التمويل المقدم من ولاية اريزونا جنوب الصحة شؤون المحاربين القدامى نظام الرعاية VA الاستحقاق 0142 منح مراجعة البحوث الطبية الحيوية وأريزونا اللجنة منح 0803.

التحضير ليتم عرضه على شرائح الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تمرير منظار القولون في القولون عن طريق المستقيم. ومنظار القولون عبارة عن أنبوب طويل وإنارة وكاميرا الفيديو في الرأس ، والقدرة على تمرير الهواء إلى القولون لتفجيره مثل البالون طويلة للسماح التصور أفضل من القولون ، وممر للملقط الخزعة التي يمكن أن تتجاوز كاميرا فيديو لقرصة قبالة منطقة 3-5 ملليمتر من &quot;الجلد&quot; أو طبقة السطح الداخلي للغشاء المخاطي للقولون ليقدم لنا عينات الخزعة. يمكن أيضا أن يستخدم الملقط خزعة لإزالة محتملة قبل السرطانية الاورام الحميدة موجودة في القولون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصلنا على خزعات من الأنسجة الطبيعية القولون المخاطي من المرضى ، والموافقة المستنيرة. كانت هذه المرضى الذين يخضعون للفحص تنظير القولون في عيادة الجهاز الهضمي. وضعت الخزعات لدينا في الجرار من الفورمالين. بعد 4 ساعات ، تم استبدال الفورمالين بواسطة الكحول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد أخذت عينات من أنسجة مماثلة من مناطق استئصال القولون وإزالة أثناء الجراحة ، والتي كانت 1 سم و 10 سم بعيدا عن سرطان القولون أو أورام مع الأورام المتقدمة. كما وضعت هذه عينات الأنسجة في الفورمالين ، وإذا كانت كبيرة عينات الأنسجة ، وأبقي في بعض الفورمالين لفترة أطول قبل أن يوضع في الكحول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم أخذ عينات من الأنسجة إلى مختبر الأنسجة ليتم معالجتها ووضعها في كتل البارافين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي كتل البارافين مبردة في الثلاجة لجعلها أكثر سهولة من قبل قطع مشراح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع المقاطع أنسجة ميكرون سماكة 4 من كتل الأنسجة ، وذلك باستخدام مشراح ، وطفت على سطح الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمقارنة التعبير عن اثنين من البروتينات ، وعلى سبيل المثال ERCC1 Pms2 ، يمكن أن تكون التقطت أقسام الأنسجة البديلة حتى على شريحتين ، وحتى هناك قطاعات النسيج ثلاثة على كل من اثنين من الشرائح. على سبيل المثال ، يمكن وضع الأبواب 1 و 3 و 5 على شريحة واحدة يمكن وضعها المسمى ERCC1 والمقاطع 2 و 4 و 6 على شريحة واحدة المسمى Pms2. يمكن وجود أقسام الأنسجة three immunostained لبروتين واحد على شريحة واحدة تتيح لك معرفة ما إذا كان نمط غير معتاد من تلطيخ سرداب هو الأداة أو حقيقي ، لأن القطع الأثرية لن تتكرر في قسم النسيج واحد أو أكثر على شريحة. الخبايا القولون حوالي 60 ميكرون في القطر ، بحيث يمكن قطع نسيج أقسام حوالي 15 من خلال واحدة سرداب ، ويمكن أن ينظر إلى نفسه على أبواب القبو أنسجة متعددة لكل شريحة. </li></ol> Immunostaining أقسام الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع الشرائح من خلال إجراءات وضع العلامات المناعى. هذا هو إجراء 8 ساعات ، وإلى حد ما هو المعيار. أجزاء من الإجراءات التي نستخدمها ، التي ليست موحدة ، واستخدام الحاويات لتلطيخ Sequenza ، واستخدام الحل للحد من تلوين الخلفية يسمى ب &quot;القناص&quot;. يتم بيع &quot;القناص&quot; الحل باعتباره صيغة الملكية الطبية التي بيوكير ، كونكورد CA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتظهر بعض الخطوات من الإجراءات لدينا هنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كمثال ، لPms2 المناعية ، والشرائح هي الاولى deparaffinized وضع في 3 تغييرات الزيلين (3 دقائق لكل منهما) ، تليها 2 تغييرات في الإيثانول بنسبة 100 ٪ (2 دقيقة لكل منهما) ، تليها 2 التغيرات في الايثانول 95 ٪ (2 دقيقة لكل منهما) ، تليها 2 التغيرات في الماء المقطر (2 دقيقة لكل منهما). وتنفذ هذه الإجراءات في إطار غطاء الكيميائية مع ضغط الهواء السلبي بحيث لا يتعرض المجرب للأبخرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأصبحت أجزاء من البروتينات في عينات الأنسجة الفورمالين عندما كان يستخدم في البداية لإصلاح الأنسجة ، عبر ربط. الآن نحن بحاجة لكسر الروابط العابرة للجسم بحيث يمكن التعرف على البروتينات المثيرة للاهتمام. توضع الشرائح في حل العازلة التي يتم إحضارها إلى نقطة الغليان في فرن الميكروويف. اعقب ذلك 10 دقيقة على الإعداد المتوسط ​​، تليها التبريد لمدة 20 دقيقة على الجليد. هذه الخطوة يجب أن يتم اختبارها وتعديلها عن الموجات المختلفة ، حتى يتم تحقيق نتائج جيدة. علما بأن لimmunostaining CcOI أو Ku86 كنا عازلة سيترات الصوديوم مصنوعة من حامض الستريك 9mL + 41mL سترات الصوديوم + 450mL H 2 O (بما في ذلك منطقة عازلة ايونات الصوديوم) التي لديها درجة الحموضة من حوالي 6.0 ، لكنا ERCC1 عازلة سيترات أدلى مع حامض الستريك 2.1g + 1 لتر H 2 O + ~ هيدروكسيد الصوديوم 5mL لجلب الرقم الهيدروجيني إلى 6.1 (منطقة عازلة مع الحد الأدنى من أيونات الصوديوم المضافة) ، وكنا Pms2 حل المصنوعة من 5mL مستضد حل إماطة اللثام (عن طريق ناقلات) + 533mL H 2 O. وهناك حاجة إلى مخازن مختلفة لزيادة التفاعل مع الأجسام المضادة الحواتم بروتين معين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم توضع الشرائح في بيروكسيد الهيدروجين 3 ٪ (المخفف في الميثانول) لمدة 20 دقائق تليها شطف في الماء المقطر لمدة 3 دقائق ، ويغسل في المياه المالحة فوسفات مخزنة (تسمى PBS) لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم توضع الشرائح في شقة ضيقة تسمى رفوف تلطيخ Sequenza (Shandon نظام Immunostaining Sequenza من العلم الحرارية) وتشطف مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتعرض الشرائح يجري immunostained لERCC1 أو Pms2 إلى 10 دقيقةutes التعرض لمعاملة المضافة لل3 قطرات من محلول الملكية ، والحصول عليها من بيوكير ، ودعا &quot;القناص&quot; الذي يعمل على خفض غير محددة من البروتينات تلوين الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم شطف الشرائح مع &quot;TBST&quot; العازلة التي توين + 1 مل 100 مل 10X تريس + 900 مل من الماء المقطر [حيث تريس 10X هو 24.2 غراما Trizma + 80 غراما كلوريد الصوديوم + مل من الماء المقطر ومنزوع الأيونات 1000 + حمض الهيدروكلوريك المركز (حوالي 15 مل) لتقديم حل لدرجة الحموضة 7،6]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتشطف ثم ثلاث مرات مع الشرائح العازلة ، و 100 من microliters داكو biotinylated الضد الثانوية في التخفيف 1:100 (في ألبومين المصل البقري 2 ٪ تتكون في TBST العازلة) يتم إضافتها إلى الشرائح والمحتضنة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند هذه النقطة ، على استعداد Vectastain ABC (مجمع أفيدين البيوتين) (من مختبرات المتجهات) كاشف ، وذلك باستخدام 2.5 مل PBS ، 1 حل قطرة ، قطرة حل 1 باء ، ويسمح الحل للوقوف لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم شطف الشرائح 3 مرات مع TBST العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تضاف 3 قطرات من كاشف ABC Vectastain ويتم تحضين الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، تليها الشطف 2 مرات مع TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مغمورة ثم الشرائح في DAB (diamino - بينزاميد) (2.9 مل DAB + 400 + microliters PBS الهيدروجين بيروكسيد microliters 250) لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تشطف والشرائح 2 مرات بالماء ، المقطر منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم Counterstaining بمحلول مخفف من الهيماتوكسيلين لمدة 10 ثانية. وتشطف جيدا الشرائح في مياه الحنفية يليه الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم الشرائح المجففة 2 مرات عن 2 دقيقة في الايثانول 95 ٪ ، و 2 مرات لمدة 2 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ و 2 مرات لمدة 2 دقيقة في الزايلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تضاف بضعة قطرات من XYL Cytoseal (ريتشارد آلان ، والعلم) إلى الشرائح وتطبيق ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء تقييم للKu86 المناعى ، وERCC1 CcOI باستخدام بروتوكول لنفس Pms2 ، ولكن استبدال الضد Pms2 مع الأجسام المضادة للKu86 ، وERCC1 CcOI هو موضح في الجدول أدناه. </li></ol> تقييم المقاطع الأنسجة لالخبايا نقص في التعبير عن ERCC1 ، Pms2 ، وKu86 CcOI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف ننظر أولا في أقسام الأنسجة تحت مجهر تصويري (DM - BA300) Motic للتعبير عن Pms2 ERCC1 والخبايا في الغشاء المخاطي للقولون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pms2 ERCC1 وكلاهما الإنزيمات إصلاح الحمض النووي ، وهكذا وجدوا فيها الحمض النووي في نواة الخلايا من الخبايا. يشار إلى هذا في الشكل 1 ، حيث يمثل اللون البني القولون لتلطيخ ERCC1 ، ويحدث في نوى الخلايا في سرداب. وقد أساء إلى سرداب العادي نظهر الأولى في المجهر لERCC1 ، وصمة عار البني يبين موقع ERCC1. نشير إلى أنواع الخلايا في الخبايا ، حيث &quot;الخلايا القدح&quot; تتشكل الى حد ما مثل الزجاج والنبيذ ، مع نواة في منطقة صغيرة في قاعدة الخلايا على حافة الخارجي للقبو ، وتضخم خارج الباب ، مليئة حبيبات بيضاء في الميوسين جزءا من خلية في داخل سرداب. وغيرها من نوعين من الخلايا تبدو إلى حد ما على حد سواء في الفروع لدينا الملون ، وأنها هي والخلايا المعوية enteroendocrine ، ونوى هم أيضا على الحافة الخارجية للسرداب ، في قاعدة للخلايا. في الخزعات المأخوذة من المرضى الذين لم تكن لنيوبلسا القولون ، أو في الخزعات بعيدا عن أي موقع من سرطان القولون ، وكلها تقريبا من النوى في كل الخبايا تظهر ارتفاع مستوى العادي للتعبير عن ERCC1 كما هو موضح هنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويلاحظ في توجيه ملاحظاتنا والمقاطع التي تم الحصول عليها من أنسجة المرضى الذين يعانون من الخزعات لا نيوبلسا القولون لمستويات من التعبير عن Pms2 ، ERCC1 ، CcOI Ku86 أو في الغشاء المخاطي للقولون طبيعية. يمكننا أن نلاحظ كل الخبايا في قسم الأنسجة الطبيعية ، مع عدسة 40X الهدف ، ونحن نمضي ببطء من خلال قسم الأنسجة بأكمله ونشير إلى الخبايا ، والخلايا الخلالي ، أي العقيدات اللمفاوية على الشريحة ، والعضلية و(إذا كان موجودا في خزعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشير أيضا إلى أن هناك خلايا للتو عدة في قاعدة سرداب التي هي الخلايا الجذعية. هذه الخلايا الجذعية تولد كل من الخلايا حوالي 2،000 من سرداب كامل. ويمكن للخلايا الجذعية مع طفرة أو epimutation an الاستيلاء على الخلايا الجذعية المتخصصة كله. ثم قد غيرت سرداب كله تلطيخ لانزيم المصالح (سرداب التحويل) كما نعرض في هذه الشريحة الجديدة حيث نرى الخبايا كلها قاصرة عن CcOI بجوار الخبايا التي لديها عالية من التعبير CcOI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم نعرض شريحة من مريض مصاب بسرطان القولون أو غدي مع الأورام المتقدمة. على هذه الشريحة ، بعض الخبايا وارتفاع مستوى العادي للتعبير عن ERCC1 وبعضها أقل مستويات التعبير. وصورت كل من الخبايا داخل قسم النسيج في دقة منخفضة مع عدسة الهدف 10X ، والمغطى الصور بحيث يعتبر قسم الأنسجة كله في صورة واحدة. ثم يتم ترقيم الخبايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والخبايا مع التعبير عالية من انزيم ، نموذجية من الخبايا في خزعات جيئة وذهابا حتى الآنم أي مرض السرطان ، ويطلق على مستوى &quot;4&quot; تلطيخ. مستويات أخرى هي &quot;0&quot; إذا لم يكن هناك تعبير كشفها ، &quot;1&quot; إذا كان مجرد تعبير بالكاد يمكن كشفها هو واضح ، &quot;2&quot; إذا كان هناك وجود التعبير ، ولكن عند مستوى أدنى بكثير من المستوى 4 ، و &quot;3&quot; إذا كان التعبير الحاضر عند مستوى أقل من 4 ، ولكن قوية إلى حد ما. نحن نقطة لكل شريحة على دقة الصورة زرقاء خفيفة لمدة 4 ، البرتقال الأخضر لمدة 3 ، 2 الصفراء ، والحمراء : 1 ل 0. هنا نعرض يمر مقطع من الخزعة باستخدام عدسة الهدف 40X. نحن في نقطة الخبايا على صورة دقة منخفضة. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. سرداب القولون يظهر التعبير عالية من ERCC1 في نوى الخلايا سرداب. وتم تعزيز بالتساوي كل الألوان في هذه الصورة في التباين والتشبع ، وذلك باستخدام بينت شوب برو 5. ممثل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقاطع أنسجة بديلة على شرائح منفصلة تتيح لنا أن ننظر في أقبية القولون نفسه ، مع التعبير عن اثنين من البروتينات المختلفة التي أبداها المناعية. يتم عرض صورة واحدة لطخت سرداب Pms2 وخبايا نفسه لالملون ERCC1 على المجاهر المتاخمة مع شاشات الكمبيوتر المجاورة. وهذا يسمح لنا لتحديد ما إذا كان هناك نقص مشترك لاثنين من البروتينات أو ما إذا كان القصور في كل من البروتينات ، في حين أن كل واحد متكرر ، ويحدث بشكل مستقل. لدينا قطاعات النسيج بنسبة ثلاثة في الشريحة ، بحيث يمكن التحقق من اي نقص واضح في التعبير عن بروتين بأنها قاصرة على أكثر من مقطع واحد ، وليس بسبب وجود قطعة أثرية. في الأنسجة المحيطة سرطان القولون ، وعندما يكون هناك خلل الميدانية التي تؤدي إلى السرطان ، وهناك تردد عال من الخبايا وقاصرة لERCC1 Pms2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد استخدمنا أيضا المناعية للعثور على وتيرة الخبايا وقاصرة لKu86 CcOI. على هذه الشريحة ، ونحن نذهب من خلال قسم النسيج كله لimmunostained Ku86 ، وذلك باستخدام عدسة الهدف 40X ، ويمكننا أن نرى أن بعض الخبايا قاصرة عن Ku86 في هذا القسم الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبالمثل ، على هذه الشريحة ، ونحن نذهب من خلال قسم النسيج كله لimmunostained CcOI ، وذلك باستخدام عدسة الهدف 40X ، ويمكننا أن نرى أنه ليس هناك سوى عدد معتدلة من الخبايا قاصرة عن CcOI. </li></ol>

<ol>
	<li>Slaughter, D. P., Southwick, H. W., Smejkal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+cancerization+in+oral+stratified+squamous+epithelium;+clinical+implications+of+multicentric+origin.">Field cancerization in oral stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin.</a> Cancer. 6, 963-968 (1953).</li><li>Vauthey, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+field+cancerisation+in+clinical+oncology.">Importance of field cancerisation in clinical oncology.</a> Lancet Oncol. 1, 15-16 (2000).</li><li>Bernstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+defects+in+progression+to+gastrointestinal+tract+cancers.">Field defects in progression to gastrointestinal tract cancers.</a> Cancer Lett. 260, 1-10 (2008).</li><li>Calabrese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+pretumor+progression+before+and+after+loss+of+DNA+mismatch+repair.">Colorectal pretumor progression before and after loss of DNA mismatch repair.</a> Am J Pathol. 164, 1447-1453 (2004).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Pms2+expression+in+non-neoplastic+flat+mucosa+from+patients+with+colon+cancer+correlates+with+reduced+apoptosis+competence.">Reduced Pms2 expression in non-neoplastic flat mucosa from patients with colon cancer correlates with reduced apoptosis competence.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 14, 166-172 (2006).</li><li>Huang, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+marker+for+normal+and+malignant+human+colonic+stem+cells+(SC)+and+tracks+SC+overpopulation+during+colon+tumorigenesis.">Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis.</a> Cancer Res. 69, 3382-3389 (2009).</li><li>Kim, K. M., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+reveals+a+niche:+stem+cell+succession+in+human+colon+crypts.">Methylation reveals a niche: stem cell succession in human colon crypts.</a> Oncogene. 21, 5441-5449 (2002).</li><li>Greaves, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+are+established+in+human+colonic+stem+cells,+and+mutated+clones+expand+by+crypt+fission.">Mitochondrial DNA mutations are established in human colonic stem cells, and mutated clones expand by crypt fission.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 714-719 (2006).</li><li>Nara, K., Nagashima, F., Yasui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+elevated+ultraviolet-induced+mutation+frequency+in+isolated+Chinese+hamster+cell+lines+defective+in+nucleotide+excision+repair+and+mismatch+repair+proteins.">Highly elevated ultraviolet-induced mutation frequency in isolated Chinese hamster cell lines defective in nucleotide excision repair and mismatch repair proteins.</a> Cancer Res. 61, 50-52 (2001).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+induces+mitochondrial+oxidative+stress+and+activates+NF-kB+through+multiple+mechanisms+in+HCT-116+colon+epithelial+cells.">Deoxycholate induces mitochondrial oxidative stress and activates NF-kB through multiple mechanisms in HCT-116 colon epithelial cells.</a> Carcinogenesis. 28, 215-222 (2007).</li><li>Lim, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+induced+by+reactive+oxygen+species+in+hepatocellular+carcinoma:+methylation+of+the+E-cadherin+promoter.">Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.</a> Gastroenterology. 135, 2128-2140 (2008).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+as+carcinogens+in+human+gastrointestinal+cancers.">Bile acids as carcinogens in human gastrointestinal cancers.</a> Mutat Res. 589, 47-65 (2005).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hydrophobic+bile+acids,+genomic+instability,+Darwinian+selection,+and+colon+carcinogenesis.">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li></ol>

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من المهم جدا أن يكون نسيج 3 أقسام لكل شريحة. يمكن أن تحدث فقاعات عند تطبيق وسائل الإعلام التي تحمل الأجسام المضادة ، بحيث لا يجوز بعض الخبايا أو أجزاء من الخبايا تكون ملطخة كاف لأن مجرد فقاعة منعت الضد من التفاعل مع المقطع الأنسجة. الخبايا حوالي 60 ميكرون في القطر ، وأقسام الأنسجة هي 4 ميكرون سميكة ، لذلك يمكن أن يكون هناك أقسام الأنسجة ما يصل إلى 15 خلال نفس سرداب. عادة ما يكون من الممكن العثور على خبيئة نفسه ، وذلك باستخدام مورفولوجية سرداب كدليل على أقسام متعددة الأنسجة وضعها على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الدراسات التي أجريناها مؤخرا ، لعينات الأنسجة كبيرة ، قد تلطيخ في Sequenza لا تعطي تغطية جيدة للجسم الأنسجة. في هذه الحالات ، يمكن للمرء يفضلون استخدام اليد تلوين الأنسجة ، حيث تراجع من وسائل الإعلام التي تحتوي على الأضداد : هي وضع اليد على كل عينة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرؤية واضحة للتلوين البني يظهر التعبير عن بروتين immunostained ، وتلوين الأزرق الحمض النووي تظهر على شاشة الكمبيوتر ، ويتم تعديل برنامج مجهر تصويري Motic على النحو التالي : كسب 0 ، 0 الأوفست ، وتعزيز 0 ، 255 ، 1.00 غاما ، 0 ، الحدة 1 ، 7 تصحيح الألوان ، R ، G ، B كسب 1.00 ، و R ، G ، B السطوع 0. تم تعيين دقة في 1024 x 768 ، وتمكين توازن اللون الأبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام أسلوب لدينا مع أي بروتينات يعتقد أنها مهمة في التقدم إلى سرطان القولون ، لتقييم وتيرتها من نقص ، أو ربما overexpression. عيوب في مجال سرطانات القولون المحيطة أو أورام مع الأورام المتقدمة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العيوب الميدانية هي جزء من تطور السرطان وكان أول من استخدم مصطلح &quot;cancerization الميدان&quot; عن طريق الذبح وآخرون في عام 1953 1 لوصف منطقة أو &quot;الميدان&quot; من الظهارة التي تم شروطا مسبقة من العمليات غير معروف إلى حد كبير (في ذلك الوقت) وذلك لأنها تهيئ لتحقيق التنمية من السرطان. وكان الاستخدام الأولي في سياق الإصابة بسرطانات الفم. منذ ذلك الحين ، استخدمت مصطلحات &quot;cancerization الميدان&quot; و &quot;عيب الميدان&quot; على نطاق واسع لوصف أي نوع من الأنسجة الخبيثة في مرحلة ما قبل السرطان التي الجديد من المرجح أن تنشأ ، ومفهوم cancerization ميدانية في علم الأورام السريري تلقى اهتماما متزايدا 2 . استعرضنا في الآونة الأخيرة دليل على خلل في مجال سرطان الجهاز الهضمي 3. وشملت في هذه المراجعة كانت نتائج الدراسات عشرات تقديم الأدلة الميدانية من العيوب في القولون. عيوب الحقل في الغشاء المخاطي للقولون ربما تنشأ عن طريق الانتقاء الطبيعي للخلايا متحولة أو الخلايا المعدلة epigenetically بين الخلايا الجذعية من خبايا هذه الخلايا الجذعية أن أحد ينجو من مكانة 4 الخلافة. وعدم الاستقرار الجيني أو النمط الظاهري mutator ، ربما بسبب الحد من إصلاح الحمض النووي الختان النوكليوتيدات أو إصلاح الحمض النووي عدم تطابق ، وتسريع هذه العملية (وكان ذكر سابقا عيب متكرر في Pms2 في المناطق المحيطة سرطان القولون 5). إذا ، في عدد السكان الطبيعي للخلايا الجذعية في الغشاء المخاطي للقولون ، خلية يكتسب ميزة انتقائية من خلال طفرة أو epimutation آن ، فإنها تميل إلى توسيع clonally على حساب الخلايا الجذعية المجاورة. في الغشاء المخاطي للقولون ، واحتلت مكانة الخلايا الجذعية من خلايا ≤ 5 6 التي تعطي ثم يرتفع الى جميع (2000 تقريبا) من خلايا سرداب. والاستيلاء على الخلايا الجذعية المتخصصة من خلال النتائج الخلية نوع متحولة أو تغييرها epigenetically في &quot;تحويل سرداب&quot; 7. قد تنتشر من الحيوانات المستنسخة تحور (الخبايا تحويل) في ظهارة القولون في معظم الأحيان تحدث بواسطة الانشطار سرداب 8. ويرد مثال للانشطار سرداب في الشكل 2. بهذه الطريقة رقعة من الأنسجة غير الطبيعية لذلك. ضمن مثل هذا التصحيح ، قد تحدث طفرة الثاني من نوعه بحيث تعطى سرداب يكتسب ميزة مقارنة مع غيرها من الخبايا في التصحيح ، وهذا سيوسع سرداب تشكيل clonally تصحيحا الثانوية في التصحيح الأصلي. ضمن هذا التصحيح جديد ، قد يكون تكرار العملية مرة أخرى عديدة ، وربما على مدى عقود من الزمن ، حتى تنشأ الخلايا الجذعية الخبيثة الذي يوسع clonally الى السرطان. إذا كانت هذه هي العملية العامة التي أدنوكرسنوما] القولون متفرقة تنشأ ، ثم أدنوكرسنوما] القولون وينبغي أن يرتبط عموما ، ويسبقه ، وحقول من الشذوذ. وبالتالي يمكن أن يتوقع تصحيحا لتحويلها إلى الخبايا والعيوب التي يمكن اكتشافها في المنطقة المحيطة غدي مع الأورام المتقدمة ، أو المناطق المحيطة سرطان القولون. من هذا النموذج من قبل تطور الورم ، فإن للمرء أن يتوقع العثور على تعديلات وراثية أو جينية ذات الصلة إلى ما قبل تطور الورم بين عينات من أنسجة مأخوذة من الغشاء المخاطي للقولون غير رمي في المناطق المحيطة الآفات الورمية في القولون الذي يحتمل أن تقدم إلى السرطان . على وجه الخصوص ، وعيوب في الإنزيمات إصلاح الحمض النووي ، أو في البروتينات اللازمة لموت الخلايا المبرمج ، والمساهمة في التقدم عن طريق تعزيز عدم الاستقرار الجيني ، وربما يكون من المتوقع أن تكون وجدت في حقل معيبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار لنقص في الخلايا عندما Pms2 دeficient لERCC1 وتعرض للإتلاف الحمض النووي وكيل نارا وآخرون. نمت 9 25 الثقافات الصينية خلايا المبيض الهمستر 43 - 3B ، مع كل طفرة تعطيل الجين ERCC1 إصلاح الحمض النووي ، والتعامل مع الثقافات مع وكيل الحمض النووي الضارة ، وMNNG. بين الخلايا على قيد الحياة لعلاج التلف في الحمض النووي ، تم عزل خلية واحدة من كل ثقافة وسمح لتشكيل استنساخ. كانت كل الحيوانات المستنسخة المعزولة نحو 10 ضعفا أكثر مقاومة للقتل من قبل MNNG من السلالة الأبوية. من الحيوانات المستنسخة معزولة ، ثبت أن 22 إلى خلل في إصلاح الحمض النووي عدم تطابق (MMR). تم اختبار خمسة من هذه الحيوانات المستنسخة 22 بواسطة التسلسل ، وثلاثة من الخمسة كانت قاصرة عن Pms2. وكان هذا الاختيار لعيب في Pms2 ربما بسبب نقص Pms2 تسبب مقاومة للموت الخلايا المبرمج ، وبالتالي القدرة على البقاء على الحمض النووي من التلف في الخلايا المتبقية وأضاف ERCC1 عندما كان غائبا. (عادة ، Pms2 الحمض النووي من التلف الحواس المستويات ، ويسبب موت الخلايا المبرمج للخضوع لخلايا الحمض النووي من التلف عند غير مفرطة.) وهكذا ، يتم تحديد نقص في Pms2 عندما تتعرض لERCC1 التي تعاني من نقص الخلايا للتلف الحمض النووي. وظهر في كل من الحيوانات المستنسخة معيبة ERCC1 وPms2 أن يكون حول معدل 500-1000 أضعاف أكبر طفرة عندما المشع مع الأشعة فوق البنفسجية من الخلايا الأبوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأحماض الصفراوية تسبب الاكسدة ، وكلاء الحمض النووي مضرة ومهمة في التقدم إلى سرطان القولون حمض Deoxycholic ، وهو حمض الصفراء ، ويزيد من الاكسدة من خلال توليد أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) من خلال عمليات متعددة ، بما في ذلك ضررا من 10 الميتوكوندريا. هناك أدلة حديثة أن تسبب تغيرات جينية ROS 11 ، وما لا يقل عن 15 دراسة أظهرت أن الأحماض الصفراوية ، في زيادة تركيز المرافق نظام غذائي عالي الدهون ، وإلحاق أضرار الحمض النووي 12. كما استعرض بيرنشتاين وآخرون 12 ، هناك علاقة إيجابية بين استهلاك الدهون الغذائية وسرطان القولون حدوث السرطان. تفرز الأحماض الصفراوية في الأمعاء ردا على الدهون في النظام الغذائي ، والأحماض الصفراوية بمثابة المنظفات للمساعدة في هضم الدهون. وبالتالي ، يرتبط نظام غذائي عالي الدهون مع زيادة إفراز حامض الصفراء. تركيزات مرتفعة برازي حمض الصفراء في السكان مع وجود نسبة عالية من سرطان القولون ، ويعتبر التعرض المفرط للأحماض الصفراوية بوصفها عامل خطر رئيسي لسرطان القولون التسرطن 13. الأحماض الصفراوية قد يكون سببا لعيوب في مجال القولون. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. القولون والإنشطار سرداب إلى 3 الخبايا. استنتاج تم العثور على وتيرة عالية من الخبايا نقص في الجينات وإصلاح الحمض النووي ERCC1 Pms2 (مطلوب أيضا لPms2 موت الخلايا المبرمج) في حقل العيوب الكبيرة المحيطة سرطان القولون. قد وأوجه القصور في ERCC1 Pms2 (نتيجة للتغيرات جينية أو طفرات) أن الخطوات في وقت مبكر من عدم الاستقرار الجيني المركزية لتقدم لسرطان القولون.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

في التسرطن ، يتم التعرف على &quot;عيب الميدان&quot; سريريا بسبب نزوع عال من الناجين من بعض أنواع السرطان الأخرى لتطوير الأورام الخبيثة من نوع النسيج نفسه ، وغالبا في مكان قريب. وقد أشارت هذه العيوب في مجال سرطان القولون. ينبغي للشذوذ الجزيئية التي هي المسؤولة عن وجود خلل في القولون مجال قابلة للكشف عنها في وتيرة عالية في الأنسجة الطبيعية المحيطة تشريحيا غدية أو القولون المحيطة غدي مع الأورام المتقدمة (وأيضا على طريقة لسرطان القولون) ، ولكن في ذات التردد المنخفض في الغشاء المخاطي للقولون من مرضى الأورام دون القولون. المناعية به ، تم العثور على الخبايا بأكمله في غضون 10 سم على كل جانب من أدنوكرسنوما] القولون أو القولون neoplasias المتقدمة أن تخفض بشكل متكرر أو غائبة في التعبير عن اثنين من البروتينات إصلاح الحمض النووي ، Pms2 و / أو ERCC1. Pms2 هو بروتين دور مزدوج ، ونشط في إصلاح الحمض النووي وكذلك عدم تطابق حسب الحاجة في موت الخلايا المبرمج للخلايا الحمض النووي من التلف مع الزائدة. ERCC1 نشطة في إصلاح الحمض النووي الختان النوكليوتيدات. فإن التعبير غائبة أو تخفيض كل من ERCC1 Pms2 وخلق خلايا مع كل زيادة القدرة على البقاء على قيد الحياة (مقاومة الخلايا) ، وزيادة مستوى التحولية. التعبير غائبة أو تخفيض كل من ERCC1 وPms2 ومن المرجح خطوة في وقت مبكر من التقدم إلى سرطان القولون. DNA الجينات إصلاح Ku86 (نشط في الحمض النووي غير المتجانسة نهاية الانضمام) والوحدة الفرعية السيتوكروم أوكسيديز ج كان لي (المشاركة في موت الخلايا المبرمج) كل أفيد أن انخفض في التعبير المخاطية في المناطق القريبة من سرطان القولون. ومع ذلك ، أظهر التقييم المناعى من مستوياتها المنخفضة في التعبير فقط للترددات متواضعة من الأقبية لتكون قاصرة في التعبير عنها في مجال عيب المحيطة سرطان القولون او القولون المحيطة الأورام المتقدمة. نعرض هنا ، لدينا وسيلة لتقييم الخبايا للتعبير عن ERCC1 ، Ku86 ، وPms2 CcOI. نظهر أن تواتر الخبايا كلها قاصرة عن Pms2 ERCC1 وغالبا ما تكون كبيرة كما 70 ٪ إلى 95 ٪ في 20 سم طويلة المناطق المحيطة نيوبلسا القولون ، في حين تردد في أقبية قصور Ku86 له قيمة وسيطة من 2 ٪ وتواتر الخبايا نقص في CcOI له قيمة وسيطة من 16 ٪ في هذه المناطق. القولون بأكمله هو 150 سنتيمترا (حوالي 5 أقدام) ، وحوالي 10 مليون الخبايا في طبقته المخاطية. الخلل في Pms2 ERCC1 المحيطة وسرطان القولون وبالتالي يمكن أن تشمل 1000000 الخبايا. أنه من المعيب أن سرداب ينشأ سرطان القولون.

Watch this Scientific Journal Video about Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer at JoVE.com

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

التعبير خفضت / غائبة من Pms2 و / أو في أقبية ERCC1 بأكمله هو حدث متكرر خلال 10 سم على كل جانب من أدنوكرسنوما] القولون ، من المرجح أن أساس وجود عيب في الميدان مع التحولية عالية وتطور الى الاصابة بالسرطان. نقص في Ku86 CcOI أو هو أقل بكثير من هذه العيوب المتكررة في الحقل.

نقص Pms2 ، ERCC1 ، Ku86 ، CcOI عيوب في الميدان خلال التقدم إلى سرطان القولون

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  University of Arizona, Tucson. التعبير خفضت / غائبة من Pms2 و / أو في أقبية ERCC1 بأكمله هو حدث متكرر خلال 10 سم على كل جانب من أدنوكرسنوما] القولون ، من المرجح أن أساس وجود عيب في الميدان مع التحولية عالية وتطور الى الاصابة بالسرطان. نقص في Ku86 CcOI أو هو أقل بكثير من هذه العيوب المتكررة في الحقل.

Video: Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

غرس Ferumoxides إعتبر الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة في عيوب الغضروف

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

تحديد مساهمة لأنظمة الطاقة أثناء ممارسة الرياضة

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

قياس القوة خلال تقلص العضلات لتقييم وظيفة في يرقات اسماك الزرد

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

تتبع الزمني للتقدم دورة الخلية باستخدام التدفق الخلوي دون الحاجة إلى مزامنة

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

مورين الكولين تعاني من نقص، تستكمل اثيونيني (الرفيق) النظام الغذائي النموذجي لإصابة الكبد المزمنة

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction defects can be assessed by tracking methylene blue dye flow within the urinary system. Methylene blue dye is injected into the renal pelvis of perinatal embryonic kidneys and dye flow is monitored from the renal pelvis of the kidney through the ureter and into the bladder lumen after applying hydrostatic pressure. Dye accumulation will be evident in the bladder lumen of the normal perinatal urinary tract, but will be constrained between the renal pelvis and the end point of an abnormal ureter, if urinary tract obstructions occur. This method facilitates the confirmation of urinary tract junction obstructions and visualization of hydronephrosis and hydroureter. This manuscript describes a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis to confirm urinary tract junction obstructions.

Methylene blue dye injection into the renal pelvis facilitates the assessment of urinary tract junction obstruction defects during mouse embryonic urinary tract development. Here, a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis is described.

تقييم العيوب عرقلة مفرق المسالك البولية عن طريق حقن صبغة أزرق الميثيلين

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...