تسمح هذه الطريقة بالكشف عن المريض المصاب بآفة الورم النيبلاستي لمستقيم القولون والمستقيم، من خلال نهج غير جراحي. على وجه الخصوص، يسمح هذا الاختبار، بالاشتراك مع الاختبارات المستخدمة حاليا في برنامج فحص سرطان القولون والمستقيم، للتنبؤ بشكل أفضل بوجود سرطان أو خطر أعلى من الآفات غير طبيعية. للبدء في هذا البروتوكول، الطرد المركزي aliquot من كل سيطرة إيجابية، DNAs القياسية، والحمض النووي في ارتفاع، في شكل جاف لمدة 10 ثوان على جهاز طرد مركزي صغير.
إعادة تعليق السيطرة الإيجابية مع 750 ميكرولترات من المياه. إعادة تعليق الحمض النووي في ارتفاع، وتستخدم كضوابط داخلية خارجية، لاختبار وجود مثبطات، مع 100 ميكرولترات من الماء. المنحنى القياسي، resuspend المعيار الجاف مع 100 ميكرولترات من الماء وجعل أربعة تخفيف 1:5 بدءا من حل الأسهم.
ثم، دوامة بعناية الكواشف لمدة 15 ثانية، والطرد المركزي في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 10 ثوان. للحصول على تجديد كامل، قم بتخزين الكواشف السائلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. لإعداد 1x ارتفاع في السيطرة على الحمض النووي، مزيج خمسة ميكرولترات من ارتفاع FL-الحمض النووي مع 45 ميكرولترات من الماء المعقم.
للعينات، مزيج 75 ميكرولترات من كل عينة مع 50 ميكرولترات من 1x ارتفاع في الحمض النووي، مما أسفر عن حجم إجمالي قدره 125 ميكرولترات. أولاً، افتح برنامج التشغيل qPCR. لإعداد اللوحة، قم بتعيين "نوع البئر" لجميع المناصب الثمانية في العمود الأول، كـ "قياسي".
تعيين نوع البئر لآبار A2 و B2 كما NTC. تعيين نوع البئر لعناصر التحكم الإيجابية، C2 و D2، كما غير معروف. وتعيين نوع البئر لجميع المواقف الأخرى كما غير معروف.
حدد جميع المناصب 96. إضافة الأصباغ، FAM و HEX وانقر على مزامنة لوحة. ثم قم بتعيين الملف التعريفي الحراري، كما هو مُقدم.
إعداد العدد المطلوب من 8-آبار شرائط تحتوي على خليط تضخيم كامل مسيل، مع التمهيديات محددة والتحقيقات التي تستهدف الحمض النووي البشري، والرقابة الداخلية. لجلب محتويات إلى الجزء السفلي من الأنابيب، والطرد المركزي شرائط لمدة 10 ثانية. إزالة بلطف الأختام من الشرائط، والتأكد من عدم فقدان أي بيليه.
ثم إضافة 25 ميكرولترات من المياه إلى آبار التحكم السلبية. 25 ميكرولترات من الحمض النووي عينة لتذوق الآبار و 25 ميكرولترات من الحمض النووي السيطرة الإيجابية لآبار التحكم الإيجابية. بالنسبة للمنحنى القياسي، أضف 25 ميكرولترات قياسية من 1 و2 و3 و4 في كل بئر مخصصة.
استخدم 8 شرائح مسطحة مسطحة للأغطية البصرية لإغلاق جميع الشرائط و الدوامة بعناية لبضع ثوان. الطرد المركزي شرائط لمدة 10 ثانية، وتحميلها في الصك، وبدء تشغيل. في نهاية الشوط، لFAM FL-DNA A وHX IC، حدد الأعمدة، A، C، E، وG.FOR FAM FL-DNA B و HEX IC، حدد الأعمدة، B، D، F، و H.for الكميات القياسية ابتداء من الكمية، تعيين 10 نانوغرام لكل رد فعل لآبار A1 و B1، واثنين من نانوغرام لكل رد فعل لC1 وD1، نقطة أربعة نانوجرام لكل رد فعل لE1 و F1 ، ونقطة الصفر ثمانية نانوغرام لكل رد فعل لG1 و H1. ثم، لكل من القنوات FAM و HEX تعيين قيم الفلوريسينسين عتبة إلى 150.
في المربع جدول النتائج، انقر فوق خيارات العمود، ثم حدد الكل، ثم حسناً، للحصول على النتائج في كل من القناتين مع قيمهما الخاصة بـ Cq و delta R، والتي يتم توفيرها بواسطة برنامج qPCR في الوقت الحقيقي. دلتا R آخر ما يقابل قيمة الفلوريسنس تطبيعها لدورة التضخيم الأخيرة. في المربع جدول النتائج، انقر بزر الماوس الأيمن على الجدول لفتح قائمة السياق.
انقر فوق إرسال إلى Excel لتصدير البيانات الأولية. ثم تحميل ملف إكسل على برنامج تحليل مخصص لحساب الآلي من FL-DNA كمية. من مزيج من iFOBT وFL-الحمض النووي تقدير القيم لكل مريض, خطر سرطان القولون والمستقيم.
تظهر منحنيات الفلوريسنس لعينة إيجابية مناسبة إشارة العينة على قناة HEX، وهي عنصر التحكم الداخلي، ضمن النطاق المقبول. إشارة إيجابية فوق العتبة على قناة FAM، مما يدل على تضخيم الجينات المستهدفة. تظهر منحنيات الفلوريسنس لعينة سلبية مناسبة إشارة العينة داخل النطاق المقبول على قناة HEX.
إشارة التحكم السلبية هي أقل من العتبة على قناة FAM. من ناحية أخرى، تظهر منحنيات عينة غير مناسبة إشارة العينة غير ضمن النطاق المقبول على قناة HEX. على الأرجح بسبب تثبيط محتمل.
لذلك، يجب تكرار هذه العينة، بدءاً من الاستخراج. يظهر جدول إخراج تحليل البرامج بيانات كل من Mix A و Mix B من حيث تركيز الحمض النووي الفلوري للحمض النووي لضوابط التفاعل ، والعينات السريرية ، وتشغيل نتائج مراقبة الجودة. عينة رقم أربعة ليس لديها أي نتائج لأنها لم تمر مراقبة الجودة.
يجب تكرارها وإعادة تحللها. يرجى توخي الحذر عند إعادة تعليق الحمض النووي لارتفاع في السيطرة على المنحنى القياسي. وعند توزيع DNAs مختلفة على شرائط 8-جيدا، وكذلك أثناء الكشف الجزيئي في قسم تحليل النتائج.
يجب أن يتم تنفيذ هذه الطريقة بالاشتراك مع اختبار iFOBT للسماح بإجراء تقييم أفضل للآفات القولونية القولونية ، يجب أن يتم ذلك مع نفس عينة البراز.
