NIH 그랜트 R01EY016099 및 실명 경력 개발 상을 방지하기 위해 연구 : 본 연구는 건강의 국립 연구소 (NIH) 코어 그랜트 (5P30EY008098) 다음과 같은 자금 XW에 의해 지원되었다. 우리는 공촛점 이미징에 도움 키라 라스럽 감사합니다.

1 일. 준비 1. 물고기 십자가를 설정 저녁에 zebrafish의 pairwise 교차를 설정합니다. 원하는 시간 전에 무작위로 교배를 방지하기 위해 짝짓기 카세트에서 암컷과 수컷 물고기를 구분하는 디바이더를 사용합니다. GFP - 표현 유전자 변형 물고기 것은 기증자 blastomeres의 소스로 사용됩니다. pt104 유전자 변형 라인 (Zou 외., 2008), 여기에 사용 EF1 모터의 제어하에 ubiquitously GFP를 표현합니다. GFP의 표현이 라이브 영상으로 기증자 세포의 시각화 수 있습니다. 적합한 형광 단백질을 표현하는 다른 유전자 변형 물고기 라인은 특정 요구에 맞게 사용할 수 있습니다. 2. 배아 보관을위한 쐐기 모양의 아가로 오스 웰스 준비 페트리 접시에 E3 계란 물 (웨스 터, 2007)에서 준비 녹아 1퍼센트 아가로 오스를, 하거라. 아가로 오스 솔루션 쐐기 모양의 라고나할까요을 가지고 있으며, 아가로 오스 솔루션이 완전히 응고하게 플라스틱 금형을 플로트. 자세히 곰팡이를 제거하고 E3 물과 아가로 오스 침대 젖어. 3. 이식의 바늘을 준비 유리 모세관 pipettes (세계 정밀 악기)를 당겨 바늘을 만들 11.5 설정을 전원에서 수직 니들 풀러 (데이비드 KOPF 악기)를 사용합니다. 좋은 바늘 팁 긴 샤프트와 테이퍼합니다. 내경 40 - 45μm의 beveled 개구부 (그림 1A)를 얻을 수있다 때까지 마이크로 그라인더 (Marishige)와 45도 각도로 바늘 도움말을 분쇄. 바늘 팁을 정리, 바늘의 뭉툭한 끝에 호스를 연결 주사기에 호스를 연결한 다음 빨아 모든 보이는 이물질이 제거될 때까지 10 % 불화 수 소산​​ 산성 솔루션을 출시. 다음, 100 % 에탄올 다음 증류수로 도움말을 씻으십시오. 모든 에탄올 증발까지 바늘을 공기 건조. 잔여 에탄올의 고온 연마 단계에서 바늘을 망치는 것입니다 도움말을 완전히 건조되도록하는 것이 중요합니다. 바늘 팁의 거친 모서리를 부드럽게하고 폴란드어하려면, 마이크로 위조자 (Marishige)의 필라멘트에 의해 생성된 열을와 바늘 팁을 구워. 바늘 도움말을 연마 중에 필라멘트를 만지지 않도록하십시오. 필라멘트와 바늘 팁 사이의 필라멘트와 거리지만 전달하는 전기의 양은 원하는 난방 조건을 달성하기 위해 조정할 수 있습니다. 온도가 너무 높으해서는 안됩니다 :이 녹으 바늘 조언을 변형합니다. 거친 가장자리가 smoothened 후 조심스럽게 바늘 끝으로 가열 필라멘트를 터치하고 부드럽게 지적 엔드 (그림의 1B)를 생성하는 바늘에서 멀리 필라멘트를 당기십시오. 날카로운 부드럽고 깨끗한 바늘은 그대로 기증 blastomeres를 취득하고 호스트 배아를 손상되지 않습니다 중요합니다. 4. 배아 - 위치 프로브를 준비 smoothened 끝에있는 고급 유리 프로브를 얻기 위해 가스 불꽃을 통해 유리 피펫을 당기세요. 이 프로브는 이전에 이식하기 위해 적절한 방향에서 배아를 위치로 사용됩니다. 일 2. Blastomere 이식 1. 수집 및 dechorionate 배아 다음날, 친구에게 물고기를 허용하도록 교차 카세트에 디바이더를 제거합니다. E3 물이 가득 배양 접시에있는 배아를 놓습니다. 그런 다음 수동으로 미세 포셉 한 쌍의와 배아에서 chorions 멀리 되는걸하여 dechorionate 배아. 신중하게 아가로 오스 웰스에 dechorionated 배아를 전송하는 구부러진 샤프트와 유리 피펫을 사용합니다. 공기와 배아의 접촉을 피하십시오, 이것은 버스트에 배아의 원인이됩니다. 배아는 28.5에서 개발하자 ° 아가로 오스 웰스의 C 3 시간 게시물 수정, 또는 HPF까지. 2. 이식 장치를 설정 배아가 발달하는 동안, 미네랄 오일 - 채워진 마이크로 펌핑 시스템에 이식 바늘을 연결하여 이식 장치를 설정합니다. 시스템이 누설되지 않으며 기포가 시스템에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 위로 0.5을 제외하고, 미네랄 오일과 함께 전체 이식 바늘을 채우기 - 공간 1 μl를 팁 오프닝에서. 3. blastomeres의 이식 blastomeres을 이식하려면, 이상 3 - 4 - HPF의 태아의 blastomere 측면을 동쪽을 향하게하는 유리 위치 프로브를 사용합니다. 그런 다음, 부드럽게 기증자의 배아에 이식 바늘을 삽입하고 천천히 바늘로 50-20 blastomeres을 빨아. 호스트 배아에 blastomere - 채워진 바늘을 넣고 천천히 blastomeres를 놓습니다. 그들의 자손들이 나중에 발달 단계에서 집중 어디 blastomeres가 출시되는이 사이트는 영향을 미칠 것이다. 망막과 두뇌 개발, 동물 극에서 출시 세포를 분석합니다. 이식하는 동안, 바늘 끝 공기에 문의 있지 않은지 확인하십시오. 기계적 피해를 최소화하기 위해, 호스트 배아는 다음날까지 28.5 ° C의 아가로 오스 우물에 남아한다. 그런 다음, T각각 잘 한 배 (胚)와, 1 % 아가로 오스의 0.5 ML 사전 코팅 24 잘 접시에 모자이크 배아를 ransfer. E3 계란 물 1 ML 각 잘에 추가됩니다. 박테리아 감염을 방지하기 위해, 100X 페니실린 및 E3 계란 물에 스트렙토 마이신 10 μl를 추가합니다. 3 일. 퍼가기과 모자이크 배아의 라이브 영상 1. 퍼가기 배아 E3 계란 물 속에 1.5 % 낮은 용융 점 아가로 오스 (LMP)를 준비하고 30 ° C의 물을 욕조에 솔루션을 유지. 두께 0.17mm의 유리 바닥을 가진 FluoroDish 조직 문화 요리 (세계 정밀 계측기)에 모자이크의 배아를 전송합니다. 단지 E3의 최소 금액이 적용되는 배아를 떠나 초과 E3 물을 제거합니다. 배아에 30-50 μl 녹인 1.5 % LMP를 추가합니다. 빨리 아가로 오스 솔루션 굳은하기 전에 가능한 한 유리 하단에 가까운 눈 또는 머리를 위치. 솔루션은 아래 냉각 후, 더 이상 장소에서 배아를 보호하는 추가 아가로 오스 솔루션을 추가합니다. 그런 다음, 2-3 ML E3 달걀 물로 확정 아가로 오스 블록을 담가. 2. 공촛점 이미징 공촛점 현미경을 위해, 큰 초점 심도있는 물이 침수 바뀌 목적은 (올림푸스, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, 일본)이 사용됩니다. 물방울이 목적에 추가하고 다음 목적에 FluoroDish 조직 문화 요리를 장소이기도합니다. 이미지 개발, 배아 5 분 간격의 사진을 복용하여 시간 경과 이미징을 수행합니다. 실험의 성격에 따라, 촬영 사이의 시간 간격을 조정해야합니다. 대표 결과 그림 2는 대표적인 24 HPF의 모자이크 zebrafish를 보여줍니다. GFP 표현이 녹색에서 기증자의 세포를 강조 표시합니다. 망막 neuroepithelial 세포가 망막 벽의 전체 두께에 걸쳐. 영화는 24 HPF에서 호스트 두뇌에 기증자 세포의 움직임을 보여줍니다. 공지 세포의 morphologies은 시간이 지남에 따라 변경합니다. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 이식 니들 팁 형태. A.는 바늘 끝의 beveled 오프닝은 불화 수 소산​​ 산성 세척 후 파편 무료되었습니다. B. 뾰족한 끝을 바늘 끝에 생성되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. GFP의 시각화 - 표현 24 HPF에서 키메라 zebrafish의 배아에서 기증자 세포를. 왼쪽 패널은 두뇌와 망막의 GFP 신호를 보여줍니다. 중앙 패널은 배아의 밝은 현장 사진입니다. 오른쪽 패널은 병합된 이미지를 보여줍니다. 영화 1. GFP 긍정적인 기증자 세포 이미징 개발 중에 뇌 세포 neuroepithelial의 morphologies의 광범위한 변화를 보여주는 살고 있습니다. 영화의 각 프레임은 24 일과 25 HPF 사이에 5 분마다 수집하고있는 것은. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol>
	<li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish.">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li><li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina.">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li></ol>

이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 망막과 두뇌 개발을 분석 blastomere 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 또한 단순히 호스트 배아의 해당 위치로 기증자 blastomeres을 출시하여 다른 조직과 기관의 발전을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. GFP 분자와 라벨링은 형광 염료 복합 Dextran (호 케인 1990)와 라벨보다 깔끔한 배경을 산출. 죽은 기증자 세포에서 Dextran의 염료의 잔해가 있으므로 영상 ...

E3 달걀 물 : <ul><li> 5 MM NaCl </li><li> 0.17 MM KCl </li><li> 0.33 MM CaCl 2 </li><li> 0.33 MM MgSO 4 </li><li> 0.1 % 메틸렌 블루 </li></ul>

transplantation of gfp-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos

세포 embryogenesis 동안 자신의 위치와 속성에 광범위하게 변경합니다. 이러한 변경은 세포와 그 환경 사이의 상호 작용에 의해 규제됩니다. 다른 유전 배경의 세포 구성되어 있으며 키메라 배아는 관심의 유전자에 의해 중재 세포 세포 상호 작용을 연구하는 훌륭한 도구입니다. 초기 발달 단계에 zebrafish의 배아 투명성은 세포 수준에서 조직과 장기의 morphogenesis 직접 시각화 수 있습니다. 여기, 우리는 zebrafish 배아의 망막과 두뇌 키메라를 생성하고 기증자의 세포의 라이브 영상을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 프로토콜은 이식의 바늘의 이식의 준비를 다루고 GFP - 표현 GFP - 부정적인 호스트 기증자 blastomeres를 라이브 공촛점 현미경 하에서 공여 세포 행동의 시험. 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 또한 zebrafish에서 다른 조직과 장기의 배아 발달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 레이블 기증자 세포에 GFP를 사용하는 장점도 설명합니다.

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Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

의 이식 GFP - 표현 키메라 Zebrafish의 태아의 망막과 두뇌 개발의 라이브 영상에 대한 Blastomeres을

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K 조회수.  University of Pittsburgh. 우리는 embryogenesis 동안 라이브 이미징 세포 행동 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다.

비디오: Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

연구

생물학

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

이식에 의해 키메라 Zebrafish의 배아를 생성

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Chimeras의 생성에 대한 Medaka의 태아 및 세포 이식의 Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...