وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة لمنح NS27501 DKOD. وقدمت دعما إضافيا لهذا العمل من خلال منحة لجامعة كاليفورنيا في ايرفين في دعم DKOD من خلال برنامج أستاذ HHMI.

الاستعدادات قبل يوم من زراعة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل تشريح محلول معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل DMEM معقمة والاحتفاظ بها في 10 مل aliquots في 4 أسابيع لمدة 2 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العقيمة DDM2 ملاحق وتجميد في 50 أو 100 aliquots ميكرولتر : 1 الشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل كونا / laminin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف coverslips. اختياري : قم CNBM العقيمة وتخزينها مجمدة لمدة تصل إلى 4 أشهر. </li></ol> في يوم من زراعة أولا تحضير محلول أنزيم (ES) في غطاء تدفق الصفحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 5 مل من تشريح الحل (DS) في أنبوب 15 مل الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 0،8 ملغ من سيستين - L في إيبندورف 0.6 مل وإضافة 150 ميكرولتر من DS. ماصة صعودا ونزولا حتى تختفي البلورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 مل من DS / DS سيستين إلى 5 مل وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 يو (وحدة) من غراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 7 مل من 0.1 OH نا N وتخلط جيدا. سيكون حل واضح في غضون 30 دقيقة. عندما يتم تنشيطها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل تصفية الانزيم مع 0.2 ملم تصفية المحاقن المعقمة إلى 1.5 مل المسمار سقف أنبوب microfuge غراء : هل ترغب في يو 50 س 5 مل. كل دفعة يختلف قليلا ، لذلك يجب حساب مقدار : 37.3 ملغ / مل و 28.3 U / ملغ 37.3 X 28.3 = 1055.59 يو / مل (1000 مل) 50 U = 47.4 مل </li></ol> II. جعل وسائل الاعلام DDM2 في يوم من زراعة : إضافة المكملات التالية لإجراء DDM2 إلى 10 مل من DMEM إضافة ملاحق ، وقبل زراعة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl ترانسفيرين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl بوتريسين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl السيلينيوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100μl البروجسترون </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50μl الأنسولين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10μl 20 Hydroxyecdysone </li></ol> ملاحظة : تحقق ما يكفي لجميع الثقافات DDM2 المخططة (كل الدماغ مطلي على ساترة واحد في الفردي 35 مم طبق بتري ، 1.5 مللي ثانية من وسائل الإعلام / ثقافة) الخطوة يمكن أن تكون من الثالث إلى السادس في المختبرات nonsterile القيام به ، وينبغي أن يكتمل في 45 دقيقة أو أقل. III. كوكتيل الشرانق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد 10-15 الشرانق من الجانبين من قارورة تشريح تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرانق في مكان غطاء جافة 35 مم طبق بتري. </li></ol> ملاحظة : نحن نستخدم العقل عموما من الشرانق ما بين 55-78 ساعة بعد تشكيل puparium (APF). يصعب قليلا إلى خارج تشريح الدماغ من الشرانق الاصغر منذ كبسولات رئيس تميل إلى الانهيار ، في حين أن المستوى العام للثمرة neurite أقل قليلا من أقدم الشرانق. في سلالة wildtype كانتون - S ، يتم التعرف على هذه المراحل من قبل عيون الصباغية التي البني الفاتح إلى الحمرة قليلا ، قليلا مع الصباغ في أماكن أخرى. رابعا. قطع الرأس تحت مجهر تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قطرتين من محلول معقم في تشريح غطاء صحن بيتري ، بجانب الشرانق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد بلطف خادرة واحدة مع غرامة ملقط في اليد اليسرى واستخدام حقنة قياس 27 إبرة تعلق على حقنة سم مكعب 1 في اليد اليمنى لإزالة إهاب في نهاية الأمامي للخادرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خادرة الضغط قليلا مع ملقط ورئيسا تبرز استخدام إبرة قياس 27 الى قطع العنق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع غيض من إبرة أو الملقط ، ونقل رأسه إلى قطرة من تشريح الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حتى يكون لديك رؤساء 10-15 في قطرة واحدة. </li></ol> خامسا إزالة المخ من الرأس تحت مجهر تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل ناحية عقد حقنة سم مكعب 1 مع إبرة قياس 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام هذه لموقف رئيس الطيران في قطرة من تشريح حل حتى خرطوم باتجاهك والسطح الظهري للرأس والشمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة اليسار في خرطوم لدبوس رئيس لأسفل واستعمال إبرة الحق في إجراء شق في العين اليمنى التي تذهب من بطني إلى السطح الظهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة بالقرب من حق اليسار في منطقة خرطوم ثم استخدام الإبرة اليسار إلى خفض بلطف إهاب على العين اليسرى ، مما دفع الدماغ تجاه فتحة في العين اليمنى. وينبغي أن الدماغ الخروج من فتحة على اليمين ، سليمة نسبيا ، وغالبا مع كل من لو البصريةبيز لا تزال تعلق وأحيانا مصطبغة نسيج العين أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع الدماغ على الجزء الخلفي من الإبرة ونقل إلى قطرة من المياه المالحة عقيمة في تشريح جديدة معقمة ، 35 طبق بيتري ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10-15 العقول لكل الوراثي. </li></ol> سادسا. إزالة الفص البصري والعلاج الانزيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل ناحية عقد حقنة سم مكعب 1 مع إبرة قياس 27 و استخدامها لجمع كل هذه العقول في منطقة واحدة صغيرة من قطرة من حل تشريح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المحاقن وأدوات القطع لإزالة الفص البصري في الدماغ من كل ذلك النسيج المتبقية للثقافة هي المنطقة المركزية في الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام pipetman 20 ميكرولتر ، التي حددت في 5 ميكرولتر ، لنقل كل العقول من النمط الجيني واحد لأنبوب إيبندورف تحتوي على 1 مل من محلول غراء العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدمغة المحتضنة في غراء لمدة 10-15 دقيقة على مجموعة المدورة في 60 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. </li></ol> معقمة داخل غطاء تدفق الصفحي -- ينبغي لجميع الخطوات التي تعرض الأنسجة للهواء ينبغي القيام به في التدفق الصفحي غطاء لتنفيذ الخطوات المتبقية. سابعا. غسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل ويحل محل الانزيم مع محلول معقم تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع محلول معقم تشريح ما مجموعه 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الملوحة تشريح واستبدالها مع DDM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي ، ويغسل ما مجموعه 2 مرات مع DDM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العقول وسائل الإعلام إلى العقيمة 35 مم طبق بتري. </li></ol> ثامنا. سحن والتصفيحات تشريح تحت المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 المكان المقدس من DDM2 في وسط ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 نقل الدماغ لهذا الانخفاض من DDM2 مع طرف الصفراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر ، واستخدام إبر عيار 27 إلى النرد يصل الدماغ الى قطع صغيرة (وينبغي أن تتخذ &lt;1 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت التوجيه البصري ، وكسر غيض من الزجاج الماصة التي تم سحبها إلى نقطة دقيقة بحيث يمكن أن تكون أكبر قطعة امتص برفق في غيض من الماصة وطرد مرة أخرى في المتوسط. نستخدم أنابيب شفط الفم القياسية التي تأتي مع 100 ميكرولتر الهيماتوكريت الزجاج الشعرية. ملاحظة : احرص على عدم الحصول على فقاعات في وسائل الإعلام ، وسوف تحتاج إلى تحديد تجريبيا الماصة أفضل حجم الاستخدام. الجيدة منها تسمح لك فصل المخ مع بعض الخلايا الفردية ومازال بعض كتل كبيرة ، في حوالي 30 ثانية / الدماغ. عندما تنظر إلى هذه في أعلى السلطة ، وينبغي أن حوالي 10-20 ٪ من الخلايا العصبية لا تزال بعض العمليات المتبقية ، وستظل هناك بعض كتل كبيرة. إذا كنت تنأى كثيرا ، وبعد ذلك سوف تكون جميع الخلايا المستديرة وسيكون لديهم الكثير لحقت بها أضرار أنهم لن يكتب له البقاء. هذه الخطوة تأخذ الممارسة ويجب أن يتم بسرعة لأن هناك عدد كبير السطحية إلى نسبة حجم ودرجة الحموضة والأسمولية من قطرة DDM2 يمكن أن تتغير بسرعة. الأنسجة يحتاج إلى أن يوضع في الحاضنة CO 2 في أسرع وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكتابة على الغطاء طبق بيتري : &quot;الوراثي ، والتاريخ والوقت&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري 35 ملم في طبق بتري مم 100 (مع kimwipe الرطب) والسماح للتسوية في الحاضنة CO 2 لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفيضانات الطبق 35 ملم مع 1.5 مل من DDM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الثقافات في الحاضنة في 5 ٪ CO 2 الحاضنة (23 درجة مئوية). ملاحظة : إذا لم يكن لديك الوصول إلى حاضنة CO 2 التبريد ، واستخدام معيار الثقافة أنسجة الثدييات الحاضنة وضعت إما في غرفة باردة والحرارة إلى 23 درجة مئوية ، أو وضعها في المختبر ، إيقاف مؤقت ، واستخدام الجليد في صينية في أسفل الحاضنة لتنظيم درجة الحرارة في جميع أنحاء الغرفة. </li></ol> تاسعا. تغذية الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 1 (اليوم التالي) ، إضافة 0.5 مل من CNBM/B27 (وسائل الإعلام مشروطة) لجعل 03:01 DDM2 : CNBM/B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 5 1 مل تحل محل وسائل الاعلام لل03:01 DDM2 : CNBM/B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع إبقاء خلايا التغذية 03:01 DDM2 : CNBM/B27 كل 4-5 أيام. ملاحظة : يمكن زراعتها دون الثقافات وسائل الإعلام غير مشروطة ولكن العصبية الخلايا العصبية يبدو قليلا أكثر هشاشة وأكثر صعوبة لاستخدامها في تجارب الكهربية. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1991).</li><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bases+of+behavioral+plasticity:+Establishing+and+Modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System.">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li><li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium.">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li><li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons.">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li><li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors.">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li><li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li><li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells.">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li><li>Oh, H. -. W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture.">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li></ol>

يمكن زراعة الخلايا العصبية التي تحصد من أدمغة الفئران الجنينية / ما بعد الولادة في الثقافة الخلية الأولية حيث تمتد neurites اتصالات وشكل متشابك وظيفية. هي راسخة طرق تحضير هذه الثقافات والدراسات في ثقافات القوارض العصبية لعبت دورا حاسما في تحديد الجينات والعوامل البيئية المتورطين ?...

Coverslips طلاء : ضع coverslips تعقيمها في طبق بتري 60 مم. الماصة 5 من المجاهدين الموالين مزيج Laminin / على مركز كل ساترة. مكان في الحاضنة لمدة 2 C 37 ساعة. شطف coverslips 3X مع 100 UL تعقيمها كل من المياه. استخدام الفراغ يعلق على الماصة باستور العقيمة. خلال مشاركة شطف ، التقط ساترة مع ملقط والجافة الجانبين. نقل ساترة لطبق بيتري 35mm. تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل الى شهر.

primary neuronal cultures from the brains of late stage drosophila pupae

في هذا الفيديو ، ونبدي استعدادا للثقافات العصبية الأولية من العقول في وقت متأخر من مرحلة الشرانق ذبابة الفاكهة. يبدأ الإجراء مع إزالة العقول من الحيوانات في 70-78 ساعة بعد تشكيل puparium. وأظهرت أدمغة معزولة بعد حضانة قصيرة في غراء تليها يغسل عدة في وسط النمو المصل الحرة. ويتضح من عملية التفكك الميكانيكي للدماغ في كل قطرة 5 المجاهدين من وسائل الإعلام على ساترة. وعلى المحاور sheered و dendrites من الخلايا العصبية في مرحلة ما بعد الإنقسامية قبالة قرب سوما خلال تفارق ولكن تبدأ الخلايا العصبية لتجديد العمليات في غضون ساعات قليلة من الطلاء. تظهر الصور الثقافات تعيش في 2 يوما. الخلايا العصبية مواصلة تطويرها العمليات خلال الأسبوع الأول في مجال الثقافة. يمكن التعرف على السكان العصبية المحددة في الثقافة GAL4 باستخدام خطوط لمحرك التعبير أنسجة معينة من علامات الفلورسنت مثل GFP أو طلب تقديم العروض. وقد أظهرت التسجيلات خلية كاملة من الخلايا العصبية مثقف شكل وظيفي ونشطة بشكل تلقائي والمشابك كوليني GABAergic. قطعة شريط فيديو قصير يوضح ديناميات الكالسيوم في الخلايا العصبية مثقف باستخدام Fura - 2 باعتبارها الكالسيوم صبغ المؤشر لمراقبة العابرين الكالسيوم عفوية والنيكوتين أثار ردود الكالسيوم في طبق من الخلايا العصبية مثقف. هذه الثقافات الدماغ العذراء هي نظام نموذجا مفيدا يمكن من خلالها استخدام أدوات والدوائية الجينية لتحديد العوامل الجوهرية التي تؤثر على وخارجي تشكيل وظيفة نقاط الاشتباك العصبي المركزي.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae at JoVE.com

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من العقول في وقت متأخر من مرحلة الشرانق ذبابة الفاكهة. آراء الثقافات الحية تظهر ثمرة neurite والتصوير باستخدام مستويات الكالسيوم Fura - 2.

متعلق بالخلايا العصبية الثقافات الأساسي من الأمخاخ في وقت متأخر من المرحلة ذبابة الفاكهة شرانق

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

primary-neuronal-cultures-from-brains-late-stage-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  University of California, Irvine (UCI). هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من العقول في وقت متأخر من مرحلة الشرانق ذبابة الفاكهة. آراء الثقافات الحية تظهر ثمرة neurite والتصوير باستخدام مستويات الكالسيوم Fura - 2.

Video: Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

الخلية العصبية من الثقافات Aplysia عن التصوير عالية الدقة من المخاريط النمو

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

إعداد Aplysia الحسية والحركية الثقافات الخلية متعلق بالخلايا العصبية

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

إعداد وتطوير الكبار ذبابة الفاكهة الأمخاخ والشبكية للتصوير لايف

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

الأداة المساعدة لمرحلة محددة في منتصف إلى أواخر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; جريب عزل

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...