الكتاب ليس لديهم الاعترافات.

وتمت الموافقة على الإجراءات التجريبية والمعاملة الأخلاقية للحيوانات من جامعة بيتسبرغ IACUC (بروتوكول # 1104674). 1. إعداد G6PD تلطيخ خليط ملاحظة: تأكد من أن تركيز النهائي من كل الكواشف هي على النحو التالي؛ 5 ملي الجلوكوز 6 فوسفات (G6P)؛ 2 مم NADP، 5 ملي MgCl 2، 0.35 ملي 1-ميثوكسي-5-methylphenazinium كبريتات الميثيل (MMPMS) و 0.8 ملي NBT. 1،8،9 لكل كاشف تم اشتقاق التركيز الأولي ل40 مل الحجم النهائي. وقد الحلول الطازجة وتستخدم كل يوم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من 200 ملي درجة الحموضة 7.4 العازلة الفوسفات (PB) إلى 35 مل من أكتوبر المتوسطة في أنبوب 50 مل ويهز بقوة. تأكيد مع ورقة الأس الهيدروجيني أن الحل هو ~ 7.4 درجة الحموضة. إن لم يكن تجاهل الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 61 ملغم G6P حل في 0.94 مل من 200 ملي PB، 61 ملغ NADP حل في 0.94 مل من 200 ملي PB، و 41 ملغ MgCl 2 الذائبة في 0.96 مل من 100 ملي PB. نؤكد من جديد أن الرقم الهيدروجيني ~ 7.4 الطرافةح الأس الهيدروجيني ورقة. إن لم يكن ~ 7.4، تجاهل الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ملغ من MMPMS الذائبة في 0.25 مل من 200 ملي PB (7.4 درجة الحموضة). هزة بقوة مما أدى خليط التفاعل لتوليد جناسة الأحمر الداكن واضح. إذا كان هذا الحل هو عكر، يجب التخلص من الخليط. يتم تغليف الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل في احباط للحد من التعرض للضوء. تخزين خليط التفاعل في RT في حين أن العنصر الأخير، NBT، يتم إعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منفصل حل 5 ملي NBT بإضافة 0.4 مل اللامائية الفورماميد ثنائي ميثيل (DMF) و 0.4 مل الإيثانول اللامائي إلى 164 ملغ من NBT في أنبوب 2 مل مع غطاء O-الحلبة. إغلاق غطاء فضفاض (لا مغلقة بإحكام) وتقديم حل ليغلي قوية في حمام الزيت حتى NBT في الحل. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للNBT solubilized لتبرد إلى RT ثم قم بإضافة كل من الحل لخليط التفاعل أكتوبر ويهز بقوة للحصول على حل واضح. مراقبة تغير لون الحل من الأولي البرتقالي والأحمر إلى أحمر غامق أو purpلو اللون مع مرور الوقت. هذا امر طبيعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الخليط النهائي G6PD تلطيخ في 37 ° C غرفة دافئة لمدة 1 ساعة قبل الاستخدام. </li></ol> 2. علاج الحيوان والأنسجة مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج عمره 6 أسابيع C57BL / 6 الفئران الذكور مع DNA عامل ضار، على سبيل المثال، 10 ملغ / كغ azoxymethane (أوم) في حجم 200 ميكرولتر PBS عن طريق الحقن الملكية الفكرية. علاج السيطرة على الفئران مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق الحقن الملكية الفكرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 90 يوما، الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم كما وافقت عليها بروتوكول IACUC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جراحيا فتح تجويف البطن من أعلى بقليل من فتحة الشرج إلى قاعدة القص. تحريك الأمعاء الدقيقة من تجويف الجسم ولكن لا استئصال ذلك. استئصال الأمعاء السفلى أسفل الأعور إلى المستقيم. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة بعناية على طول جانب واحد من القولون باستخدام مقص تشريح الصغرى وإزالة البراز من القولون فتح طريق الغسيل مع برنامج تلفزيوني العقيمة نظيفة. لفة السويسرية المكوسد القولون مع الجانب اللمعية التي تواجه الخارج، ووضعه في قالب الأنسجة. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما تزج القولون في أكتوبر المتوسطة ومكان العفن في ديوار التي تحتوي على السائل N 2. عقد القالب بحيث قاعدة من البلاستيك ليست سوى في اتصال مع السائل N 2 حتى يتم تجميد المتوسطة أكتوبر الصلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين كتلة الأنسجة المجمدة في -80 حتى قطع الأجزاء المجمدة. لا تستخدم أي تثبيتي، الذي من شأنه أن يؤدي إلى تثبيط انزيم G6PD. </li></ol> 3. إعداد أقسام المجمدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أقسام الأنسجة المجمدة في سمك 7 ميكرون باستخدام ناظم البرد في -25 ° C. قطع 4 متتالية 7 ميكرون أقسام ووضع اثنان منهم على نفس الشريحة (الشكل 1). إعداد 2 الشرائح، أو أربع مرات متتالية 7 ميكرون أقسام لتمثيل مستوى واحد من القولون (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر المستوى التالي مع مسافة لا تقل عن&gt; 50 ميكرون من القسم الأخير من العلاقات العامةمستوى evious. ضمنت هذه المسافة التي الخبايا المقررة لكل مستوى لم يكرر بعضها البعض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمسح كثيرا النصل ناظم البرد مع الإيثانول بنسبة 100٪ لإزالة بقايا أكتوبر التي تتراكم خلال عدة قطاعات. قبل أن يتم استئناف باجتزاء، ومحو شفرة الجافة مع ورقة مجفف الاستاتيكيه لتبديد المتراكمة تهمة ثابتة. متجر الشرائح مع أقسام المجمدة في -80 درجة مئوية. </li></ol> 4. تلطيخ قسم الأنسجة المجمدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفذ رد فعل انزيم الكيمياء النسيجية في 37 ° C غرفة دافئة مع ارتفاع نسبة الرطوبة. ملاحظة: محاولة التفاعل الأنزيمي في فرن الحضانة أو على أكثر دفئا الشريحة أدت إلى الفقراء وغير متناسقة تلطيخ G6PD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء الآبار للتلوين الأنسجة باستخدام اثنين من 1.5 سم × غسالات الصلب 0.15 سم (الداخلية الارتفاع قطر ×) التي تم المستعبدين معا باستخدام السيليكون الشحوم (الشكل 1). قطع parafilm لتتناسب مع قاعدة من البئر مع مركز قطع والمكان جيداد على قسم الأنسجة على الشريحة. ملاحظة: parafilm على الجزء السفلي من غسالة يخلق ختم بين الشرائح والغسالة التي تحافظ على مزيج لزج G6PD تلطيخ على قسم الأنسجة. هذا بناء يعطي بشكل جيد مع 0.4 - حجم 0.5 مل بحيث يكون كل قسم الأنسجة في الدراسة يتلقى نفس الحجم من رد فعل G6PD خليط تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شرائح الأنسجة المجمدة عند 37 درجة مئوية في غرفة دافئة لمدة 10 دقيقة. في 37 ° C، إضافة G6PD تلطيخ خليط التفاعل إلى كل قسم الأنسجة بشكل جيد (2 أقسام لكل شريحة) لمدة 45-50 دقيقة. إزالة الشرائح من غرفة دافئة، ورفع بعناية الآبار الفولاذ المقاوم للصدأ من الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الشرائح على الحافة الطويلة للسماح وسط التفاعل لاستنزاف. مكان الشرائح في 100 ملي PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 30-60 دقيقة لإزالة G6PD تلطيخ خليط التفاعل من الأنسجة دون إزعاج تلطيخ الأنسجة. غمر الشرائح في الماء المقطر لمدة 5-10 دقائق لإزالة الأملاح PB </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الأنسجة عن طريق الإضافةجي الفلوري جل من قطارة على الأنسجة والانتظار ~ 30 دقيقة حتى يجف. تجنب الفقاعات التي يمكن أن يتغلب على تحديد الخبايا تحور. ملاحظة: إذا كان شكل فقاعات، ويمكن تكرار الإجراء بعد إزالة جل الفلوري عن طريق نقع في الماء المقطر. لا تستخدم زلات غطاء لأنها تميل إلى فقاعات الهواء الفخ. </li></ol> 5. تحديد G6PD المسخ الأقبية والطفرة التردد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الشرائح لG6PD الخبايا متحولة تحت المجهر الضوئي. ملاحظة: المعايير المستخدمة لتحديد سرداب متحولة تماما هي: (أ) كان سرداب كامل خال من اللون الأزرق. (ب) كان الهيكل الخارجي للسرداب سليمة، (ج) لوحظ سرداب متحولة على المتاخمة 7 ميكرون أقسام و، (د) كان اثنين من المراقبين لتحديد نفس سرداب كما متحولة. تحسب المسوخ لوحظ على المتاخمة 7 ميكرون أقسام كما متحولة واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة كل سرداب متحولة G6PD في التكبير 40X والتسويقي الصور باستخدام كاميرا 5.0 megapixel معبرامج التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العدد الإجمالي للالخبايا درست في الماوس عن طريق اختيار القسم تمثيلي لكل الماوس من مستوى مع مساحة أصغر وصورة ذلك في التكبير 10x (الشكل 1C). ملاحظة: مستوى يمثل أربع مرات متتالية 7 ميكرون أقسام (1D الشكل)، والتي بسبب قربها غالبا ما تظهر تحور الخبايا على أكثر من مقطع واحد. يتم فصل المستويات&gt; 50 ميكرون لتصور الخبايا من مناطق مختلفة من القولون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح كل ملف صورة والاعتماد بصريا عدد من الخبايا على مستوى عن طريق تحليل الملفات (كما هو موضح في الشكل صناديق 1C). سوف تختلف ملفات الصور في عدد من الأقبية لوحظ من ما يصل الى 20 ل&gt; 300 الخبايا في ملف واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضاعفة العدد الإجمالي للالخبايا من مستوى (الشكل 1C) المحدد لكل فأر من قبل عدد من المستويات فرزهم عن الخبايا G6PD متحولة لكل القولون. على سبيل المثال، العدد الإجمالي لل1250 الخبايا في المستوى المختار مضروبا 8 مستويات فحص لالخبايا متحولة تساوي العد الكلي 10،000 الخبايا. تقييم ما لا يقل عن 10،000 الخبايا لكل القولون للتحليل الإحصائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين عدد من المسوخ التي لوحظت في كل من الحيوانات من قبل عدد من الخبايا فحص لحساب MF لكل معاملة. مستوى MF الخلايا الجذعية الخلفية في الفئران غير المعالجة هو &lt;0.1x10 -4 (الجدول 1)، وهي قريبة لتلك التي ذكرت سابقا في C57BL / 6 الفئران. 11 </li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li><li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells.">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

غالبا ما يتم تحديد تأثير السمية للمركب بقدرته على تعديل الحمض النووي. ويتم ذلك عادة من خلال عزل الأنسجة وقياس مستوى عالمي من الحمض النووي adducts. لAOM، وهذا ينطوي على قياس O 6 -methylguanine adducts في القولون. باستخدام هذه المعلومات النهج على الضرر في غضون أنواع معينة من الخلايا، مثل في محراب الخلايا الجذعية، يتم فقدان. بالإضافة إلى ذلك، ناتج إضافة DNA ليست هي نفسها كما طفرة منذ فقط مجموعة فرعية صغيرة من adducts يتم تحويلها في نهاية المطاف إلى الطفرات ثابتة. 12 ونحن نقدم هنا التفاصيل لتحديد بتكاثر الطفرات الخلايا الجذعية في القولون على أساس أسلوب الأولي التي وصفها غريفيث وآخرون. (1) وعلى أساس G6PD تلطيخ التي وضعتها VanNorden. 4،8،9،13،14 هناك العديد من الخطوات الهامة لهذا الأسلوب انزيم الكيمياء النسيجية للحصول على نتيجة قياس الكمي. هو واحد في باجتزاء الأنسجة. بشكل ملحوظ أكثر الطائفة الأنسجةيجب أن تتولد الأيونات وتحليلها مما سيكون ذلك عادة مع H &amp; E التحليل النسيجي. توصلنا إلى أن 7 ميكرون أقسام أتاحت أفضل G6PD تلطيخ بعد تقييم 5، 6، 7، 8 و 10 ميكرون أبواب سميكة. ثانيا، تلطيخ العدد اللازم من أقسام الأنسجة القيمة المطلوبة خليط التفاعل استنساخه. وجدنا استخدام البولي فينيل الكحول (PVA) المستخدمة في بروتوكول الأصلي ليكون إشكاليا لأنه لزج جدا في النسب المئوية الحل (18٪ وزيادة) اللازمة لتسهيل تفاعل إنزيم الكيمياء النسيجية في حين منع نشر انزيم G6PD من الأنسجة. وقد أنجز الإذابة أفضل من الكواشف والسيطرة على درجة الحموضة عن طريق استبدال PVA مع أكتوبر المتوسطة، والذي يحتوي على 10٪ بولي. درجة الحموضة يمكن تحديدها بدقة مع ورقة الأس الهيدروجيني وإذا كان الرقم الهيدروجيني ليست قريبة إلى 7.4، يتم تجاهل حل دون إضاعة عينة الأنسجة الثمينة والوقت. أدى هذا التغيير إلى الأفضل ومخام تلطيخ ثابت في أقسام الأنسجة. في الرقم الهيدروجيني (7،2-7،4) المطلوبة لقياس النشاط G6PD، خليط التفاعل الكامل لديه واضح اللون البرتقالي والاحمر العميق مميزة، والتي سوف تتغير ببطء إلى اللون الأرجواني. بغض النظر عن اللون، وإذا وعكر الحل تلطيخ رد فعل يجب التخلص منها لأنها لن تحمل تلطيخ جيد. وجدنا أن بعض الكثير من أكتوبر المتوسطة قدمت مخاليط خارج نطاق درجة الحموضة المطلوبة لذلك فإنه من المستحسن لاختبار الكثير بإضافة PB (7.4) إلى متوسطة أكتوبر وتحديد درجة الحموضة. كنا أيضا MMPMS كما اقترح سابقا، 8،9 بدلا من كبريتات الميثيل 5-methylphenazenium المستخدمة في الورقة الأصلية 1 للقضاء على الحساسية للضوء من خليط التفاعل تلطيخ G6PD. أخيرا، طريقة لاستخلاص MF هي رواية بالمقارنة مع الطرق الأخرى المستخدمة سابقا. 1،2 التحف تلطيخ يمكن أن يؤدي إلى تحديد هوية المحتمل لG6PD كاذبة الخبايا متحولة. لاستكشاف رمشكلته، قمنا بتحليل 4 متجاورة 7 ميكرون أقسام الأنسجة التي تسمح لرؤية نفس سرداب تحور في قسم الأنسجة أكثر من واحد (الشكل 4D). هذا التحقق يقلل من فرص تلطيخ التحف التي تؤثر على تحليل MF. أيضا، يستخدم أسلوب لدينا قيمة الفعلية من إجمالي الخبايا تحسب لتقدير العدد الإجمالي للالخبايا تحليلها عند حساب MF. بسبب هيكل سرداب فريدة من نوعها وجدت في الأمعاء الصغيرة والكبيرة، فمن الممكن لتحديد موقع الخلايا الجذعية والنسب خلية لكل سرداب. A قيدا رئيسيا على النهج هو أنه يقتصر على الأمعاء لأن مورفولوجيا الأنسجة الأخرى ليست محددة، وكذلك في القولون. ولذلك، فإنه ليس من الممكن تحديد الخلايا الجذعية MF في معظم الأنسجة الأخرى التي هي عرضة للسرطان. منذ الفحص هو الفحص المظهري بناء على فقدان G6PD النشاط الأنزيمي، وMF الفعلي في عدد الخلايا الجذعية سوفتكون أعلى مما كنا الإبلاغ عن G6PD بسبب طفرات في قواعد تمايل والطفرات النقطة التي لا تؤثر تأثيرا كبيرا على النشاط الأنزيمي. في حين أن هناك قيود وتحديات لتلطيخ للنشاط G6PD في أنسجة القولون لتحديد الطفرات الجسدية الخلايا الجذعية، وأدخلت تعديلات كبيرة في هذه الورقة إلى تعزيز جدوى استخدام هذه الطريقة. وجدنا أن هذه التغييرات عززت استنساخ توليد كاشف G6PD تلطيخ وقياس MF. وعلاوة على ذلك، تلطيخ لG6PD نشاط انزيم كعلامة للجسدية الطفرات الخلايا الجذعية لا يحتاج الى خبرة في المناعية تلطيخ كما أن اختبار للتعبير عن metallothionein، 15 علامة محتملة أخرى من الطفرات الجسدية الخلايا الجذعية. في المستقبل، سنقوم بتحليل القولون الطفرات الخلايا الجذعية في الفئران التي عولجت مع مركبات البيئية، مثل 2-الأمينية-1-ميثيل-6 phenylimidazo [4،5-ب] البيريدين (PHIP) والأمينات العطرية الأخرى الموجودة في اللحوم المشوية، التي ترتبط مع سرطان القولون البشري.

ويعتقد أن سرطان القولون لإشراك التعرض للعوامل البيئية والمكونات الغذائية التي يمكن أن تضر الحمض النووي وإنتاج تفعيل الطفرات الجسدية في الجينات المسرطنة (مثل ß-catenin) أو تعطيل الطفرات في جينات الورم القامع (على سبيل المثال، APC). ومن المفترض أن هذه الطفرات الهامة تحدث في الخلايا الجذعية القولون. بسبب بنية فريدة من سرداب ظهارة القولون، فمن الممكن لقياس الطفرات الخلايا الجذعية في القولون بعد تعريض الحيوانات للمواد الكيميائية المرتبطة القولون التسرطن. كما أن الكثير من الانزيمات المرتبطة X بمثابة مؤشرات لالطفرات التي تحدث في الخلايا الجذعية، حيث أن الطفرات سوف تكون موجودة في جميع الخلايا داخل سرداب. سابقا، وقد نشرت إجراء يدل على أن المواد الكيميائية التي تحفز على أورام القولون في الفئران ولدت أيضا جسدية الطفرات الخلايا الجذعية في القولون عن طريق تحليل الطفرات في نسبة الجلوكوز 6 فوسفات نازعة المرتبطة X (G6PD) الجين 1-3طريقة الكمي حدوث الطفرات الجسدية العشوائية في الخلايا الجذعية القولون دون أي ضغط الاختيار. الإجراء ينطوي على إنتاج غير المثبتة أقسام القولون المجمدة من الفئران التي عولجت والسيطرة والتعرف على الخبايا خالية من الخلايا التي تنتج النشاط G6PD وظيفية. هذه الخبايا تحور، والتي تظهر أبيض، تشير إلى أن التحور حدث في الخلايا الجذعية التي أدت إلى النسل أيضا بإيواء جين G6PD تحور. في فحص الأنزيمية، ويمكن G6PD الخبايا متحولة ناقصة لا أكسدة الجلوكوز 6 فوسفات، وهو مطلوب للحد من نتروبلو الأزرق نيترو (NBT). عندما انزيم G6PD هو وظيفي، ويتم تقليل NBT في خليط تلطيخ لformazan غير قابلة للذوبان والرواسب، وتراكم في موقع الإنزيم و &quot;تلطيخ&quot; الخلايا الزرقاء. الخلايا التي هي المسوخ G6PD تبقى بيضاء على النقيض من الأزرق الملون الخبايا نوع البرية. يقيس هذا الأسلوب الطفرات التي لديها &quot;لاغيا&quot; النمط الظاهري. لأن ENإنزيمات، مثل G6PD، يمكن نزع فتيل خارج الخلايا على قسم الأنسجة غير المثبتة إذا وضعت المقاطع في محلول مائي، فمن الضروري لتحقيق الاستقرار في الانزيم في أقسام الأنسجة لتحليلها. 4 إن استقرار الانزيم في الأنسجة يجب ألا تتداخل مع انتشار جزيئات صغيرة كاشف اللازمة للتفاعل G6PD الأنزيمية. لقد قدمت عددا من التغييرات الهامة لإجراء الأصلي. تم تغيير وسيلة لتلطيخ الأنزيمية حاسم من البولي فينيل الكحول لالأمثل قطع درجة الحرارة مجمع (أكتوبر)، مما يسهل السيطرة درجة الحموضة والإذابة من المكونات المستخدمة في الفحص. يتم تنفيذ تلطيخ باستخدام 0،4-0،5 مل الآبار مصنوعة من الفولاذ المقاوم للغسالات بحيث حصل كل قسم الأنسجة نفس الحجم من خليط التفاعل G6PD. وقد تم وضع إجراءات لتقدير عدد من الخبايا في قسم تصوير توفر عينة كبيرة من انسجة القولون دون الحاجةالعد يدويا&gt; 10 5 الخبايا لكل القولون. تحليل المجاورة 7 ميكرون أقسام الأنسجة يتيح التصور من سرداب متحولة على أكثر من شريحة واحدة، مما يقلل من التحف تلطيخ المحتملة. هذه التغييرات تجعل الإجراء أكثر كفاءة واستنساخه. باستخدام هذا البروتوكول المعدل، لقد كميا وتيرة الطفرة في الخلايا الجذعية القولون بعد تعرض C57BL / 6 الفئران لazoxymethane، وهي مادة مسرطنة القولون المعروفة في القوارض. 5-7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitroblue tetrazolium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose-6-phosphate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm room&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of  colonic stem cell mutations

القدرة على قياس الطفرات الخلايا الجذعية هي أداة قوية لتحديد في عدد السكان خلية بالغ الأهمية إذا، وإلى أي مدى، يمكن أن مادة كيميائية تحفز الطفرات التي تؤدي المحتمل إلى السرطان. استخدام لفحص الأنزيمية لتحديد الطفرات الخلايا الجذعية في العاشر مرتبطة نازعة الجلوكوز 6 فوسفات الجينات ذكرت سابقا. 1 هذا الأسلوب يتطلب إعداد أقسام المجمدة وحضانة الأنسجة مقطوع مع خليط التفاعل التي تعطي اللون الأزرق إذا كانت الخلايا تنتج وظيفية نازعة الجلوكوز 6 فوسفات (G6PD) الانزيم. إن لم يكن، والخلايا تظهر بيضاء. قمنا بتعديل خليط التفاعل باستخدام الأمثل مجمع قطع درجة الحرارة (أكتوبر) المتوسطة بدلا من البولي فينيل الكحول. هذا يسهل قياس درجة الحموضة، ويزيد من ذوبان المكونات تلطيخ G6PD ويحد من انتشار انزيم G6PD و. لإثبات أن طفرة حدثت في الخلايا الجذعية، يجب على سرداب كامل تفتقر G6PD الأنزيميةالنشاط. إلا إذا تؤوي الخلايا الجذعية طفرة G6PD المظهرية وجميع ذرية في سرداب تفتقر G6PD النشاط الأنزيمي. للتعرف على خبايا مع طفرة الخلايا الجذعية، وقطعت أربعة أقسام المجمدة المجاورة متتالية (مستوى) في 7 ميكرون سمك. هذا النهج جعل التخفيضات المجاورة يوفر التشكل التي سرداب وتحور بشكل كامل منذ وسيراعى في نفس سرداب تحور في الفروع المجاورة. وكانت الشرائح مع عينات الأنسجة التي كانت أكثر من 50 ميكرون وبصرف النظر مستعدة لتقييم ما مجموعه&gt; 10 4 الخبايا في الماوس. تردد طفرة هو عدد المرصودة تحور (أبيض) الخبايا ÷ من قبل عدد من النوع البري (الأزرق) الخبايا في مجموعة العلاج.

القدرة على قياس القولون الطفرات الخلايا الجذعية في الحيوانات يوفر طريقة فريدة من نوعها لربط الطفرات إلى تحريض السرطان. عادة، فمن المفترض أن الخطوة الحاسمة في التسرطن ينطوي على تفعيل الطفرات في الجينات المسرطنة و / أو تعطيل الطفرات في الجينات الكابتة للورم. نحن حقن C57BL / 6 الفئران مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو 10 مغ / كغ AOM في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. AOM هو مادة مسرطنة معروفة القولون. 5-7 في 90 يوما حللت كولون للطفرات الخلايا الجذعية. مطلوب هذا الوقت للسماح للخلايا الجذعية لملء تماما سرداب، وفقط عندما يكون سرداب كامل لا تنتج G6PD هو سرداب تحديدها على أنها متحولة الخلايا الجذعية. وترد أمثلة من الخبايا متحولة تماما في الشكل 2. ويوضح الشكل اثنين من التوجهات المختلفة (الرأسي والأفقي) من الخبايا التي تحدث في إعداد الأجزاء المجمدة. وجهة النظر العمودي وغمط محور طويل من سرداب في حين يوفر الأفقي وجهة نظر الجانب. صرخةنقاط التي النوع البري لG6PD وصمة عار زرقاء مع بعض البيض الذي يرجع إلى إنتاج خلايا المخاطية من القدح. عن طريق حساب عدد من الخبايا على شريحة (الشكل 1)، وعدد من الخبايا تحور، وMF عن الخبايا متحولة يمكن حساب. لا وحظت الخبايا تحور في أي من&gt; 100،000 الخبايا نوع البرية تفتيشها في السيطرة (PBS المعالجة) الفئران. وضعنا MF عن السيطرة على الفئران أن تكون &lt;0.1x10 -4، وهي قريبة لتلك التي ذكرت سابقا لC57BL / 6 الفئران. 1 <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53240/53240fig1.jpg" /> الشكل 1. إعداد الشرائح لG6PD تلطيخ كاشف. (A) غسالات اثنين من 1.5 سم × 0.15 سم الصلب (الداخلية قطر × الارتفاع) ومختومة معا باستخدام السيليكون الشحوم. ثم يتم قطع Parafilm لتتناسب مع قاعدة من البئر مع مركز قطع ووضع جيد المرحل السويسري أقسام الأنسجة القولون علىالشريحة. يتم وضعها (B) قسمان الأنسجة المجاورة من 7 ميكرون تخفيضات على نفس الشريحة والملون في نفس الوقت. شريط مقياس: 1.0 سم. يتم تحديد (C) وعدد من الخبايا في القسم من خلال النظر في الأنسجة في التكبير 10x. عدد الحقول (كما هو موضح مربعات) يختلف مع كل قسم. يتم تحديد عدد من الخبايا في كل حقل من قبل العد البصرية وتضاف إلى إعطاء عدد من الأقبية لهذا المستوى. يعرف (D) A المستوى الذي كان عليه أربع مرات متتالية 7 ميكرون أقسام الأنسجة. مستويات هي&gt; 50 ميكرون بعيدا لتجنب التداخل مع الخبايا المقررة سابقا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53240/53240fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53240/53240fig2.jpg" /> الشكل 2. أمثلة التمثيليةمن الخبايا تحور لوحظ في AOM تعامل C57BL / 6 الفئران الذكور التي لا تنتج G6PD وظيفية. يتم تعريف الخبايا G6PD متحولة بشكل جيد ولكن تخلو تقريبا من وصمة عار الزرقاء. نوع الخبايا البرية التي تشكل أكثر من الخبايا في الميدان الأزرق / الأرجواني يشير إلى النشاط الأنزيمي G6PD. الحجم: 10 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53240/53240fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> علاج </td><td> الإصابة الخبايا متحولة </td><td> الخبايا متحولة ل </td><td> مجموع الخبايا حللت </td><td> MF (× 10 -4) </td></tr><tr><td> مذيب </td><td> 0/6 الفئران </td><td> 0 </td><td> &gt; 10 5 </td><td> &lt;0.10 </td></tr><tr><td> AOM </td><td> 10/12 الفئران </td><td> 43 </td><td> 96821 </td><td>60؛ 4.44 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. تردد الطفرة في azoxymethane غير المعالجة أو المعالجة C57BL / 6 الفئران. 12 القولون الطفرات الخلايا الجذعية في WT C57BL / 6 الفئران بعد 90 يوما من التعرض إلى 10 مغ / كغ azoxymethane (أوم) أو السيطرة المذيبات.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations at JoVE.com

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

تقدير حجم الجذعية القولون الطفرات خلية

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Google

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.5K Views.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Video: Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

جيل من الفئران القلب منظم ضربات القلب المجاميع خلية استنادا ES-الخلوي البرمجة في الجمع مع Myh6-المروج-اختيار

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

الكمي الآلي للخلية المكونة للدم - التفاعلات خلية انسجة في صور النسيجية من Undecalcified العظام

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

بروتوكولات لتحليل دور خلايا بانيت في التجديد في الأمعاء الفئران باستخدام شرطي<em&gt; جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن</em&gt; ماوس نماذج

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

تقييم الضرر الناجم عن الشيخوخة و في فيفو إعادة برمجة في العضلات الهيكلية

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

رسم خرائط التنظيم المكاني الناشئ للخلايا الثديية باستخدام الأنماط الدقيقة والتصوير الكمي

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...