وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) كور غرانت (5P30EY008098) والصناديق التالية لXW : المعاهد الوطنية للصحة والبحوث R01EY016099 المنحة لمنع العمى جائزة التطوير المهني. نشكر اثروب كيرا للحصول على مساعدة في مجال التصوير مبائر.

اليوم 1. إعداد 1. إعداد الصلبان الأسماك إعداد الصلبان البشرى من الزرد في المساء. لمنع التزاوج العشوائي قبل الوقت المطلوب ، استخدم فواصل لفصل الأسماك الإناث والذكور في أشرطة التزاوج. GFP - معربا عن الأسماك المعدلة وراثيا تستخدم كمصدر للblastomeres المانحة. خط pt104 المعدلة وراثيا (زو وآخرون ، 2008) ، وتستخدم هنا ، ويعرب عن GFP بتواجد مطلق تحت سيطرة المروج EF1. GFP التعبير يسمح التصور من الخلايا المانحة بواسطة التصوير الحي. ويمكن استخدام خطوط أخرى الأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مناسبة لاحتياجات محددة. 2. إعداد شكل إسفين agarose الآبار للحصول على عقد الجنين صب ذاب agarose 1 ٪ ، أعد البيض في الماء E3 (Westerfield ، 2007) ، في طبق بتري. تطفو في قالب من البلاستيك يحتوي على شكل نتوءات اسفين على حل agarose وترك حل agarose ترسيخ تماما. إزالة القالب بعناية ، وتزج السرير agarose بالماء E3. 3. إعداد زرع الإبر استخدام الإبرة مجتذب العمودي (ديفيد KOPF صكوك) في إعداد القوة لجعل 11،5 الإبر عن طريق سحب الزجاج الماصات الشعرية (البنك آلات دقيقة). نصائح جيدة ينبغي أن إبرة تفتق مع اعمدة طويلة. طحن نصائح الإبرة بزاوية 45 درجة مع مطحنة مايكرو (Marishige) حتى فتحات مشطوف من 45μm - 40 في القطر الداخلي ويتم الحصول على (الشكل 1A). لتنظيف نصائح الإبرة ، ونعلق خرطوم إلى نهاية حادة من الإبرة ، وربط خرطوم لحقنة ، ومن ثم تمتص والافراج عن 10 ٪ من محلول حمض الهيدروفلوريك حتى يتم إزالة كافة الانقاض مرئية. المقبل ، وغسل بالماء المقطر نصائح ، تليها الإيثانول بنسبة 100 ٪. الهواء الجاف والإبر حتى يتبخر كل الايثانول. فمن المهم لضمان أن تكون جافة تماما نصائح : الإيثانول المتبقية سوف تدمر الإبر خلال تلميع خطوة من ارتفاع الحرارة. لتليين وتلميع حواف خشنة من النصائح الإبرة ، أخبز نصائح إبرة مع الحرارة المتولدة عن خيوط من مزور مايكرو (Marishige). لا تدع نصائح إبرة تلمس خيوط خلال التلميع. يمكن ضبط كمية الكهرباء المارة على الرغم من خيوط والمسافة بين خيوط وإبر نصائح لتحقيق الشروط المطلوبة للتدفئة. ينبغي أن لا تكون درجة الحرارة مرتفعة جدا : هذا سوف تذوب وتشوه نصائح الإبرة. بعد مملس حواف خشنة ، المس بعناية خيوط ساخنة مع طرف الإبرة ثم اسحب برفق بعيدا عن خيوط الإبرة لتوليد نهاية أشارت (1B الشكل). إبرة حادة ، ناعمة ، ونظيفة أمر بالغ الأهمية من أجل الحصول على blastomeres المانحة على حالها وعدم الإضرار الأجنة المضيفة. 4. يعد المسبار الجنين لتحديد المواقع سحب ماصة الزجاج أكثر من لهب الغاز للحصول على الزجاج غرامة التحقيق مع نهاية مملس. وسيتم استخدام هذا التحقيق لوضع الأجنة في الاتجاه الصحيح قبل الزرع. اليوم 2. قسيم أرومي زرع 1. جمع واجنة dechorionate في اليوم التالي ، إزالة الفواصل في أشرطة عبر السماح الأسماك للتزاوج. وضع الأجنة في طبق بتري مملوءة بالماء E3. ثم والأجنة التي تمزق dechorionate يدويا بعيدا chorions من الأجنة مع زوج من ملقط الغرامة. استخدام ماصة الزجاج مع رمح عازمة على نقل الأجنة بعناية dechorionated في آبار agarose. تجنب أي اتصال من الأجنة مع الهواء ، مما يؤدي إلى انفجار الأجنة. السماح للأجنة في تطوير 28،5 درجة مئوية في الآبار agarose حتى 3 التسميد آخر ساعة ، أو HPF. 2. انشاء جهاز زرع في حين أن الأجنة تطوير وانشاء جهاز الزرع من خلال ربط الإبرة إلى زرع الزيوت المعدنية المليئة النظام الجزئي الضخ. تأكد من أن النظام لا تسرب محاصرون وليس فقاعات الهواء في النظام. شغل الإبرة مرة زرع كامل مع الزيوت المعدنية ، باستثناء 0.5 -- في افتتاح غيض 1 ميكرولتر من الفضاء. 3. زرع blastomeres لزرع blastomeres ، واستخدام الزجاج التحقيق لتحديد المواقع لتوجيه الجانب قسيم أرومي من أجنة 3 - 4 - HPF صعودا. ثم ، تضاف برفق الإبرة إلى زرع جنين المانحة وتمتص ببطء 50-20 blastomeres في الإبرة. ادخال الإبرة قسيم أرومي مملوءة إلى الجنين المضيف والافراج عن blastomeres ببطء. سيكون الموقع الذي يتم الإفراج عن التأثير فيها blastomeres ذريتها توطين في مراحل تنموية في وقت لاحق. لتحليل وضع شبكية العين والدماغ والخلايا الافراج في القطب الحيواني. خلال الزرع ، وتأكد من أن رأس الإبرة لا اتصال الهواء. لتقليل الأضرار الميكانيكية ، يجب ترك الأجنة المضيفة في الآبار في agarose 28.5 درجة مئوية حتى اليوم التالي. ثم ، رransfer الأجنة الفسيفساء إلى 24 لوحات جيدا قبل المغلفة مع 0.5 مل من agarose 1 ٪ ، مع جنين واحد في كل جانب. يضاف 1 مل من الماء إلى البيض E3 كل بئر. لمنع العدوى البكتيرية ، وإضافة 10 ميكرولتر من البنسلين والستربتوميسين 100X إلى الماء البيض E3. اليوم 3. التضمين والتصوير المباشر للأجنة الفسيفساء 1. التضمين الأجنة إعداد 1.5 ٪ نقطة انصهار منخفضة agarose (LMP) في الماء والحفاظ على بيضة E3 الحل في حمام الماء 30 درجة مئوية. نقل الجنين الى صحن فسيفساء نسيج الثقافة FluoroDish مع قاع كوب من سمك 0.17mm في (الآلات الدقيقة الدولي). إزالة المياه الزائدة E3 على مغادرة جنين المشمولة فقط من خلال الحد الأدنى من E3. إضافة 30-50 ميكرولتر ذاب LMP 1.5 ٪ إلى الجنين. الموقف بسرعة العين أو الدماغ أقرب إلى أسفل الزجاج ممكن قبل حل agarose يتصلب. بعد حل يبرد ، إضافة إضافية agarose حل لتأمين مزيد من الأجنة في المكان. ثم غمر طدت agarose مع كتلة 2-3 مل ماء بيضة E3. 2. مبائر التصوير للفحص المجهري متحد البؤر ، يستخدم هدفا الغمر بالمياه المقلوب (أوليمبوس ، PlanApo ، 40 X/0.90 WLSM ، اليابان) مع التركيز عمق كبير. إضافة قطرة من الماء على الهدف والمكان بعد ذلك زراعة الأنسجة FluoroDish طبق على الهدف. صورة للتنمية ، نفذ الوقت الفاصل بين التصوير التي تلتقط صورا للأجنة كل 5 دقائق. اعتمادا على طبيعة التجارب ، ينبغي ضبط الفواصل الزمنية بين الطلقات. ممثل النتائج الشكل 2 يوضح ممثل HPF 24 الزرد الفسيفساء. GFP التعبير تسلط الضوء على الخلايا المانحة باللون الأخضر. الخلايا الظهارية العصبية للشبكية تغطي كامل سماكة الجدار في شبكية العين. الفيلم يتناول تحركات خلايا المانحة في الدماغ المضيفة في 24 HPF. إشعار الخلايا morphologies تتغير بمرور الوقت. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. أشكال من النصائح إبرة الزرع. ألف وكان افتتاح مشطوف من غيض من إبرة خالية من الحطام بعد يغسل حمض الهيدروفلوريك. ولدت ألف باء وأشار في نهاية طرف الإبرة. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. التصور من GFP - معربا عن الخلايا المانحة في الأجنة الزرد خيالية في 24 HPF. اللوحة اليسرى يظهر إشارات GFP في الدماغ وشبكية العين. لوحة الوسطى هي صورة مشرقة من حقل الجنين. لوحة الحق يظهر صورة مدمجة. الفيلم 1. تصوير الخلايا الحية GFP المانحة إيجابية أظهرت تغيرات واسعة في الخلايا الظهارية العصبية morphologies الدماغ أثناء التطور. وجمعت الأطر الفردية من الفيلم كل 5 دقائق بين 24 و 25 HPF. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">انقر هنا لمشاهدة الفيلم</a> .

<ol>
	<li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish.">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li><li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina.">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li></ol>

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لزرع قسيم أرومي لتحليل وضع شبكية العين والدماغ في الزرد. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لتحليل تطور الأنسجة والأجهزة الأخرى عن طريق الإفراج عن ببساطة blastomeres المانحة إلى مواقع المناظرة في الأجنة المضيفة. وسم مع جزيئات GFP ...

E3 البيض المياه : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مم كلوريد الصوديوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.17 ملي بوكل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 ملي CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 ملي MgSO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1 ٪ الميثيلين الأزرق </li></ul>

transplantation of gfp-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos

تغيير الخلايا على نطاق واسع في مواقع وممتلكاتهم خلال مرحلة التطور الجنيني. وتنظم هذه التغييرات من التفاعلات بين الخلايا وبيئتها. أجنة خيالية ، والتي تتكون من خلايا جينية مختلفة عن الخلفية ، هي أدوات عظيمة لدراسة التفاعلات خلية خلية بوساطة الجينات في المصالح. شفافية الجنينية من الزرد في مراحل النمو المبكر تصاريح التصوير المباشر للالتشكل الأنسجة والأعضاء على المستوى الخلوي. هنا ، علينا أن نظهر بروتوكول لتوليد خيالية شبكية العين والدماغ في الأجنة الزرد والتصوير لأداء حية من خلايا المانحة. البروتوكول يشمل إعداد الإبر زرع ، وزرع GFP - معربا عن blastomeres المانحة لGFP سلبية المضيفين ، ودراسة سلوك الخلية المانحة تحت المجهر مبائر حية. مع تعديلات طفيفة ، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة التطور الجنيني من الأنسجة والأجهزة الأخرى في الزرد. وتناقش أيضا مزايا استخدام GFP إلى الخلايا المانحة التسمية.

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos at JoVE.com

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

ندلل على بروتوكول لتوليد اجنة الزرد خيالية للسلوك التصوير العيش الخلوية خلال مرحلة التطور الجنيني.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  University of Pittsburgh. ندلل على بروتوكول لتوليد اجنة الزرد خيالية للسلوك التصوير العيش الخلوية خلال مرحلة التطور الجنيني.

Video: Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation الجنين الميداكا وزرع الخلايا لتوليد الوهم

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glycans التصوير في الأجنة التي وصفها اسماك الزرد الاستقلابية والكيمياء Bioorthogonal انقر

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.