الكتاب ليس لديهم الاعترافات.

وتمت الموافقة على الإجراءات التجريبية والمعاملة الأخلاقية للحيوانات من جامعة بيتسبرغ IACUC (بروتوكول # 1104674). 1. إعداد G6PD تلطيخ خليط ملاحظة: تأكد من أن تركيز النهائي من كل الكواشف هي على النحو التالي؛ 5 ملي الجلوكوز 6 فوسفات (G6P)؛ 2 مم NADP، 5 ملي MgCl 2، 0.35 ملي 1-ميثوكسي-5-methylphenazinium كبريتات الميثيل (MMPMS) و 0.8 ملي NBT. 1،8،9 لكل كاشف تم اشتقاق التركيز الأولي ل40 مل الحجم النهائي. وقد الحلول الطازجة وتستخدم كل يوم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من 200 ملي درجة الحموضة 7.4 العازلة الفوسفات (PB) إلى 35 مل من أكتوبر المتوسطة في أنبوب 50 مل ويهز بقوة. تأكيد مع ورقة الأس الهيدروجيني أن الحل هو ~ 7.4 درجة الحموضة. إن لم يكن تجاهل الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 61 ملغم G6P حل في 0.94 مل من 200 ملي PB، 61 ملغ NADP حل في 0.94 مل من 200 ملي PB، و 41 ملغ MgCl 2 الذائبة في 0.96 مل من 100 ملي PB. نؤكد من جديد أن الرقم الهيدروجيني ~ 7.4 الطرافةح الأس الهيدروجيني ورقة. إن لم يكن ~ 7.4، تجاهل الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ملغ من MMPMS الذائبة في 0.25 مل من 200 ملي PB (7.4 درجة الحموضة). هزة بقوة مما أدى خليط التفاعل لتوليد جناسة الأحمر الداكن واضح. إذا كان هذا الحل هو عكر، يجب التخلص من الخليط. يتم تغليف الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل في احباط للحد من التعرض للضوء. تخزين خليط التفاعل في RT في حين أن العنصر الأخير، NBT، يتم إعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منفصل حل 5 ملي NBT بإضافة 0.4 مل اللامائية الفورماميد ثنائي ميثيل (DMF) و 0.4 مل الإيثانول اللامائي إلى 164 ملغ من NBT في أنبوب 2 مل مع غطاء O-الحلبة. إغلاق غطاء فضفاض (لا مغلقة بإحكام) وتقديم حل ليغلي قوية في حمام الزيت حتى NBT في الحل. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للNBT solubilized لتبرد إلى RT ثم قم بإضافة كل من الحل لخليط التفاعل أكتوبر ويهز بقوة للحصول على حل واضح. مراقبة تغير لون الحل من الأولي البرتقالي والأحمر إلى أحمر غامق أو purpلو اللون مع مرور الوقت. هذا امر طبيعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الخليط النهائي G6PD تلطيخ في 37 ° C غرفة دافئة لمدة 1 ساعة قبل الاستخدام. </li></ol> 2. علاج الحيوان والأنسجة مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج عمره 6 أسابيع C57BL / 6 الفئران الذكور مع DNA عامل ضار، على سبيل المثال، 10 ملغ / كغ azoxymethane (أوم) في حجم 200 ميكرولتر PBS عن طريق الحقن الملكية الفكرية. علاج السيطرة على الفئران مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق الحقن الملكية الفكرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 90 يوما، الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم كما وافقت عليها بروتوكول IACUC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جراحيا فتح تجويف البطن من أعلى بقليل من فتحة الشرج إلى قاعدة القص. تحريك الأمعاء الدقيقة من تجويف الجسم ولكن لا استئصال ذلك. استئصال الأمعاء السفلى أسفل الأعور إلى المستقيم. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة بعناية على طول جانب واحد من القولون باستخدام مقص تشريح الصغرى وإزالة البراز من القولون فتح طريق الغسيل مع برنامج تلفزيوني العقيمة نظيفة. لفة السويسرية المكوسد القولون مع الجانب اللمعية التي تواجه الخارج، ووضعه في قالب الأنسجة. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما تزج القولون في أكتوبر المتوسطة ومكان العفن في ديوار التي تحتوي على السائل N 2. عقد القالب بحيث قاعدة من البلاستيك ليست سوى في اتصال مع السائل N 2 حتى يتم تجميد المتوسطة أكتوبر الصلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين كتلة الأنسجة المجمدة في -80 حتى قطع الأجزاء المجمدة. لا تستخدم أي تثبيتي، الذي من شأنه أن يؤدي إلى تثبيط انزيم G6PD. </li></ol> 3. إعداد أقسام المجمدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أقسام الأنسجة المجمدة في سمك 7 ميكرون باستخدام ناظم البرد في -25 ° C. قطع 4 متتالية 7 ميكرون أقسام ووضع اثنان منهم على نفس الشريحة (الشكل 1). إعداد 2 الشرائح، أو أربع مرات متتالية 7 ميكرون أقسام لتمثيل مستوى واحد من القولون (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر المستوى التالي مع مسافة لا تقل عن&gt; 50 ميكرون من القسم الأخير من العلاقات العامةمستوى evious. ضمنت هذه المسافة التي الخبايا المقررة لكل مستوى لم يكرر بعضها البعض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمسح كثيرا النصل ناظم البرد مع الإيثانول بنسبة 100٪ لإزالة بقايا أكتوبر التي تتراكم خلال عدة قطاعات. قبل أن يتم استئناف باجتزاء، ومحو شفرة الجافة مع ورقة مجفف الاستاتيكيه لتبديد المتراكمة تهمة ثابتة. متجر الشرائح مع أقسام المجمدة في -80 درجة مئوية. </li></ol> 4. تلطيخ قسم الأنسجة المجمدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفذ رد فعل انزيم الكيمياء النسيجية في 37 ° C غرفة دافئة مع ارتفاع نسبة الرطوبة. ملاحظة: محاولة التفاعل الأنزيمي في فرن الحضانة أو على أكثر دفئا الشريحة أدت إلى الفقراء وغير متناسقة تلطيخ G6PD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء الآبار للتلوين الأنسجة باستخدام اثنين من 1.5 سم × غسالات الصلب 0.15 سم (الداخلية الارتفاع قطر ×) التي تم المستعبدين معا باستخدام السيليكون الشحوم (الشكل 1). قطع parafilm لتتناسب مع قاعدة من البئر مع مركز قطع والمكان جيداد على قسم الأنسجة على الشريحة. ملاحظة: parafilm على الجزء السفلي من غسالة يخلق ختم بين الشرائح والغسالة التي تحافظ على مزيج لزج G6PD تلطيخ على قسم الأنسجة. هذا بناء يعطي بشكل جيد مع 0.4 - حجم 0.5 مل بحيث يكون كل قسم الأنسجة في الدراسة يتلقى نفس الحجم من رد فعل G6PD خليط تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شرائح الأنسجة المجمدة عند 37 درجة مئوية في غرفة دافئة لمدة 10 دقيقة. في 37 ° C، إضافة G6PD تلطيخ خليط التفاعل إلى كل قسم الأنسجة بشكل جيد (2 أقسام لكل شريحة) لمدة 45-50 دقيقة. إزالة الشرائح من غرفة دافئة، ورفع بعناية الآبار الفولاذ المقاوم للصدأ من الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الشرائح على الحافة الطويلة للسماح وسط التفاعل لاستنزاف. مكان الشرائح في 100 ملي PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 30-60 دقيقة لإزالة G6PD تلطيخ خليط التفاعل من الأنسجة دون إزعاج تلطيخ الأنسجة. غمر الشرائح في الماء المقطر لمدة 5-10 دقائق لإزالة الأملاح PB </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الأنسجة عن طريق الإضافةجي الفلوري جل من قطارة على الأنسجة والانتظار ~ 30 دقيقة حتى يجف. تجنب الفقاعات التي يمكن أن يتغلب على تحديد الخبايا تحور. ملاحظة: إذا كان شكل فقاعات، ويمكن تكرار الإجراء بعد إزالة جل الفلوري عن طريق نقع في الماء المقطر. لا تستخدم زلات غطاء لأنها تميل إلى فقاعات الهواء الفخ. </li></ol> 5. تحديد G6PD المسخ الأقبية والطفرة التردد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الشرائح لG6PD الخبايا متحولة تحت المجهر الضوئي. ملاحظة: المعايير المستخدمة لتحديد سرداب متحولة تماما هي: (أ) كان سرداب كامل خال من اللون الأزرق. (ب) كان الهيكل الخارجي للسرداب سليمة، (ج) لوحظ سرداب متحولة على المتاخمة 7 ميكرون أقسام و، (د) كان اثنين من المراقبين لتحديد نفس سرداب كما متحولة. تحسب المسوخ لوحظ على المتاخمة 7 ميكرون أقسام كما متحولة واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة كل سرداب متحولة G6PD في التكبير 40X والتسويقي الصور باستخدام كاميرا 5.0 megapixel معبرامج التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العدد الإجمالي للالخبايا درست في الماوس عن طريق اختيار القسم تمثيلي لكل الماوس من مستوى مع مساحة أصغر وصورة ذلك في التكبير 10x (الشكل 1C). ملاحظة: مستوى يمثل أربع مرات متتالية 7 ميكرون أقسام (1D الشكل)، والتي بسبب قربها غالبا ما تظهر تحور الخبايا على أكثر من مقطع واحد. يتم فصل المستويات&gt; 50 ميكرون لتصور الخبايا من مناطق مختلفة من القولون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح كل ملف صورة والاعتماد بصريا عدد من الخبايا على مستوى عن طريق تحليل الملفات (كما هو موضح في الشكل صناديق 1C). سوف تختلف ملفات الصور في عدد من الأقبية لوحظ من ما يصل الى 20 ل&gt; 300 الخبايا في ملف واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضاعفة العدد الإجمالي للالخبايا من مستوى (الشكل 1C) المحدد لكل فأر من قبل عدد من المستويات فرزهم عن الخبايا G6PD متحولة لكل القولون. على سبيل المثال، العدد الإجمالي لل1250 الخبايا في المستوى المختار مضروبا 8 مستويات فحص لالخبايا متحولة تساوي العد الكلي 10،000 الخبايا. تقييم ما لا يقل عن 10،000 الخبايا لكل القولون للتحليل الإحصائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين عدد من المسوخ التي لوحظت في كل من الحيوانات من قبل عدد من الخبايا فحص لحساب MF لكل معاملة. مستوى MF الخلايا الجذعية الخلفية في الفئران غير المعالجة هو &lt;0.1x10 -4 (الجدول 1)، وهي قريبة لتلك التي ذكرت سابقا في C57BL / 6 الفئران. 11 </li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li><li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells.">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

غالبا ما يتم تحديد تأثير السمية للمركب بقدرته على تعديل الحمض النووي. ويتم ذلك عادة من خلال عزل الأنسجة وقياس مستوى عالمي من الحمض النووي adducts. لAOM، وهذا ينطوي على قياس O 6 -methylguanine adducts في القولون. باستخدام هذه المعلومات النهج على الضرر في غضون أنواع معينة من الخلا...

ويعتقد أن سرطان القولون لإشراك التعرض للعوامل البيئية والمكونات الغذائية التي يمكن أن تضر الحمض النووي وإنتاج تفعيل الطفرات الجسدية في الجينات المسرطنة (مثل ß-catenin) أو تعطيل الطفرات في جينات الورم القامع (على سبيل المثال، APC). ومن المفترض أن هذه الطفرات الهامة تحدث في الخلايا الجذعية القولون. بسبب بنية فريدة من سرداب ظهارة القولون، فمن الممكن لقياس الطفرات الخلايا الجذعية في القولون بعد تعريض الحيوانات للمواد الكيميائية المرتبطة القولون التسرطن. كما أن الكثير من الانزيمات المرتبطة X بمثابة مؤشرات لالطفرات التي تحدث في الخلايا الجذعية، حيث أن الطفرات سوف تكون موجودة في جميع الخلايا داخل سرداب. سابقا، وقد نشرت إجراء يدل على أن المواد الكيميائية التي تحفز على أورام القولون في الفئران ولدت أيضا جسدية الطفرات الخلايا الجذعية في القولون عن طريق تحليل الطفرات في نسبة الجلوكوز 6 فوسفات نازعة المرتبطة X (G6PD) الجين 1-3طريقة الكمي حدوث الطفرات الجسدية العشوائية في الخلايا الجذعية القولون دون أي ضغط الاختيار. الإجراء ينطوي على إنتاج غير المثبتة أقسام القولون المجمدة من الفئران التي عولجت والسيطرة والتعرف على الخبايا خالية من الخلايا التي تنتج النشاط G6PD وظيفية. هذه الخبايا تحور، والتي تظهر أبيض، تشير إلى أن التحور حدث في الخلايا الجذعية التي أدت إلى النسل أيضا بإيواء جين G6PD تحور. في فحص الأنزيمية، ويمكن G6PD الخبايا متحولة ناقصة لا أكسدة الجلوكوز 6 فوسفات، وهو مطلوب للحد من نتروبلو الأزرق نيترو (NBT). عندما انزيم G6PD هو وظيفي، ويتم تقليل NBT في خليط تلطيخ لformazan غير قابلة للذوبان والرواسب، وتراكم في موقع الإنزيم و &quot;تلطيخ&quot; الخلايا الزرقاء. الخلايا التي هي المسوخ G6PD تبقى بيضاء على النقيض من الأزرق الملون الخبايا نوع البرية. يقيس هذا الأسلوب الطفرات التي لديها &quot;لاغيا&quot; النمط الظاهري. لأن ENإنزيمات، مثل G6PD، يمكن نزع فتيل خارج الخلايا على قسم الأنسجة غير المثبتة إذا وضعت المقاطع في محلول مائي، فمن الضروري لتحقيق الاستقرار في الانزيم في أقسام الأنسجة لتحليلها. 4 إن استقرار الانزيم في الأنسجة يجب ألا تتداخل مع انتشار جزيئات صغيرة كاشف اللازمة للتفاعل G6PD الأنزيمية. لقد قدمت عددا من التغييرات الهامة لإجراء الأصلي. تم تغيير وسيلة لتلطيخ الأنزيمية حاسم من البولي فينيل الكحول لالأمثل قطع درجة الحرارة مجمع (أكتوبر)، مما يسهل السيطرة درجة الحموضة والإذابة من المكونات المستخدمة في الفحص. يتم تنفيذ تلطيخ باستخدام 0،4-0،5 مل الآبار مصنوعة من الفولاذ المقاوم للغسالات بحيث حصل كل قسم الأنسجة نفس الحجم من خليط التفاعل G6PD. وقد تم وضع إجراءات لتقدير عدد من الخبايا في قسم تصوير توفر عينة كبيرة من انسجة القولون دون الحاجةالعد يدويا&gt; 10 5 الخبايا لكل القولون. تحليل المجاورة 7 ميكرون أقسام الأنسجة يتيح التصور من سرداب متحولة على أكثر من شريحة واحدة، مما يقلل من التحف تلطيخ المحتملة. هذه التغييرات تجعل الإجراء أكثر كفاءة واستنساخه. باستخدام هذا البروتوكول المعدل، لقد كميا وتيرة الطفرة في الخلايا الجذعية القولون بعد تعرض C57BL / 6 الفئران لazoxymethane، وهي مادة مسرطنة القولون المعروفة في القوارض. 5-7

<table><tbody><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nitroblue tetrazolium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glucose-6-phosphate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimethyl formamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffer (pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>warm room&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of  colonic stem cell mutations

القدرة على قياس الطفرات الخلايا الجذعية هي أداة قوية لتحديد في عدد السكان خلية بالغ الأهمية إذا، وإلى أي مدى، يمكن أن مادة كيميائية تحفز الطفرات التي تؤدي المحتمل إلى السرطان. استخدام لفحص الأنزيمية لتحديد الطفرات الخلايا الجذعية في العاشر مرتبطة نازعة الجلوكوز 6 فوسفات الجينات ذكرت سابقا. 1 هذا الأسلوب يتطلب إعداد أقسام المجمدة وحضانة الأنسجة مقطوع مع خليط التفاعل التي تعطي اللون الأزرق إذا كانت الخلايا تنتج وظيفية نازعة الجلوكوز 6 فوسفات (G6PD) الانزيم. إن لم يكن، والخلايا تظهر بيضاء. قمنا بتعديل خليط التفاعل باستخدام الأمثل مجمع قطع درجة الحرارة (أكتوبر) المتوسطة بدلا من البولي فينيل الكحول. هذا يسهل قياس درجة الحموضة، ويزيد من ذوبان المكونات تلطيخ G6PD ويحد من انتشار انزيم G6PD و. لإثبات أن طفرة حدثت في الخلايا الجذعية، يجب على سرداب كامل تفتقر G6PD الأنزيميةالنشاط. إلا إذا تؤوي الخلايا الجذعية طفرة G6PD المظهرية وجميع ذرية في سرداب تفتقر G6PD النشاط الأنزيمي. للتعرف على خبايا مع طفرة الخلايا الجذعية، وقطعت أربعة أقسام المجمدة المجاورة متتالية (مستوى) في 7 ميكرون سمك. هذا النهج جعل التخفيضات المجاورة يوفر التشكل التي سرداب وتحور بشكل كامل منذ وسيراعى في نفس سرداب تحور في الفروع المجاورة. وكانت الشرائح مع عينات الأنسجة التي كانت أكثر من 50 ميكرون وبصرف النظر مستعدة لتقييم ما مجموعه&gt; 10 4 الخبايا في الماوس. تردد طفرة هو عدد المرصودة تحور (أبيض) الخبايا ÷ من قبل عدد من النوع البري (الأزرق) الخبايا في مجموعة العلاج.

القدرة على قياس القولون الطفرات الخلايا الجذعية في الحيوانات يوفر طريقة فريدة من نوعها لربط الطفرات إلى تحريض السرطان. عادة، فمن المفترض أن الخطوة الحاسمة في التسرطن ينطوي على تفعيل الطفرات في الجينات المسرطنة و / أو تعطيل الطفرات في الجينات الكابتة للورم. نحن حقن C57...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations at JoVE.com

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

تقدير حجم الجذعية القولون الطفرات خلية

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Views.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Video: Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Cancer Research

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification1.
A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).
The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types2,3. However, no single &#x2018;marker&#x2019; has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. 
A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple 'markers'. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. 
In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response5, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody6. 
For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells7. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.

We described a procedure for the disaggregation of colorectal cancer (CRC) to produce viable single cells, which are then captured on customized antibody microarrays recognizing surface antigens (DotScan CRC microarray). Sub-populations of cells bound to the microarray can be profiled by fluorescence multiplexing using monoclonal antibodies tagged with fluorescent dyes.

القولون والمستقيم سطح الخلية السرطانية باستخدام بروتين التنميط ميكروأري جسم والمتعدد الإسفار

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Immunology and Infection

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

تقييم مخاطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم وانتشاره عن طريق الكشف عن سلامة الحمض النووي البراز

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the initiation of cancer stemness properties. Since gene expression in the formation of colorectal cancer-derived tumorspheres is unclear, it takes time to discover the mechanisms working on one gene at a time. This study demonstrates a method to quickly discover the driver genes involved in the survival of the colorectal cancer stem-like cells in vitro. Colorectal HT29 cancer cells that express the LGR5 when cultured as spheroids and accompany an increase CD133 stemness markers were selected and used in this study. The protocol presented is used to perform RNAseq with available bioinformatics to quickly uncover the overexpressed driver genes in the formation of colorectal HT29-derived stem-like tumorspheres. The methodology can quickly screen and discover potential driver genes in other disease models.

Presented here is a protocol to discover the overexpressed driver genes maintaining the established cancer stem-like cells derived from colorectal HT29 cells. RNAseq with available bioinformatics was performed to investigate and screen gene expression networks for elucidating a potential mechanism involved in the survival of targeted tumor cells.

اكتشاف جينات السائق في الخلايا القولونية HT29 المشتقة من السرطان الجذعية مثل الأورام

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

تحديد الطفرات الحمض النووي في الخلايا الجذعية المكونة للدم تنقية / السلف

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for tumor development, maintenance, and resistance to drugs. A better understanding of CSC properties for their specific targeting is, therefore, a pre-requisite for effective therapy. However, there is a paucity of suitable preclinical models for in-depth investigations. Although in vitro two-dimensional (2D) cancer cell lines provide valuable insights into tumor biology, they do not replicate the phenotypic and genetic tumor heterogeneity. In contrast, three-dimensional (3D) models address and reproduce near-physiological cancer complexity and cell heterogeneity. The aim of this work was to design a robust and reproducible 3D culture system to study CSC biology. The present methodology describes the development and optimization of conditions to generate 3D spheroids, which are homogenous in size, from Caco2 colon adenocarcinoma cells, a model that can be used for long-term culture. Importantly, within the spheroids, the cells which were organized around lumen-like structures, were characterized by differential cell proliferation patterns and by the presence of CSCs expressing a panel of markers. These results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this 3D approach to study cell heterogeneity and CSC biology, including the response to chemotherapy.

This protocol presents a novel, robust, and reproducible culture system to generate and grow three-dimensional spheroids from Caco2 colon adenocarcinoma cells. The results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this approach to study cancer stem cell biology, including the response to chemotherapy.

نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

تحليل آلافات المقارنة من خلال نهج التسلسل المستهدف

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Behavior

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

التنميط الجزيئي للالمكروية ورم الغازية في نموذج 3 الأبعاد للخلايا سرطان القولون والمستقيم و<em&gt; خارج الحي</em&gt; الخلايا الليفية

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Medicine

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other malignancies of the same tissue type, often in a nearby location. Such field defects have been indicated in colon cancer. The molecular abnormalities that are responsible for a field defect in the colon should be detectable at high frequency in the histologically normal tissue surrounding a colonic adenocarcinoma or surrounding an adenoma with advanced neoplasia (well on the way to a colon cancer), but at low frequency in the colonic mucosa from patients without colonic neoplasia.
Using immunohistochemistry, entire crypts within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas or advanced colonic neoplasias were found to be frequently reduced or absent in expression for two DNA repair proteins, Pms2 and/or ERCC1. Pms2 is a dual role protein, active in DNA mismatch repair as well as needed in apoptosis of cells with excess DNA damage. ERCC1 is active in DNA nucleotide excision repair. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 would create cells with both increased ability to survive (apoptosis resistance) and increased level of mutability. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 is likely an early step in progression to colon cancer.
DNA repair gene Ku86 (active in DNA non-homologous end joining) and Cytochrome c Oxidase Subunit I (involved in apoptosis) had each been reported to be decreased in expression in mucosal areas close to colon cancers. However, immunohistochemical evaluation of their levels of expression showed only low to modest frequencies of crypts to be deficient in their expression in a field defect surrounding colon cancer or surrounding advanced colonic neoplasia.
We show, here, our method of evaluation of crypts for expression of ERCC1, Pms2, Ku86 and CcOI. We show that frequency of entire crypts deficient for Pms2 and ERCC1 is often as great as 70% to 95% in 20 cm long areas surrounding a colonic neoplasia, while frequency of crypts deficient in Ku86 has a median value of 2% and frequency of crypts deficient in CcOI has a median value of 16% in these areas. The entire colon is 150 cm long (about 5 feet) and has about 10 million crypts in its mucosal layer. The defect in Pms2 and ERCC1 surrounding a colon cancer thus may include 1 million crypts. It is from a defective crypt that colon cancer arises.

Reduced/absent expression of Pms2 and/or ERCC1 in entire crypts is a frequent event within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas, likely the basis of a field defect with high mutability and progression to cancer. Deficiency in Ku86 or CcOI is much less frequent in these field defects.

نقص Pms2 ، ERCC1 ، Ku86 ، CcOI عيوب في الميدان خلال التقدم إلى سرطان القولون

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

Biology

MLH1 Gene Expression in Peripheral Blood in Colon Cancer Patients and Their Association with Colon Cancer

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops caused by nucleotide misincorporation. In the absence of MLH1 protein, the frequency of non-repaired mismatches increases, resulting in organ cancer. The current study sought to quantify MLH1 gene expression and its relationship with tumor invasion (T) and lymph node invasion (N) in blood samples from patients with colorectal cancer (CRC). Blood samples were obtained from 36 CRC patients. RNA was extracted, and cDNA was synthesized using a kit. The primers were built using the exon-exon junction approach, and MLH1 and &#946;-actin genes were tested 3x using real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR). Gene expression analysis software was used to analyze the data, and a t-test was used to examine the expression of MLH1 and its connection with T and N variables. In this study, 36 patients with colorectal cancer, including 15 (41.6%) women and 21 (58.4%) men, with a mean age of 57.35 &plusmn; 4.22 years and in the age range of 26-87 years, were included. The results showed that the ratio of MLH1 gene expression in patients decreased compared to that in healthy individuals, and the decrease in gene expression at different stages of the disease was significant. The results of this study showed that the reduction of MLH1 gene expression has an effective role in the development of CRC.

This study examines the association between MLH1 gene expression in peripheral blood and colon cancer, utilizing a case-control approach to compare expression levels in patients and matched healthy controls.

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops ...