve 24 saat içinde Flow sitometri analizi tabi. </li></ol> 4. Flow sitometri analizi <ol><li> Veya Mavi ADP (Dako, Carpinteria, CA); boyanan hücreler bir LSR II akış sitometresi (San Jose, CA BD Biosciences) satın alındı. FACS veriler FlowJo yazılımı (Tree Star, Ashland, OR) kullanılarak analiz edildi. </li><li> Şekil. 1 farklı T hücre alt grupları temsil eden bir hayvan analizleri için kullanılan yolluk şeması gösterir. Lenfositler forward scatter (FSC) karşı tarafında dağılım (SSC) ile ilk kapılı ve sonra canlı lenfositleri SSC ve aqua-negatif nüfus dayalı tespit edilmiştir. CD3 içinde daha sonra T hücreleri, CD4 tespit + CD8-(CD4 + T hücreleri olumlu) takip CD3 ifade tarafından tanımlanır ve CD4-CD8 + (CD8 + T hücreleri) popülasyonları + T hücre popülasyonunun. CD4 + ve CD8 + T hücreleri daha naif (Tn, CD28 + CD95-), merkezi bellek (Tcm, CD28 + CD95 +) ve efektör bellek (TEM, CD28-CD95 +) hücreler olarak olarak CD28 ve CD95 ifade temelinde farklı alt içine ayırt edildi 5, 10, edebiyat nitelendirdi. </li><li> Şekil. 2 CD4 + ve CD8 + T hücreleri farklı alt PMA ve ionomycin (PMA + I) ile stimülasyon yanıt sitokin üretimi açısından fonksiyonel kapasite (INF-γ ve / veya IL-2) için nasıl değerlendirildi gösterir. </li></ol> 5. Temsilcisi FACS verileri Rhesus makakların hücre kompozisyon FACS analizi kullanılarak tespit edildi. Şekil 1 temsilcisi hayvan farklı T hücre alt analizler için kullanılan yolluk şeması gösterir. Lenfositler forward scatter (FSC) karşı tarafında dağılım (SSC) ile ilk kapılı ve sonra canlı lenfositleri SSC ve aqua-negatif nüfus dayalı tespit edilmiştir. T hücreleri daha sonra CD3 ifade tarafından tespit edildi. CD3 CD4 + CD8-(CD4 + T hücreleri) ve CD4-CD8 + (CD8 + T hücreleri) popülasyonları içinde + T hücre popülasyonunun da tespit edilmiştir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, CD4 + ve CD8 + T hücreleri daha naif (Tn, CD28 + CD95-), merkezi bellek (Tcm, CD28 + CD95 +) ve efektör bellek (TEM, CD28 ve CD95 ifade temelinde farklı alt içine ayırt edildi CD28-CD95 +) hücreler. Şekil 2A INF-γ gösterir ve unstimulated ve PMA / ionomycin uyarılmış CD4 + T hücreleri ve alt kümeleri, ve Şekil 2B IL-2 üretimi INF-γ ve unstimulated ve PMA / ionomycin CD8 uyarılmış + T hücreleri IL-2 üretimi gösterir, ve alt kümeleri stimülasyonu ile farklı sitokin profillerinin her alt unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" /> Şekil 1: Ayırıcı strateji rhesus macqaues PBMC kompozisyon akım sitometri analizi için kullanılır. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2atmb.jpg" alt="Şekil 2a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2btmb.jpg" alt="Şekil 2b" border="0" /> Şekil 2. (A) toplam CD4 + T hücreleri ve altkümelerini. Sitokin üretimi profili (B) toplam CD8 + T hücreleri ve altkümelerini Sitokin üretimi profili. Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2a.jpg">buraya tıklayın</a> 2a daha büyük bir sürümünü görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2b.jpg">buraya ya da</a> daha büyük bir şekil 2b sürümü için.

<ol>
	<li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA.">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li><li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-specific+CD8++cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection.">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li><li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome.">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li><li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque.">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li><li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque.">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li><li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li><li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes.">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li><li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4++T+cell+responses+in+rhesus+macaques.">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li><li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13-parameter+flow+cytometry:+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype,+function,+and+T-cell+receptor+diversity.">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li></ol>

Çözüm ve Tamponlar <ul><li> Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> RPMI-1640 ortamı (HyClone laboratuarlar, Logan, UT) </li><li> Fetal sığır serumu (FBS), (HyClone laboratuarlar, Logan, UT) </li><li> L-glutamin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> Penisilin / streptomisin (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tripan mavi reaktifi (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> 50 mM Tris, pH 8.6, 4 süzülür ve mağaza ° C </li><li> Dulbecco&#39;nun PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life teknolojileri, Rockville, MD) </li><li> Akış yıkama tamponu:% 2 FBS ile DPBS takviyesi, 4 mağaza ° C </li><li> BD Cytofix / Cytoperm Sabitleme / Permeabilization Çözüm Seti (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul> Etkinleştirme ajanlar <ul><li> Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> Ionomycin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> Kostimülatör mAb CD49d, klon 9F10 (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> Affinity saflaştırılmış antikor F (ab) 2 parçaları Keçi anti-fare IgG (H + L) (Kierkegaard ve Perry Laboratuvarı, Gaithersburg, MD) </li><li> Belirli aktivasyon ajanlar peptid havuzları, tek peptid, veya tam protein içerebilir </li></ul> Sitokin salgılanması inhibitörleri <ul><li> Brefedin A (Lisans, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) </li><li> Golgi Tak (San Jose, CA BD Biosciences) alternatif olarak kullanılabilir </li></ul> Antikorlar <ul><li> Ölü / Canlı tamir edilebilir su floresan leke kiti (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD4 pasifik mavi (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA) </li><li> CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD28 PerCP cy5.5 (L293), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IFN-FITC (B27), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li><li> IL-2, PE (MQ1 17H12), (BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ul>

multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques

Rhesus makak modeli şu anda aşılar ve tedaviler geliştirilmesi için mevcut en iyi patogenezinde anlamak için saygı ile HIV-AIDS modeli gibi<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Burada, hücresel immün yanıtları detaylı fenotipik ve fonksiyonel analiz, özellikle CD4 tarafından hücre içi sitokin üretimi + ve CD8 + T hücrelerinin yanı sıra bireysel bellek alt kümeleri için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz hem CD4 interferon gamma üretimi için kesin nicel ve nitel önlemler (INF) ve interlökin (IL) -2 elde + ve CD8 + T hücreleri PMA artı ionomycin (PMA + I) ile uyarılan Rhesus makak PBMC. Sitokin profilleri bellek hücreleri farklı alt farklı. Ayrıca, bu protokol antijen spesifik CD4 bile küçük kesirleri göstermek için bize hassasiyet + ve CD8 + T hücre alt grupları, laboratuvarda geliştirilen bir HIV zarf peptid kokteyl aşısı ile aşılanan rhesus makakların PBMC örnekleri içinde. Çok renkli akım sitometri tekniği, tam olarak T hücreleri farklı popülasyonlar tanımlamak için güçlü bir araçtır<sup&gt; 4,5</sup&gt; Sitokin üreten yeteneği ile<sup&gt; 6</sup&gt;, Non-spesifik veya antijen spesifik uyarılmasını takiben<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques at JoVE.com

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Biz toplam bellek altkümelerini rhesus makakların CD4 + ve CD8 + T hücreleri, HIV / AIDS aşısı çalışmaları için ideal bir model gibi ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu için çok renkli flow sitometri yararını göstermektedir.

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

multicolor-flow-cytometry-analyses-cellular-immune-response-rhesus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.0K Görüntüleme.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. Biz toplam bellek altkümelerini rhesus makakların CD4 + ve CD8 + T hücreleri, HIV / AIDS aşısı çalışmaları için ideal bir model gibi ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu için çok renkli flow sitometri yararını göstermektedir.