Este estudo foi apoiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Core Grant (5P30EY008098) e os fundos a seguir para XW: Grant NIH R01EY016099 e Pesquisa para prevenir a cegueira Prêmio de Desenvolvimento de Carreira. Agradecemos a Lathrop Kira de assistência em imagem confocal.

Dia 1. Preparação 1. Configurar atravessa peixes Configurar cruza pairwise de peixe-zebra da noite. Para evitar acasalamento ao acaso antes do tempo desejado, use divisórias para separar o peixe do sexo feminino e masculino nas cassetes de acasalamento. Expressando GFP-peixes transgénicos são usados ​​como fonte de blastômeros doador. A linhagem transgênica pt104 (Zou et al., 2008), usado aqui, expressa ubiquitously GFP sob o controle do promotor EF1. Expressão GFP permite a visualização de células do doador por imagem ao vivo. Outras linhas de peixes transgénicos que expressam proteínas fluorescentes adequado pode ser usado para necessidades específicas. 2. Prepare em forma de cunha agarose poços para a realização de embrião Despeje derretido agarose 1%, preparada em água do ovo E3 (Westerfield, 2007), em uma placa de Petri. Float um molde de plástico que tem saliências em forma de cunha na solução de agarose e deixar a solução de agarose completamente solidificar. Remover o molde com cuidado e coloque a cama agarose com água E3. 3. Prepare agulhas transplante Use um extrator de agulhas vertical (David KOPF Instruments) com potência 11,5 configuração para fazer agulhas, puxando pipetas de vidro capilar (Instrumento de precisão Mundial). Dicas agulha bom deve taper com eixos de comprimento. Moer as dicas agulha em um ângulo de 45 graus com uma Grinder Micro (Marishige) até aberturas chanfradas de 40-45μm de diâmetro interno são obtidos (Fig. 1A). Para limpar as pontas de agulhas, anexar uma mangueira até o fim brusco da agulha, conectar a mangueira a uma seringa, e então absorver e liberar uma solução de ácido fluorídrico 10% até que todo o entulho é removido. Em seguida, lave as pontas com água destilada, seguido pelo etanol 100%. Secar as agulhas até que todos evapora etanol. É importante assegurar que as pontas estão completamente secos: etanol residual vai arruinar as agulhas durante a etapa de polimento de alta temperatura. Para suavizar e polonês as arestas das pontas de agulha, coza as pontas da agulha com o calor gerado pelo filamento de uma Forger Micro (Marishige). Não deixe que as pontas de agulha toque o filamento durante o polimento. A quantidade de eletricidade passando através do filamento ea distância entre o filamento e as pontas da agulha pode ser ajustado para obtenção de condições de aquecimento desejada. A temperatura não deve ser muito alto: isto irá derreter e deformar as pontas da agulha. Após as arestas são suavizadas, cuidadosamente tocar o filamento aquecido com a ponta da agulha e puxe o filamento longe da agulha para gerar uma extremidade pontiaguda (Figura 1B). Uma agulha fina, lisa e limpa é fundamental para a obtenção de blastômeros doador intacta e para não danificar os embriões host. 4. Prepare uma sonda de embrião de posicionamento Puxe uma pipeta de vidro sobre uma chama de gás para obter uma sonda de vidro fino com uma extremidade smoothened. Esta sonda será usado para posicionar os embriões na orientação correta antes do transplante. Dia 2. Blastômero transplante 1. Coletar e embriões dechorionate No dia seguinte, retire os divisores com os cassetes de cruz para permitir que os peixes mate. Coloque os embriões em placas de Petri com água E3. Então, os embriões dechorionate manualmente arrancando o córions dos embriões com um par de fórceps bem. Use uma pipeta de vidro com haste inclinou-se para transferir cuidadosamente os embriões dechorionated em agarose poços. Evitar qualquer contato dos embriões com o ar, que causam os embriões para estourar. Deixe os embriões se desenvolvem em 28.5 ° C nos poços agarose até 3 horas após a fecundação, ou hpf. 2. Criar um aparelho de transplante Enquanto os embriões se desenvolvem, configurar um aparelho de transplante, ligando a agulha para o transplante mineral oil-filled sistema de micro-bombeamento. Certifique-se que o sistema não vaza e não bolhas de ar estão presos no sistema. Voltar preencher a agulha transplante inteiro com óleo mineral, com exceção do 0,5-1 mL de espaço na abertura da ponta. 3. Transplante de blastômeros Para transplante de blastômeros, use uma sonda de posicionamento de vidro para orientar o lado blastômero de embriões 3-4-hpf para cima. Então, gentilmente inserir a agulha em um transplante de embrião doador e, lentamente, sugar até 20/05 blastômeros na agulha. Inserir a agulha blastômero cheio em um embrião hospedeiro e solte o blastômeros lentamente. O local em que os blastômeros são liberados irá influenciar em sua progênie localizar em fases posteriores de desenvolvimento. Para analisar o desenvolvimento da retina e do cérebro, as células de liberação no pólo animal. Durante o transplante, certifique-se que a ponta da agulha não contato com o ar. Para minimizar danos mecânicos, embriões de acolhimento deve ser deixado nos poços agarose a 28,5 ° C até o dia seguinte. Então, tRANSFERÊNCIA os embriões mosaico para placas de 24 poços pré-revestidos com 0,5 ml de agarose 1%, com um embrião em cada poço. 1 ml de água do ovo E3 é adicionada a cada poço. Para evitar infecções bacterianas, adicione 10 ml de 100X penicilina e estreptomicina para a água de ovo E3. Dia 3. Incorporação e imagens ao vivo de embriões mosaico 1. Embriões incorporação Prepare 1,5% baixo ponto de fusão de agarose (LMP) em água de ovo E3 e manter a solução em banho-maria a 30 ° C. Transferência de um embrião de mosaico para um prato FluoroDish cultura de tecidos com um fundo de vidro de 0,17 milímetros de espessura (Instrumentos de Precisão Mundial). Retirar a água em excesso E3 para deixar o embrião apenas coberto por uma quantidade mínima de E3. Adicionar 30-50 LMP derretido mL de 1,5% para o embrião. Rapidamente a posição do olho ou o cérebro mais próximo possível do fundo de vidro quanto possível antes de a solução de agarose solidifica. Depois que a solução esfria, adicione a solução de agarose adicionais para proteger ainda mais os embriões no lugar. Em seguida, mergulhe a solidificou agarose bloco com 2-3 ml de água do ovo E3. 2. Imagem confocal Para microscopia confocal, um objetivo imersão em água invertido (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japão) com uma profundidade grande foco é usado. Uma gota de água é adicionada para o objetivo e em seguida, coloque uma placa de cultura de tecidos FluoroDish no objectivo. Para o desenvolvimento da imagem, execute lapso de tempo de imagem por tirar fotos dos embriões a cada 5 minutos. Dependendo da natureza dos experimentos, os intervalos de tempo entre os disparos devem ser ajustados. Resultados representativos A figura 2 ilustra um representante 24 hpf zebrafish mosaico. Expressão GFP destaca as células do doador em verde. As células da retina neuroepiteliais abrangem toda a espessura da parede da retina. O filme mostra os movimentos de células do doador no cérebro anfitrião em 24 hpf. Morfologias células notificação de mudança ao longo do tempo. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Formas das pontas de agulha transplante. A. A abertura chanfrada da ponta de uma agulha estava livre de detritos após lavagens ácido fluorídrico. B. A extremidade pontiaguda foi gerada na ponta da agulha. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Visualização de GFP-expressando células do doador em uma embriões quiméricos zebrafish menos 24 hpf. O painel esquerdo mostra os sinais de GFP no cérebro e retina. O painel do meio é uma imagem de campo claro do embrião. O painel da direita mostra a imagem mesclada. Filme 1. Vivo de imagem de células do doador GFP positivos demonstraram a grandes mudanças na morfologia do cérebro de células gliais durante o desenvolvimento. Os quadros individuais do filme foram coletados a cada 5 minutos entre 24 e 25 hpf. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">Clique aqui para ver o filme</a> .

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	<li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish.">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li><li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina.">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li></ol>

Neste vídeo, demonstramos um método para blastômero transplante para analisar o desenvolvimento da retina e do cérebro em zebrafish. Este protocolo também pode ser usado para analisar o desenvolvimento de outros tecidos e órgãos, simplesmente liberando a blastômeros de doadores para os locais correspondentes nos embriões host. A rotulagem com as moléculas de GFP rende um aspirador de fundo do que a marcação com corante fluorescente conjugada Dextran (Ho e Kane, 1990). Isto é porque os restos de tintas Dextr...

E3 água ovo: <ul><li> 5 mM NaCl </li><li> 0,17 mM KCl </li><li> 0,33 mM CaCl 2 </li><li> 0,33 mM MgSO 4 </li><li> Azul de metileno 0,1% </li></ul>

transplantation of gfp-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos

Células mudam extensivamente em seus locais e dos bens durante a embriogênese. Essas alterações são reguladas pelas interações entre as células e seu meio ambiente. Embriões quiméricos, que são compostas de células de fundo genético diferente, são ótimas ferramentas para estudar as interações célula-célula mediada por genes de interesse. A transparência embrionário de zebrafish em fases iniciais de desenvolvimento permite a visualização direta da morfogênese de tecidos e órgãos em nível celular. Aqui, nós demonstramos um protocolo para gerar retinas quimérico e cérebros em embriões de peixe-zebra e para realizar imagens ao vivo das células do doador. O protocolo abrange a preparação de agulhas transplante, o transplante de GFP-expressando blastômeros doadores para GFP-negativos hosts, eo exame do comportamento dos doadores de células sob microscopia confocal ao vivo. Com pequenas modificações, este protocolo também pode ser usado para estudar o desenvolvimento embrionário de outros tecidos e órgãos em peixes-zebra. As vantagens de usar a GFP para as células do doador rótulo também são discutidos.

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Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Demonstramos um protocolo para gerar embriões quiméricos zebrafish para o comportamento imagens ao vivo do celular durante a embriogênese.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K visualizações.  University of Pittsburgh. Demonstramos um protocolo para gerar embriões quiméricos zebrafish para o comportamento imagens ao vivo do celular durante a embriogênese.